Metylenblått, Nrf2 og mitokondriell biogenese: hva som ble målt, og hva som fortsatt er foreslått

Én setning dukker ofte opp i tekster om metylenblått: Det aktiverer Nrf2 og bygger nye mitokondrier. Setningen fremstår som én påstand, men inneholder to ulike begreper, undersøkt i ulike systemer og med ulike typer evidens. Det første er en signalvei, en sensor som slår på forsvarsgener. Det andre er et byggeprogram, der en celle lager mer mitokondrielt maskineri. Et signal kan utløse bygging, men å vise at signalet ble utløst, er ikke det samme som å vise at bygningen ble reist. Og å vise mer byggemateriale er ikke det samme som å vise en bedre strømforsyning. Denne artikkelen holder disse tre tingene atskilt.

Nrf2-begrepet: en sensor, ikke et skjold

Nrf2 (nukleær faktor erytroid 2-relatert faktor 2) er en transkripsjonsfaktor, et protein som har til oppgave å slå på gener. Under hvilebetingelser holdes det i cytoplasmaet av et sensorprotein kalt Keap1, som overleverer det til cellens avfallsmaskineri for kontinuerlig nedbrytning. Når oksidanter eller elektrofiler modifiserer reaktive cysteiner på Keap1, stopper nedbrytningen. Nydannet Nrf2 hoper seg opp, beveger seg inn i cellekjernen, danner par med små Maf-proteiner og binder seg til DNA-sekvenser kalt antioksidantresponselementer. Denne bindingen slår på en rekke forsvarsgener.

De kanoniske måleparameterne for denne signalveien er spesifikke. NQO1 (NAD(P)H-kinondehydrogenase 1) og TrxR1 (tioredoksinreduktase 1) er blant de mest pålitelige målgenene for Nrf2. HO-1 (hemoksygenase-1) kan induseres kraftig, men reagerer også på andre regulatorer. Enzymer som SOD og katalase inngår i antioksidantmaskineriet, men nivåene deres styres av mange transkripsjonsfaktorer. En økning i SOD beviser derfor ikke i seg selv at Nrf2 var årsaken. Evidensen som ligger nærmest selve signalhendelsen, er opphopning av Nrf2 i cellekjernen, aktivering av en ARE-reporter eller induksjon av kanoniske målgener som forsvinner når Nrf2 fjernes. Alt annet – lavere oksidantnivåer, bedre overlevelse under stress og mer glutation – er nedstrømseffekter som mange signalveier kan frembringe.

Det tidligste resultatet med metylenblått i denne historien ligger nær den direkte enden av denne skalaen. Fibroblaster eksponert for metylenblått i nanomolare konsentrasjoner viste forsinket senescens sammen med høyere innhold av kompleks IV, høyere oksygenforbruk og induksjon av fase-2-enzymene TrxR1 og NQO1, som rapportert i studien som først knyttet metylenblått til forbedret mitokondriefunksjon og forsinket senescens. TrxR1 og NQO1 er nettopp de kanoniske Nrf2-målgenene en oppmerksom leser ønsker å se. Det studien ikke viste, var selve signalhendelsen: ingen måling av Nrf2 i cellekjernen, ingen ARE-reporter og ingen kontroll med Nrf2 slått ut. En redelig tolkning er derfor at metylenblått induserer kjente Nrf2-målgener i dette systemet. Det er forenlig med Nrf2-aktivering, men isolerer ikke Nrf2 som årsaken. Induksjon av et målgen ligger ett trinn nedstrøms for bryteren.

Biogenese-begrepet: et program med tre kontrollpunkter

Mitokondriell biogenese er programmet som gjør at en celle bygger opp mer mitokondriell kapasitet. Hierarkiet, slik det beskrives i lærebøkene, går gjennom tre kontrollpunkter. Først slår koaktivatoren PGC-1alpha på programmet. Deretter driver nukleære transkripsjonsfaktorer uttrykket av mitokondrielle gener, inkludert TFAM, som vedlikeholder og replikerer mitokondrielt DNA. Forvirrende nok heter en av disse faktorene NRF1, nukleær respirasjonsfaktor 1, som er et annet protein enn Nrf2. Til slutt har cellen flere mitokondrielle genomer og mer respirasjonsmaskineri, målbart som antall mtDNA-kopier, sitratsyntaseaktivitet eller mengde og aktivitet av respirasjonskomplekser.

Hvert kontrollpunkt gir grunnlag for en svakere eller sterkere påstand enn det forrige. Mer budbringer-RNA for PGC-1alpha eller TFAM viser at programmet ble bestilt, ikke at det ble fullført. Mer mtDNA eller mer kompleks IV-protein viser mer materiale, men ombygde mitokondrier kan gi samme bilde. Bedre respirasjon, høyere oksygenforbruk eller økt kompleksaktivitet viser at funksjonen er endret, men funksjonen kan forbedres uten at det dannes nye mitokondrier i det hele tatt. En sterk påstand om biogenese kombinerer alle tre: regulator, innhold og funksjon.

Oppfølgingsstudien på fibroblaster undersøkte det meste av denne kjeden. I humane IMR90-celler behandlet med 100 nanomolar metylenblått steg forholdet mellom NAD og NADH forbigående innen 15 minutter og vendte tilbake til utgangsnivået innen ett døgn. Dette forbigående energisignalet ble etterfulgt av forbigående fosforylering av energisensoren AMPK, deretter induksjon av PGC-1alpha og SURF1, et protein som er nødvendig for å sette sammen fungerende kompleks IV. Aktiviteten til kompleks IV ble omtrent doblet, oksidantnivået i cellene falt med rundt 28 prosent, og telomerene ble forkortet langsommere. Hele sekvensen beskrives i artikkelen som knytter metylenblåtts redoksaktivitet til AMPK og mitokondriell biogenese.

To detaljer i denne artikkelen fortjener oppmerksomhet fordi de er av typen som ofte blir utelatt. For det første var mønsteret viktigere enn tilstedeværelsen: Metylenblått slo på AMPK forbigående, mens referanselegemidlet AICAR slo det på vedvarende, og den forbigående aktivatoren forsinket senescens omtrent åtte ganger mer effektivt. En påstand som «metylenblått aktiverer AMPK» er derfor ufullstendig. Den relevante påstanden er at det aktiverer AMPK forbigående, og sammenligningen antyder at vedvarende aktivering ikke gjør det samme. For det andre endret ikke metylenblått cellesyklusen. Det utelukker den mest trivielle alternative forklaringen: at cellene ganske enkelt delte seg langsommere og derfor så yngre ut.

Museforsøkene: atferd, genomer og en bevisst paradoksal utløser

Arbeidet med cellekulturer ble videreført til dyr av en gruppe som studerte middelaldrende mus. Etter 60 dager med oralt metylenblått beholdt de behandlede musene mer av sin fysiske utholdenhet og utforskende atferd og viste mindre angstlignende atferd enn ubehandlede eldre mus. I hjernevev ble uttrykket av gener som aldringen hadde dempet – NRF1, TFAM, SOD2 og kompleks IV-underenheten COX1 – gjenopprettet mot nivåene hos voksne dyr, og antallet mtDNA-kopier steg. Disse resultatene, som omfatter atferd, regulatorer og mengden genomer, rapporteres i studien av metylenblått og mitokondriell biogenese i hjernen hos middelaldrende mus.

Den foreslåtte utløseren er den interessante delen, fordi den strider mot den enkle fortellingen om at metylenblått er en antioksidant. De behandlede musene viste økt dannelse av reaktive oksygenforbindelser i hjernens mitokondrier, nærmere bestemt hydrogenperoksid. Forfatternes forslag er at et mildt peroksidsignal aktiverer Nrf2-signalveien, som deretter driver biogeneseprogrammet. I denne modellen er metylenblått en prooksidant i det utløsende trinnet og en antioksidant i resultatfasen. Farmakologer kaller dette mønsteret hormese: En liten belastning fremkaller et forsvar som er større enn belastningen selv. Om denne peroksidøkningen faktisk forårsaker Nrf2-aktivering, ble ikke testet direkte. Den er den foreslåtte broen, ikke en målt forbindelse.

En ledsagende studie fra samme gruppe satte sikkerhetssiden av dette forslaget på prøve. I isolerte hjernemitokondrier økte metylenblått produksjonen av hydrogenperoksid ved konsentrasjoner helt ned til 50 nanomolar, men terapeutiske konsentrasjoner ga ingen påvisbar skade på mitokondrielt DNA. Først ved 100 micromolar, langt over terapeutiske nivåer, viste utvalgte mtDNA-fragmenter skade. Kombinasjonen av 20 micromolar fargestoff med rødt lys produserte singletoksygen som skadet mtDNA i stort omfang. Dette er fargestoffets kjente virkning som fotosensibilisator, ikke dets farmakologi i mørke. Forbehandling beskyttet til og med mitokondrier fra den ventrale midthjernen mot rotenoninduserte mtDNA-skader. Doseresponsen og kontrollene for gentoksisitet er beskrevet i studien av metylenblåtts ikke-gentoksiske peroksidproduksjon.

Målt versus foreslått: slik leses diagrammet

Signalveidiagrammet nedenfor ble laget til denne artikkelen for å tydeliggjøre skillet teksten har trukket. Bokser med heltrukne rammer viser trinn med direkte eksperimentell støtte i litteraturen om metylenblått: redokssykling som forskyver NAD/NADH, forbigående AMPK-fosforylering, induksjon av PGC-1alpha og SURF1, høyere kompleks IV-aktivitet, induksjon av NQO1 og TrxR1, gjenopprettet uttrykk av biogenesegener og antall mtDNA-kopier i musehjernen, samt økt peroksidnivå uten mtDNA-skade ved terapeutiske doser. Bokser med stiplede rammer viser de foreslåtte forbindelsene: at Keap1 registrerer peroksidsignalet, at opphopning av Nrf2 i cellekjernen driver forsvarsgenene, og årsakspilen fra Nrf2-aktivering til biogeneseprogrammet. Disse stiplede trinnene er plausible, forenlige med dataene og standard lærebokbiologi. I disse artiklene ble de likevel ikke målt med kontrollene – Nrf2 i cellekjernen, ARE-reportere og Nrf2-knockout – som ville gitt dem heltrukne rammer.

Tre sammenblandinger blir tydelige når du har diagrammet foran deg. For det første er NRF1 og Nrf2 ulike proteiner med nesten identiske navn. Musestudien målte nukleær respirasjonsfaktor 1, en biogeneseregulator, ikke transkripsjonsfaktoren for antioksidantforsvar. Å blande dem sammen reduserer hele diagrammet til ett enkelt knutepunkt. For det andre er genuttrykk begynnelsen på historien, ikke slutten. Gjenopprettede nivåer av TFAM- eller COX1-transkripter støtter at biogenese ble bestilt, mens antall mtDNA-kopier og kompleks IV-aktivitet er evidensen for at bestillingen ble oppfylt. For det tredje beviser ikke antioksidantutfallet at effekten gikk via Nrf2. Oksidantreduksjonen på 28 prosent i fibroblaster og beskyttelsen mot rotenon hos mus er reelle nedstrømseffekter, men flere signalveier leder frem til dem.

Hva som ville gi en stiplet boks heltrukket ramme

Eksperimentene som mangler, er standardforsøk. Måling av Nrf2-protein i cellekjernen etter eksponering for metylenblått, med et tidsforløp tilpasset det forbigående AMPK-signalet, ville teste om de to grenene faktisk aktiveres samtidig, slik hypotesen om synkronisert aktivering hevder. En ARE-drevet reporter ville bekrefte transkripsjonsaktivitet i stedet for å utlede den fra målgener. Å gjenta biogenesemålingene med Nrf2 nedregulert eller slått ut ville teste årsakspilen direkte: Hvis induksjonen av kompleks IV og økningen i mtDNA vedvarer uten Nrf2, er broen feil, og AMPK-grenen står alene for effekten. På dyresiden ville en studie med langvarig dosering og de samme tre kontrollpunktene – regulator, innhold og funksjon – teste om programmet forblir aktivt eller tilpasser seg. Inntil da er synkronisert aktivering av energi- og forsvarssignalveier fortsatt det forfatterne kalte det: en mulig nøkkelfaktor, ikke en etablert mekanisme.

Lesere som kommer fra den bredere farmakologien, kan ønske seg mer kontekst: hvordan metylenblått transporterer elektroner på mitokondrienivå, hva annet det gjør med mitokondrier og cellenes energi, hvor funnene om senescens hører hjemme i aldringsforskningen, hvordan påstander om biogenese forholder seg til kognitiv ytelse, og sikkerhetsgrunnlaget som setter rammer for enhver diskusjon om dosering. Hvert av disse er et eget begrep med sin egen evidens, og hvert fortjener det samme skillet mellom målt og foreslått som denne artikkelen har brukt for Nrf2.