Artikkel
Metylenblått som anaerob- og oksygenindikator: hva fargeendringen beviser
En tekniker forsegler en anaerobkrukke, kontrollerer indikatorstrimmelen med metylenblått gjennom lokket og ser det hun ønsker å se. Strimmelen har gått fra blå til hvit. Hun registrerer forsøket som anaerobt og går videre. To dager senere viser én skål ingen vekst, mens et forseglet buljongrør i den samme krukken viser tegn til oksygeneksponering. Strimmelen fortalte sannheten. Hun stilte den feil spørsmål.
Forvirringen skyldes en sammenblanding av begreper. En anaerobindikator med metylenblått handler om redoks, ikke om sterilitet eller validering av hele systemet. Når dette skillet er klart, blir strimmelen et presist og pålitelig instrument med en avgrenset oppgave.
Prinsippet: et reversibelt redokspar
Oppløst metylenblått finnes i to former. Den oksiderte formen er det velkjente blå kationet. Den reduserte formen, kalt leukometylenblått, er fargeløs. Ved tilnærmet nøytral pH består den forenklede halvreaksjonen av ett blått kation pluss ett proton pluss to elektroner, som gir ett fargeløst leukomolekyl. Det formelle potensialet ligger nær pluss 11 millivolt mot standard hydrogenelektrode ved pH 7. Det plasserer det i et område mange reduserende systemer kan nå, og der oksygen kan reversere reaksjonen.
Reduksjon krever et lavt lokalt redokspotensial. Å fjerne oksygen alene er ikke alltid nok. Tidlige studier av anaerobe forhold viste at metylenblått i rent, oksygenfritt vann beholdt fargen med mindre et reduserende stoff var til stede. Blandinger av dekstrosebuljong med omtrent 0.01 prosent fargestoff ble lett avfarget ved 37 C, mens den samme blandingen holdt ved 4 C forble blå i et døgn, som rapportert i forsøk med ferskt vev og anaerobe dyrkingsforhold. Temperatur, pH, glukose, askorbat, tioglykolat og mikrobiell reduserende aktivitet avgjør alle om elektronene er tilgjengelige.
Reoksidasjon krever bare oksygen. Når luft når leukoformen, omdannes den tilbake til blått. Moderne, spesialutviklede indikatorer utnytter nettopp denne syklusen: fargestoff pluss reduksjonsmiddel pluss en stabiliserende matriks, fargeløst ved lavt oksygennivå og blått igjen ved eksponering for luft. Dette er demonstrert i en hybrid oksygenindikator med metylenblått basert på fargestoff, reduksjonsmiddel, overflateaktivt stoff og leire. Prototypen brukte 0.01 millimolar fargestoff med 2.0 millimolar askorbat eller glukose ved pH 11, ble fargeløs nær 0.5 volumprosent oksygen og skilte mellom under 0.1 prosent og over 0.5 prosent oksygen i testkammeret.
Det praktiske prinsippet er altså enkelt. Blått betyr at indikatorsonen er oksidert. Fargeløst betyr at indikatorsonen har nådd reduserende forhold med lite oksygen. Endringen er reversibel, lokal og kjemisk. I seg selv sier den ingenting om mikrober.
Slik fungerer en indikatorstrimmel med metylenblått i en anaerobkrukke
En indikatorstrimmel med metylenblått for en anaerobkrukke er en liten reaksjonssone plassert i krukkens atmosfære, der den kan sees uten at beholderen åpnes. Kommersielle utførelser varierer: papirstrimler, tabletter som løses opp eller fuktes ved oppsett, og nyere hybridpapirer. Noen krever én dråpe destillert vann for å aktivere reaksjonssonen. Andre er tørre indikatorer som må holdes tørre. Bruksanvisningen for det aktuelle produktet er avgjørende, fordi fukting, plassering og avlesningstid inngår i kjemien.
Den tiltenkte avlesningen er i praksis binær. Blått betyr at oksygen eller utilstrekkelig reduserende forhold fortsatt finnes ved strimmelen. Hvitt eller fargeløst betyr at anaerobe redoksforhold er etablert ved strimmelen. Enkelte kommersielle papirindikatorer har et rødt bakgrunnspigment, slik at det reduserte endepunktet fremstår rosa i stedet for hvitt. Vit hvilket endepunkt produktet ditt skal gi før du vurderer det.
Tidsforløpet varierer mellom systemer. I ett oppsett av GasPak-typen begynte fargen å blekne innen omtrent en time og var borte innen noen få timer, mens metylenblått krevde mer enn seks timer i en kontrollert sammenligning ved romtemperatur. I den studien nådde medienes redokspotensial omtrent minus 100 millivolt innen 60 til 100 minutter, lenge før fargestoffet hadde fullført endringen, og lå godt under minus 200 millivolt da strimmelen ble helt fargeløs. Indikatoren reagerer senere enn atmosfæren endres. En blå strimmel etter én time beviser ikke at forsøket har mislyktes, og en hvit strimmel etter seks timer beskriver strimmelen på det tidspunktet.
Plasseringen er viktig av samme grunn. Hold strimmelen i gassrommet, synlig gjennom lokket, borte fra agaroverflater og dyrkingsmedier. Den viser forholdene i sine umiddelbare omgivelser. Legger du den flatt mot en kald vegg, gjemmer den under skåler eller lar kondens gjennomvæte den, viser den dette mikromiljøet i stedet for forholdene i krukken.
Hva strimmelen viser, og hva den ikke viser
Tenk på metylenblåttindikatoren i anaerobkrukken som én sensor på ett sted. Den fastslår lokale redoks- og oksygenforhold i sin egen reaksjonssone. Disse er i hovedsak representative for gassrommet hvis blanding og utjevning er tilstrekkelig. Alt utover dette er slutninger, og slutninger krever separat dokumentasjon.
En fargeløs strimmel fastslår ikke sterilitet. Sterilitet er fravær av levedyktige organismer, dokumentert gjennom validert sterilisering og valideringskontroller for dyrking. En krukke kan være fullstendig anaerob og likevel kontaminert, eller fullstendig steril og likevel aerob.
Den validerer ikke alle deler av dyrkingssystemet. Oppløst oksygen inne i et forseglet rør, oksygen fanget dypt i agar, gradienter i en tettpakket krukke og en lekkasje som oppstår etter avlesningen, fanges ikke opp av én strimmel. Forsøk med romlig fordeling viste blå og fargeløse soner ved siden av hverandre i samme beholder, der oksygeninntrengning og reduserende aktivitet hadde ulik balanse. Ett punkt kan ikke bekrefte forholdene i et helt volum.
Den beviser ikke at anaerobe forhold har vært opprettholdt uavbrutt. En strimmel som leses av én gang ved oppsett, sier ingenting om forholdene etter tjue timer. Nyere kvalitetsarbeid innen anaerob dyrking advarer om at kjemiske indikatorer beskriver atmosfæren i avlesningsøyeblikket og kan se tilfredsstillende ut selv om små mengder restoksygen finnes. Det er kontinuerlig dokumentasjon eller dokumentasjon ved kontrollpunkter, ikke ett enkelt blikk på endepunktet, som knytter strimmelen til inkubasjonen.
For mer om kjemien bak fargeendringen, se hvordan metylenblått veksler mellom oksidert og redusert form. For et bredere perspektiv på hvordan oksygen påvirker prøvehåndtering, se oksygenkontroll i mikroskopi- og dyrkingsarbeid.
Et diagram å ha ved siden av krukken
Figuren nedenfor samler artikkelens innhold i én referanse til bruk ved laboratoriebenken. Tre tilstander for samme strimmel, reaksjonens to retninger og grensen mellom det indikatoren dokumenterer og validering av systemet.
| Observasjon | Berettiget tolkning | Nødvendig neste steg |
|---|---|---|
| Strimmelen er blå etter tiden angitt for produktet | Anaerobe forhold er ikke bekreftet ved strimmelen | Kontroller tetning, posens aktivering og kapasitet, eventuell katalysator, strimmelens fukting og utløpsdato; ikke tolk dyrkingene ennå |
| Strimmelen blekner over flere timer og forblir deretter fargeløs | Reduserende forhold er etablert ved strimmelen på det tidspunktet | Registrer tid og farge; oppretthold kontrollpunkter under inkubasjonen |
| Strimmelen er fargeløs før åpning, blå etter åpning | Forventet reoksidasjon ved eksponering for luft | Bruk avlesningen før åpning som endepunkt; ikke underkjenn forsøket i ettertid |
| Strimmelen er fargeløs, men et rør ser oksidert ut | Kun lokal avlesning | Vurder røret ut fra egne observasjoner; kontroller gradienter, oppløst oksygen og fylling av krukken |
| Enhver strimmelfarge med eller uten vekst | Ingen konklusjon om sterilitet eller levedyktighet | Bruk separate kontroller for sterilitet og levedyktighet |
Feil som holder strimmelen blå eller gir falsk trygghet
De fleste feil faller i fem grupper. Hver har et karakteristisk mønster.
En lekk krukke eller pose tilfører stadig oksygen til reaksjonssonen. Strimmelen forblir blå eller blir blå igjen etter å ha bleknet. Kontroller lokk, pakning, klemmer og tetningsflater før du legger skylden på kjemien.
En oppbrukt eller feilaktivert gassgenerator fjerner aldri oksygenet. I eldre vannaktiverte systemer var manglende kondens etter omtrent 10 til 15 minutter og manglende oppvarming av lokket etter omtrent 20 til 40 minutter tidlige varsler for det aktuelle systemet. En gassgeneratorpose med for liten kapasitet i en overfylt krukke svikter på samme måte.
En forgiftet katalysator er bare relevant for eldre systemer med hydrogen og palladium, der palladium får hydrogen og oksygen til å reagere og danne vann. Fuktighet og hydrogensulfid svekker den. Mange av dagens gassgeneratorposer bruker ikke palladium i det hele tatt, så ikke bruk dette tiltaket der det ikke hører hjemme.
En nedbrutt eller feilbehandlet strimmel kan svikte uten tydelige tegn. Fargestoff og reduksjonsmiddel mister reversibilitet under lagring. Det er en av grunnene til at hybridformuleringer ble utviklet for å motstå lysindusert bleking og tap av funksjon under lagring. Kasser utgåtte produkter, produkter med unormal startfarge og strimler som er fuktet når de skal være tørre, eller holdt tørre når de krever fukting.
En gradient eller tidsforsinkelse villeder den som leser av, snarere enn å forstyrre kjemien. Dårlig blandet gassrom, forseglede rør med oppløst oksygen og halvfaste medier beholder hver sine forhold lenger enn strimmelen antyder. Resazurinstrimler går via rosa til fargeløst og markedsføres ofte som raskere, men tersklene gjelder deres egen formulering og kan ikke overføres til metylenblått.
Kontroller og en avlesningsprotokoll det er verdt å kopiere
To rimelige kontroller fanger opp de fleste feiltolkninger. Ha en fersk kontrollstrimmel i romluft ved siden av forsøket. En fungerende metylenblåttstrimmel forblir blå der. Noen pakkede indikatorer er bleke i utgangspunktet og blir blå ved åpning, noe som i seg selv er en funksjonskontroll. Plasser også jevnlig en fersk strimmel i et tidligere validert anaerobt oppsett. Den skal nå det validerte reduserte endepunktet innen tiden angitt for produktet. Hvis noen av kontrollene ikke oppfører seg som forventet, bytt parti før du stoler på avlesninger fra krukken.
Avlesningsprotokollen følger av mekanismen. Plasser strimmelen i gassrommet der den kan sees uten å åpne krukken, og følg produktets bruksanvisning for veggkontakt og fukting. Registrer startfargen, tidspunktet da krukken ble forseglet, og fargen ved kontrollpunktet angitt for produktet. Der beholderen tillater det, registrer at indikatoren fortsatt var redusert ved definerte kontrollpunkter under inkubasjonen. Registrer sluttfargen umiddelbart før åpning. Fargen før åpning er endepunktet for det forsøket. Etter åpning må du forvente at strimmelen blir blå igjen, og ikke la dette endre tolkningen av det som allerede er registrert.
Hvis strimmelen fortsatt er blå etter den angitte tiden, må anaerobe forhold regnes som ubekreftet. Gå gjennom kjeden i rekkefølge: tetning, gassgeneratorpose, eventuell katalysator, indikatorens fukting og utløpsdato, deretter indikatorens funksjon sammenlignet med luftkontrollen. Først når atmosfæren er bekreftet, bør vekst eller fravær av vekst tolkes, med et anaerobt dyrkingsoppsett og organismekontroller tilpasset bruksområdet.
Strimmelen fortjener det siste ordet innenfor sitt eget område. Blå eller fargeløs svarer den på ett spørsmål om ett sted på ett tidspunkt. Still den dette spørsmålet til fastsatt tid, med kontroller ved siden av, så svarer den pålitelig. Spør den om sterilitet, om hvert enkelt rør eller om hele inkubasjonen ut fra ett blikk, og ingen indikatorkjemi kan redde tolkningen.