Metylenblått og nitrogenmonoksid: NOS, cGMP og vaskulær signalering

Spørsmålet høres enkelt ut: Hemmer metylenblått nitrogenmonoksid? I laboratoriet deler svaret seg i fire separate spørsmål, og hvert av dem krever en egen eksperimentell test. Sammenblanding av disse er hovedgrunnen til at tekster om metylenblått og nitrogenmonoksid fremstår som skråsikre, men vage.

Tenk på nitrogenmonoksidsignalet som en kjede med fire ledd. Et gen transkriberes for å danne nitrogenmonoksidsyntase. Enzymet omdanner arginin til nitrogenmonoksid. Gassen diffunderer til målet sitt før den reagerer med noe annet. Løselig guanylatcyklase registrerer den og danner syklisk GMP. Det finnes publiserte effekter av metylenblått ved hvert ledd, men dokumentasjonen kommer fra ulike forsøksoppsett, ulike konsentrasjoner og ulike isoformer. Et resultat ved ett ledd beviser ikke en virkning ved et annet.

Den klassiske kjeden, forklart enkelt

I en blodårevegg følger standardsekvensen dette mønsteret. En stimulus virker på en endotelcelle. Endotelial nitrogenmonoksidsyntase, kalt eNOS eller NOS3, produserer en liten puls av nitrogenmonoksid. Gassen diffunderer inn i den tilstøtende glatte muskelcellen, binder seg til hemgruppen med redusert jern i løselig guanylatcyklase og fremskynder omdanningen av GTP til syklisk GMP. Syklisk GMP aktiverer proteinkinase G, kalsiumhåndteringen endres, og muskelen slapper av.

Det finnes en annen kjede som bør holdes adskilt fra denne. Under infeksjon eller eksponering for cytokiner transkriberer cellene et annet enzym, induserbar nitrogenmonoksidsyntase eller iNOS, også kalt NOS2. Det produserer større og mer langvarige strømmer av nitrogenmonoksid enn eNOS. En tredje isoform, nevronal NOS eller nNOS, hører til i enda en annen sammenheng. Når en artikkel omtaler nitrogenmonoksidsyntase uten å spesifisere isoformen, bør du stoppe opp og kontrollere hvilken som ble målt. Oversikten over hvordan metylenblått flytter elektroner, understreker det samme poenget for redoksmål generelt: Elektronformidleren gjør ingenting på egen hånd, og partneren i hver ende avgjør utfallet.

Målt syklisk GMP er også et samlet resultatmål, ikke en direkte enzymanalyse. Nivået gjenspeiler syntesen via cyklase minus nedbrytningen via fosfodiesteraser, særlig PDE5 i vaskulær glatt muskulatur. Et fall i syklisk GMP betyr derfor at mindre signal nådde detektoren. Det angir ikke i seg selv hvilket ledd som sviktet.

Ledd 1: Det dannes mindre iNOS-enzym

I makrofager fra mus stimulert med bakterielt lipopolysakkarid, interferon gamma eller begge deler hindret metylenblått den forventede økningen i iNOS-protein og reduserte iNOS-budbringer-RNA kraftig i transkripsjonsforsøkene med makrofager. Det opplysende er hva som ikke endret seg. Nedbrytningen av inhibitoren I kappa B alfa, fosforyleringen av NF kappa B og STAT1 og forflytningen av disse faktorene inn i cellekjernen forble stort sett intakt. Det som avtok, var bindingen deres til DNA, bekreftet ved kromatinimmunpresipitering som viste redusert binding ved iNOS-promotoren.

Dette er en genregulerende effekt oppstrøms for enzymmengden, ikke akutt hemming av et eksisterende enzym. Den hører til inflammatorisk signalering, der transkripsjonsfaktorer må binde seg til en promotor før proteinet dannes. Den sier ikke noe direkte om konstitutiv eNOS i en blodåre i hvile, og bør beskrives med disse avgrensningene.

Ledd 2: Det eksisterende NOS-enzymet arbeider langsommere

En rottestudie undersøkte et annet nivå. Vå kne hannrotter fikk lipopolysakkarid intravenøst, og tre timer senere fikk de enten saltvann eller metylenblått i en dose på 3 mg per kg intravenøst. Aktiviteten til nitrogenmonoksidsyntase i den mediale basale hypotalamus ble deretter målt ved omdanning av merket arginin til citrullin i studien av NOS-aktivitet i hypotalamus. Stress kombinert med saltvann alene induserte noe kalsiumuavhengig aktivitet, og lipopolysakkarid økte den til omtrent ti ganger kontrollnivået. Metylenblått fjernet begge de induserte komponentene. Den kalsiumavhengige konstitutive aktiviteten endret seg ikke i dette vevet ved denne dosen og på dette tidspunktet.

Les resultatet nøyaktig slik det er beskrevet: redusert målt aktivitet av iNOS-typen under disse betingelsene. Det er ikke en måling av genuttrykk, og det er ikke bevis for vedvarende selektivitet for iNOS fremfor eNOS eller nNOS. Arbeid med rensede enzymer understreker behovet for varsomhet. I direkte analyser av renset nitrogenmonoksidsyntase blokkerte metylenblått citrullindannelsen fullstendig ved 30 mikromolar, med en konsentrasjon for halv maksimal hemming nær 5.3 mikromolar uten superoksiddismutase og 9.2 mikromolar med dette enzymet, som rapportert i sammenligningen av renset NOS og guanylatcyklase. En separat studie av renset nNOS pekte på oksidasjon av enzymbundet hem. Den praktiske lærdommen er at direkte NOS-hemming forekommer i isolerte systemer, men resultatet fra hypotalamus kan ikke strekkes til en generell påstand om at metylenblått skåner all konstitutiv NOS overalt.

Ledd 3: Nitrogenmonoksid går tapt før det kommer frem

Den tydeligste demonstrasjonen av at noe annet enn enzymhemming kan forklare et fall i syklisk GMP, kommer fra dyrkede glatte muskelceller fra lungearterier hos kanin. Forsøksoppsettet omgikk endogen NOS fullstendig ved å tilsette nitrogenmonoksiddonorer direkte, og undersøkte deretter om metylenblått fortsatt reduserte responsen i syklisk GMP i studien av superoksid i vaskulær glatt muskulatur.

Tre donorer ble testet fra 1 til 100 mikromolar: S-nitroso-L-cystein, natriumnitroprussid og en stabil deaminert analog kalt MPANO. Alle økte syklisk GMP til omtrent 1.5 til 12 ganger utgangsnivået. Metylenblått ved 10 mikromolar hemmet responsen på de to første med 51 til 100 prosent og lot MPANO-responsen være uendret. Hvis metylenblått bare blokkerte cyklasens katalytiske sete, ville denne donorselektiviteten være vanskelig å forklare, fordi alle tre virker via det samme nedstrøms enzymet.

Tre kontrollforsøk knyttet deretter mekanismen til superoksid. For det første gjenskapte dannelse av ekstracellulært superoksid med xantin og xantinoksidase det samme mønsteret: CYSNO og nitroprussid ble blokkert, mens MPANO ble skånet. For det andre førte metylenblått til dose- og tidsavhengig superoksidproduksjon fra de glatte muskelcellene, målt ved reduksjon av cytokrom c. For det tredje hindret superoksiddismutase hemmingen fullstendig, mens katalase ikke gjorde det. Dette peker på superoksid snarere enn hydrogenperoksid som den direkte virksomme kjemiske arten i dette forsøksoppsettet.

Samkulturversjonen av forsøket er verdt å beskrive fordi den viser hvor effekten oppstår. Endotelceller på dekkglass ble kortvarig dyrket sammen med glatte muskelceller, slik at basalt frigjort endotelfaktor økte syklisk GMP i de glatte muskelcellene til tre til åtte ganger utgangsnivået. Forbehandling av enten den ene eller den andre cellegruppen med metylenblått reduserte dette signalet, og superoksiddismutase motvirket delvis effekten av forbehandling av endotelcellene. Metylenblått trenger med andre ord ikke å virke inne i den glatte muskelcellen som registrerer signalet. Det kan redusere signalet ved å fjerne budbringeren underveis. Veiledningen i å lese forskning på metylenblått behandler dette som en generell regel: Angi hvilket rom inngrepet fant sted i, før du angir et molekylært mål.

Det ville være feil å kalle dette NOS-hemming. Donorene trengte ikke noe syntasetrinn for å virke, men signalet falt likevel.

Ledd 4: Selve detektoren reagerer svakere

Det finnes direkte effekter på løselig guanylatcyklase, men konsentrasjonene er viktige. I sammenligningen av rensede enzymer nevnt ovenfor krevde nitrogenmonoksidstimulert cyklase omtrent 60 mikromolar metylenblått for halv maksimal hemming, mot nær 5 til 9 mikromolar for NOS. Selv 1 millimolar ga bare delvis maksimal blokkering. Det er en forskjell på omtrent seks til elleve ganger. Et celleforsøk ved lav mikromolar konsentrasjon som reduserer syklisk GMP, kan derfor ikke betegnes som selektiv cyklasehemming utelukkende på grunnlag av verdien for syklisk GMP.

En senere redoksstudie ga enda en grunn til varsomhet: Metylenblått deaktiverte nitrogenmonoksidaktivert cyklase gjennom en mekanisme som skilte seg fra enkel oksidasjon av hemjernet ved kontakt med luft. Detektoren kan altså svekkes, men kjemien er ikke avklart. Konsentrasjonsforskjellen betyr dessuten at superoksid- og NOS-effektene bør utelukkes først ved eksponering for lave mikromolare konsentrasjoner. Det er også her kontroll av fosfodiesterase hører hjemme. Med mindre nedbrytningen ble målt eller blokkert, er redusert opphopning av syklisk GMP forenlig med mindre syntese, raskere nedbrytning eller begge deler.

Hvorfor dette ikke kan reduseres til én påstand om blodtrykk

Hvert ledd ble påvist i et forskjellig system. Transkripsjon i makrofager er ikke enzymaktivitet i hypotalamus. Aktivitet i hypotalamus etter lipopolysakkarid er ikke endotelial tonus i hvile. Basalt frigjort endotelfaktor i samkultur er ikke agoniststimulert vasodilatasjon. Dyrkede lungearterieceller ved 10 mikromolar metylenblått er ikke et menneskelig kretsløp. Å slå dette sammen til en påstand som at metylenblått øker blodtrykket ved å blokkere nitrogenmonoksid, fjerner nettopp de skillene kontrollforsøkene var utformet for å bevare.

Tre kontroller holder fremstillingen redelig. Først må isoformen angis: eNOS for vaskulær tonus i hvile, iNOS for indusert inflammatorisk produksjon, nNOS for nevronale sammenhenger og enkelte forsøk med rensede enzymer. Deretter må det angis hvordan nitrogenmonoksidsignalet tilføres: endogen syntese, basal frigjøring fra endotelet eller en bestemt donor som CYSNO, nitroprussid eller MPANO, ettersom den stabile donoren motsto metylenblått mens de labile donorene ikke gjorde det. Til slutt må konsentrasjonen og det som gjenoppretter responsen, angis: Gjenoppretting med superoksiddismutase peker på superoksid, manglende effekt av katalase taler mot hydrogenperoksid i dette forsøksoppsettet, etterligning med xantinoksidase viser at mekanismen er tilstrekkelig, og analyser av rensede enzymer skiller direkte effekter på katalysen fra tap underveis.

Den korte oppsummeringen er denne: Metylenblått forstås bedre som et stoff som forstyrrer signaleringen fra nitrogenmonoksid til syklisk GMP på flere steder, enn som en selektiv cyklaseblokker. Avhengig av forsøksoppsett og konsentrasjon kan det redusere transkripsjonsfaktorbinding ved iNOS, hemme NOS-enzymer direkte, redusere tilgjengeligheten av nitrogenmonoksid gjennom superoksiddannelse og svekke nitrogenmonoksidaktivert cyklase. Rollen til syklisk GMP-signalering i vaskulære studier og sammenligningen av nitrogenmonoksiddonorer brukt i celleanalyser dekker hver sin gren mer detaljert, og metodene som brukes for å skille redokseffekter fra enzymeffekter forklarer hvorfor superoksiddismutase kombinert med katalase og en kontroll med en stabil donor forekommer så ofte i denne litteraturen.

En lav verdi for syklisk GMP etter metylenblått viser at kjeden er brutt. Bare kontrollforsøkene forteller hvilket ledd som sviktet.