Metylenblått og hjernens støtteceller: astrocytter, mikroglia og betennelse

Tenk deg at du gjennomfører to forsøk med det samme blå fargestoffet og får to lovende resultater. I én dyrkingsskål overlever stjerneformede støtteceller mangel på oksygen og glukose. I en annen beholder hjernens immunceller sin rolige, forgrenede form til tross for et bakterietoksin. Det er fristende å slå dette sammen til én påstand: Fargestoffet demper betennelse i hjernen og beskytter hjernen. Det er nettopp ved denne sammenkoblingen at grundige lesere bør stoppe opp.

Hjernen har to grupper støtteceller med ulike oppgaver, og metylenblått undersøkes i hver av dem med forskjellige eksperimentelle utløsere. Astrocytter er metabolske støtteceller. De ligger mellom blodårer og nevroner, fjerner overskudd av glutamat, stabiliserer kaliumnivået, lagrer glykogen og transporterer energisubstrater til nevroner når behovet øker kraftig. Mikroglia er hjernens stedegne immunovervåkere. De fine utløperne deres patruljerer vevet og oppdager signaler fra bakterier og skader. Ved alarm trekker de utløperne tilbake og får en avrundet, amøboid form tilpasset forflytning og oppsluking, samtidig som de frigjør signalmolekyler. Et resultat i én cellegruppe kan ikke overføres til den andre, og målingen som brukes i hvert tilfelle, avgjør hva som faktisk ble vist.

Astrocytter under metabolsk stress: tidspunktet er selve resultatet

Astrocyttforsøket begynner med mangel på oksygen og glukose. Forskerne dyrket astrocytter fra hjernebarken hos nyfødte mus, fjernet glukose og nesten alt oksygen i seks timer og gjenopprettet deretter tilførselen av begge i tjuefire timer. Dette er en laboratoriemodell for hjerneslag etterfulgt av reperfusjon. Når metylenblått var til stede under mangelfasen, ble celleoverlevelsen dårligere. Når det først ble tilsatt i reoksygeneringsfasen, ved 0.1 og 1 mikromolar, ble overlevelsen signifikant bedre, målt med en kalceinbasert levedyktighetstest. Studien av astrocytter fra mus rapporterer denne forskjellen mellom tidspunktene sammen med respirasjonsdataene.

Denne forskjellen er det viktigste funnet. Under mangelfasen finnes det nesten ikke oksygen som kan ta imot elektroner, så en elektronformidler har ingen steder å levere dem. Under reoksygeneringen starter maskineriet igjen, og fargestoffet får en oppgave. Behandlede astrocytter forbrukte mer oksygen, tok opp mer glukose, produserte mer ATP og bygde opp glykogenlagrene igjen, med høyere heksokinaseaktivitet og uten økning i mitokondrielt superoksid. Den foreslåtte forklaringen er den kjente mekanismen fra gjennomgangen av metylenblått som mitokondriell elektronbærer: Det frakter elektroner forbi blokkerte punkter i respirasjonskjeden, slik at respirasjonen starter igjen uten elektronlekkasje som danner reaktive forbindelser.

Legg merke til hva slags evidens dette er. Det er et resultat om overlevelse og metabolisme i én isolert celletype, med et angitt tidsvindu for effekt (gjenoppretting, ikke mangel) og et angitt konsentrasjonsområde. Det sier ingenting om immunsignalering og ingenting om atferd.

Mikroglia under bakteriealarm: metabolismen omprogrammeres

Mikrogliaforsøkene begynner med den motsatte utløseren: ikke sult, men en falsk infeksjon. Lipopolysakkarid, et fragment av bakteriers ytre membran, binder seg til sensorer i det medfødte immunforsvaret og får mikroglia til å reagere som om patogener har ankommet, selv om det ikke finnes levende bakterier. Hos mus som får lipopolysakkarid, og i en dyrket mikroglial cellelinje, blir resultatet et velkjent betennelsesprogram: Nivåene av proinflammatoriske faktorer øker, mikroglia polariseres mot den aggressive M1-tilstanden, nærliggende nevroner dør, og dyrene presterer dårligere på lærings- og hukommelsesoppgaver.

Musestudien av denne responsen knytter den til en oksygenregistrerende signalvei: Lipopolysakkarid driver overuttrykk av PHD3, ett av tre prolylhydroksylaseenzymer, gjennom en oppstrøms Siah2/Morg1-kjede. Samtidig omprogrammerer cellene energibruken mot aerob glykolyse, med økte nivåer av mitokondrielle reaktive oksygenforbindelser. Forfatterne målte dette skiftet direkte med metabolske Seahorse-analyser av oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring. Metylenblått reverserte både det metabolske skiftet og overuttrykket av PHD3, senket nivåene av betennelsesfaktorer, reduserte nevrondød og forbedret resultatene i atferdstestene. Positronemisjonstomografi ga i tillegg bildedata: Lipopolysakkarid økte glukoseopptaket i hippocampus på FDG-PET, og behandlingen senket det igjen, i samsvar med en mindre aktiv betennelsesrelatert metabolisme i den levende hjernen.

Dette er et mer omfattende sett med målinger enn i astrocyttstudien (cytokiner, metabolisme, bildediagnostikk og atferd hos dyr), men det gjelder en annen utløser og en annen celle. Lesere som sammenligner de to, bør holde utløserne adskilt: Den ene studien redder utsultede støtteceller under gjenoppretting, mens den andre demper en falsk infeksjonsalarm i immunceller.

Mikroglia under mikroskopet: form som måleparameter

Et tredje forsøk undersøker den samme bakteriealarmen gjennom form alene. I gliacellekulturer fra rotters hjernebark viser kontrollmikroglia farget for markøren IBA1 mange fine utløpere, den forgrenede overvåkingsformen. Etter tjuefire timer med lipopolysakkarid ved 10 mikrogram per milliliter flater cellene ut til den amøboide formen. Cellekroppens areal øker, mens omkretsen holder seg omtrent konstant, noe som er det geometriske kjennetegnet på avrunding. Metylenblått ved 1 mikromolar, gitt samtidig med toksinet, bevarte de forgrenede utløperne og holdt cellekroppens areal og omkrets nær kontrollverdiene. Studien av rotteceller i kultur tallfester denne bevaringen av formen med målinger av cellekroppens areal og omkrets.

To detaljer gjør denne studien mer verdifull enn et enkelt bilde. For det første bevarte ikke sammenligningsstoffet menadion, et annet redoksaktivt molekyl ved samme konsentrasjon, formen. Alene drev det dessuten cellene mot den aktiverte formen. Effekten er derfor ikke en generell egenskap ved alle stoffer som gjennomgår redokssykluser. For det andre knytter forfatterne fargestoffets effekt til aktivering av Nrf2, en transkripsjonsfaktor som styrer et program for antioksidative og betennelsesdempende gener, snarere enn bare til direkte nøytralisering av reaktive forbindelser. Relatert omtale av redoks- og betennelsessignalering setter denne Nrf2-koblingen i sammenheng.

Form er likevel det svakeste av de tre målegrunnlagene. En forgrenet celle er vanligvis en overvåkende celle, og en avrundet celle er vanligvis en aktivert celle, men morfologi er en indirekte indikator, ikke en avlesning av genuttrykket. Denne kulturen inneholdt ingen blodbårne immunceller, ingen nevrale kretsløp og ingen målbar atferd.

De tre resultatene lest side om side

Mønsteret på tvers av radene er at hver utløser får sin egen måling og sitt eget svar. Metabolsk redning svarer på et spørsmål om metabolisme. Cytokin- og atferdsdata svarer på et spørsmål om betennelse. Form svarer på et spørsmål om form. Ingen av de tre kan alene svare på de andre spørsmålene.

Hva roligere utseende mikroglia ikke beviser

Dette er setningen hele temaet trenger: Mikroglia som ser mindre aktiverte ut, eller endret metabolisme i mikroglia, beviser ikke i seg selv bedre hjernefunksjon.

Morfologien kan endres uten at funksjonen følger etter. En celle kan beholde forgreningene og likevel frigjøre cytokiner, eller bli avrundet mens den utfører nyttig opprydding av celleavfall. Metabolske målinger har samme begrensning: En Seahorse-kurve eller en PET-skanning viser energihåndtering, ikke kognisjon. Musestudien som kombinerte metabolske og formrelaterte målinger med atferdstester, er sterkere nettopp fordi den samlet flere evidensnivåer i stedet for å la én måling bære konklusjonen. Også der gjelder de vanlige begrensningene: Lipopolysakkarid modellerer en steril alarm snarere enn en reell infeksjon, mus er ikke mennesker, og forfatterne påpeker selv artsforskjeller. Alle som planlegger videre arbeid, bør vurdere hvor godt funn om mikroglia kan overføres mellom modeller, før de antar at signalveien oppfører seg likt i menneskelig vev.

Dette gir en praktisk følge for tidspunktet. Astrocyttresultatet viser dårligere utfall ved tidlig dosering og bedre utfall ved dosering under gjenoppretting. Mikrogliaresultatene kommer fra dosering rundt tidspunktet for den betennelsesutløsende påvirkningen. Hjerneskade i virkeligheten blander begge fasene samtidig: energisvikt og immunalarm, som utvikler seg over timer. Et forsøk som isolerer én fase, kan ikke fastsette tidsplanen for det kombinerte tilfellet. Derfor holder diskusjoner om doseringsvinduer tidsforløpene for mangel og betennelse adskilt.

Den redelige oppsummeringen får plass i ett avsnitt. I isolerte astrocytter starter metylenblått gitt under reoksygenering respirasjonen igjen og redder celler. I mikroglia eksponert for et bakteriefragment reverserer det et betennelsesrelatert metabolsk program gjennom en bestemt PHD3-signalvei og bevarer hvileformen. Hvert resultat er reelt innenfor sitt forsøksoppsett, og ingen av dem gir en generell konklusjon om betennelse i hjernen. Sammenligningen av gliaceller er nyttig nettopp fordi den hindrer at de to historiene glir sammen til én.