Metylenblått og lyseksponering: bølgelengde, irradians og behandlingsgeometri

To forskningsartikler rapporterer at metylenblått ble eksponert for 10 J per kvadrat-cm lys. Den ene eksponeringen dreper bakterier. Den andre gir ingen målbar effekt. En leser som bare sammenligner dosen, konkluderer med at forskningsfeltet er inkonsistent. Feltet er konsistent. Dosen beskrev aldri hele eksponeringen.

En lyseksponering er et lite system av parametere som virker sammen: bølgelengde, irradians, varighet, den resulterende fluensen, oksygentilgjengelighet, fargestoffkonsentrasjon og aggregasjonstilstand, tidsintervallet mellom fargestoff og lys, og den optiske lysveien lyset faktisk følger gjennom prøven. Endrer du én parameter, endres fotokjemien. Denne artikkelen går gjennom hver parameter og skiller deretter mellom nærinfrarød fotobiomodulasjon og direkte fotoaktivering av fargestoffet, fordi disse to virkemåtene oftest forveksles.

Bølgelengden avgjør om fargestoffet deltar

Metylenblått i vann absorberer rødt lys sterkt som monomer, med en topp nær 664 til 665 nm og en skulder ved kortere bølgelengder, nær 610 nm, som vokser når fargestoffet aggregerer til dimerer og større stabler. Den molare ekstinksjonskoeffisienten nær toppen er i størrelsesorden 65,000 til 85,000 M-1 cm-1, så selv mikromolare løsninger er intenst blå. Den tidlige fotokjemiske oversikten over metylenblått med DNA og biologiske substrater dokumenterer denne absorpsjonsatferden og kjemien i de eksiterte tilstandene som følger: absorpsjon fører molekyler til en kortlivet singlettilstand, med overgang til en mer langlivet triplettilstand med rapporterte utbytter nær 0.5. I en luftmettet løsning deaktiveres denne av oksygen innen omtrent 2 mikrosekunder.

Det er ved dette deaktiveringstrinnet de to fotokjemiske reaksjonsveiene skiller lag. I Type II-kjemi overfører fargestoffet i triplettilstand energi til oksygen i grunntilstanden og produserer singlettoksygen, med ofte oppgitte utbytter nær 0.52. I Type I-kjemi overfører tripletten i stedet et elektron eller hydrogen til et substrat, slik at det dannes radikaler, blant annet superoksid- og hydroksylradikaler. Begge kan foregå samtidig, og den konvensjonelle fotodynamiske effekten er fortsatt sterkt oksygenavhengig selv når Type I bidrar.

Konsekvensen for valg av bølgelengde for metylenblått er en enkel regel. Rødt lys fra omtrent 630 til 680 nm overlapper fargestoffets absorpsjonsbånd, med 660 til 665 nm nær monomerens maksimum, og kan derfor drive fotosensibilisatorkjemi der det finnes en betydelig mengde fargestoff. Nærinfrarødt lys ved 810 nm ligger langt utenfor absorpsjonsbåndet i grunntilstanden og er derfor en dårlig bølgelengde for direkte eksitasjon av fargestoffet. Konsentrasjonen kompliserer bildet på én reell måte: Når konsentrasjonen øker, finnes mer av fargestoffet som dimerer og aggregater som absorberer mot 610 nm og fotosensibiliserer mindre effektivt per molekyl. En dobling av fargestoffmengden dobler derfor ikke effekten. Den tilhørende oversikten over metylenblått og rødt lysterapi behandler denne absorpsjonsregelen som forutsetningen for enhver fotosensibilisert reaksjon.

Irradians, varighet og fluens er tre parametere, ikke én

Fluens, i J per kvadrat-cm, er irradians multiplisert med tid. Å rapportere bare fluensen skjuler hvor raskt energien ble tilført, og hastigheten har betydning.

Høy irradians tilført kortvarig og lav irradians tilført over lang tid kan gi samme fluens, men forskjellig kjemi. Høy irradians forbruker oppløst oksygen raskere enn diffusjon erstatter det, noe som bremser den oksygenavhengige Type II-reaksjonsveien underveis i eksponeringen. Den tilfører også varme, og vev reagerer på oppvarming med endringer i blodstrømmen som påvirker både oksygeneringen og fordelingen av fargestoffet. Lav irradians over en lang eksponering opprettholder oksygentilførselen, men gir reparasjons- og reoksygeneringsprosesser tid til å virke under selve eksponeringen. Fotokjemiske lærebøker kaller antakelsen om at bare totaldosen betyr noe, for resiprositet. Den holder ikke når oksygen, oppvarming eller biologi spiller inn, noe som i vev betyr nesten alltid.

Antimikrobielle fotodynamiske eksponeringer med metylenblått hos mennesker bruker vanligvis 6 til 18 J per kvadrat-cm, noe som overlapper verdier for fotobiomodulasjon. Fluensen alene kan derfor ikke identifisere virkemåten. En eksponering på 10 J per kvadrat-cm ved 660 nm i vev som inneholder fargestoff, er fotosensibilisatordrevet fotokjemi. Samme fluens ved 810 nm i vev med spormengder av fargestoff er noe helt annet. Tallet er det samme. Prinsippet er forskjellig.

Optisk lysvei og prøvegeometri avgjør hva lyset møter

Beer-Lamberts lov innebærer at forsiden av en prøve mottar langt mer lys enn baksiden. I en kyvette med titalls mikromolar fargestoff kan den første millimeteren absorbere det meste av det innkommende røde lyset, slik at dypere lag i praksis ikke eksponeres. Flytt den samme løsningen til en grunn brønn med lite volum, og eksponeringen blir nesten jevn. Samme fargestoff, samme lampe, samme fluens ved overflaten, forskjellig resultat.

Vev gir spredning i tillegg til absorpsjon. Rødt lys nær 660 nm trenger inn i størrelsesorden millimeter, og den nøyaktige dybden bestemmes av blodinnhold, pigmentering og vevstype. Brønner tilfører sine egne artefakter: linseeffekt fra menisken, refleksjon fra veggene, skyggelegging av kantbrønner og oppvarming av små volumer under lyskilden. To laboratorier som rapporterer identiske lampeinnstillinger, men ulike platetyper, volumer eller avstander til lyskilden, har utført forskjellige forsøk.

Avstand fortjener særlig oppmerksomhet fordi den er den vanligste uoppgitte variabelen. Irradiansen faller raskt med avstanden fra en ikke-kollimert lyskilde, så en lampe som flyttes fra 2 cm til 5 cm over platen, kan redusere irradiansen til en brøkdel selv om metodedelen fortsatt beskriver det samme. Uten en målt irradians ved prøveoverflaten er publiserte fluenser beregnet ut fra produsentens effektangivelser anslag, ikke målinger.

Kommentert parameterveiledning: hva som gjør en eksponering reproduserbar

Det originale materialet for denne siden er en sjekkliste. Lyseksponeringer i studier som utelater disse opplysningene, kan ikke sammenlignes med andre, uansett hvor lik den oppgitte dosen ser ut.

1. Bølgelengde og båndbredde. Topp og full bredde, ikke et fargenavn. Røde LED-er dekker 630 til 680 nm, der fargestoffets absorpsjon varierer betydelig.
2. Irradians ved prøveoverflaten, målt, i mW per kvadrat-cm. Produsentens effektangivelse i watt er ikke irradians.
3. Varighet og pulsering. Kontinuerlig kontra pulset tilførsel, inkludert pulsfrekvens og arbeidssyklus der det er relevant.
4. Fluens beregnet fra de målte verdiene for irradians og varighet ovenfor, i J per kvadrat-cm.
5. Fargestoffkonsentrasjon, formulering og aggregasjonstilstand. Monomeren nær 664 nm fotosensibiliserer annerledes enn aggregater nær 610 nm.
6. Intervall mellom legemiddel og lys. Minutter til timer mellom tilførsel av fargestoff og bestråling, som avgjør hvor fargestoffet befinner seg når lyset kommer.
7. Oksygenering. Luftmettet løsning kontra hypoksisk vev endrer balansen mellom Type I og Type II direkte.
8. Geometri. Prøvedybde, volum, beholdertype, lyskildens avstand og vinkel, og dybden til målområdet i vevet.

En nyttig vane når du leser forskningsartikler: Sjekk intervallet mellom legemiddel og lys først. Det viser hensikten. I fotodynamiske forsøksoppsett bestråles vev som inneholder fargestoff, med hensikt. Kombinasjonsoppsett kan bevisst holde de to adskilt, som nedenfor.

Nærinfrarød fotobiomodulasjon er ikke fotoaktivering av fargestoff

Fotobiomodulasjon, vanligvis forkortet PBM, bruker rødt eller nærinfrarødt lys til å modulere endogen signalering uten å tilføre en fotosensibilisator. Fotodynamisk terapi, vanligvis forkortet PDT, bruker tre deler sammen: lys som fotosensibilisatoren absorberer, selve fotosensibilisatoren og oksygen, for å skape en rask produksjon av reaktive forbindelser som skader målområdet. En oversikt over mitokondrier som mål for nevrobeskyttelse kombinerer metylenblått med PBM fordi de påvirker respirasjonen fra ulike retninger: Fargestoffet fungerer som en katalytisk redokssykler som støtter elektronstrømmen, mens hypotesen for PBM er at det fremmer frigjøring av hemmende nitrogenmonoksid fra cytokrom c-oksidase i kompleks IV. Denne enzymmekanismen bør fortsatt betegnes som en hypotese.

De to mest siterte kombinasjonsstudiene på mus bruker begge lys ved 810 nm, og nettopp derfor demonstrerer de ikke fotoaktivering av fargestoffet. I en studie av forbehandling før søvndeprivasjon fikk mus daglig metylenblått ved 0.5 mg per kg, pulset laser ved 810 nm annenhver dag, eller begge deler før søvndeprivasjonen. Kombinert forbehandling beskyttet hukommelsesrelatert atferd og synaptiske proteiner i hippocampus, mens enkeltbehandlingene i stor grad ikke gjorde det. I en studie av kronisk stress med samtidig behandling fikk mus PBM ved 810 nm med 8 J per kvadrat-cm sammen med daglig fargestoff ved 0.5 mg per kg. Laseren ble brukt først, og fargestoffet ble injisert to timer senere, uttrykkelig for å unngå å bestråle vev som inneholdt fargestoff. Alle tre behandlingsgruppene reverserte læringssvikt, med additiv effekt hovedsakelig på serumkortisol og reaktive oksygenforbindelser i hjernen. Disse resultatene tester to mitokondrielle intervensjoner brukt sammen, et skille som samlingen av fotodynamiske studier tydeliggjør ved å registrere bølgelengde for hver indikasjon.

Dokumentasjonen for hud ligger på den andre siden av skillet. Humandata om metylenblått kombinert med lys på hud er konsentrert rundt 630 til 680 nm, med topikalt eller intralesjonelt fargestoff og med destruksjon eller remodellering som hensikt, noe som per definisjon er PDT. Å vise til slik fjerning som bevis for at fargestoff forsterker PBM, eller til gjenoppretting hos mus ved 810 nm som bevis for at et 660 nm-panel pluss fargestoff er en protokoll for kognisjon, blander sammen virkemåtene. Referansen om dosering og farmakologi og veiledningen om sikkerhet og interaksjoner utdyper delene av dette temaet som gjelder konsentrasjon og kontraindikasjoner.

Sett navn på prinsippet før du sammenligner tall. Bølgelengden avgjør om fargestoffet absorberer. Irradians og varighet avgjør hva kjemien gjør med denne absorpsjonen. Geometrien avgjør hvilken del av prøven som i det hele tatt blir utsatt for dette. To eksponeringer som samsvarer på én parameter og er forskjellige på resten, er forskjellige forsøk. Å behandle dem som utskiftbare er feilen denne veiledningen skal forhindre. Ingenting av dette gir grunnlag for en hjemmeprotokoll; lys med en bølgelengde som samsvarer med absorpsjonen, kombinert med systemisk tilført fargestoff, omdanner en ellers modulerende eksponering til fotosensibilisatordrevet fotokjemi, som hører hjemme i kliniske hender.