Loefflers alkaliske og polykrome metylenblåfarginger forklart

Tre flasker kan stå side om side på en fargingsbenk, alle merket med en variant av metylenblått. På én står det vandig metylenblått 1%. På en annen står det Loefflers alkaliske metylenblått. På den tredje står det polykromt metylenblått. En travel medarbeider griper den som står nærmest. Utstryket farges deretter for svakt, for ensartet blått eller i uventede lillatoner, og prøven får skylden for resultatet.

Dette er et problem med formuleringen, ikke med prøven. De tre løsningene inneholder beslektede fargestoffer, men bygger på ulike fargingsprinsipper. Den ene er et vanlig kationisk fargestoff ved tilnærmet nøytral pH. Den andre er det samme fargestoffet, gjort mer virkningsfullt ved hjelp av alkali. Den tredje er ikke lenger ett enkelt fargestoff, men en bevisst oksidert blanding. Bruker du feil løsning, endrer du fargingsprinsippet underveis.

Det korte svaret

Vanlig vandig metylenblått er utgangspunktet: omtrent 1% fargestoff i vann, et enkelt kationisk fargestoff for bakteriemorfologi og generell mikroskopi. Loefflers alkaliske metylenblått tilsetter en liten, oppmålt mengde fortynnet alkali til en alkoholisk stamløsning som er fortynnet i vann. Dette øker pH og får det kationiske fargestoffet til å binde seg sterkere til sure strukturer i bakteriene. Polykromt metylenblått er metylenblått som bevisst er modnet gjennom oksidasjon i alkali. Flasken inneholder derfor en blanding av demetylerte homologer (azure A, azure B, azure C), tionin og metylenfiolett sammen med gjenværende metylenblått, og denne blandingen farger ulike strukturer i forskjellige nyanser.

Hvis du bare husker én setning: Alkalisering endrer fargingsintensiteten, mens polykromering endrer fargene.

Vanlig vandig metylenblått: referansepunktet

Den enkleste formuleringen er metylenblått oppløst i vann, vanligvis ved 1% w/v, uten alkali og uten oksidasjon. Den fargede kjemiske formen er metyltioniniumkationet med et kloridmotion, et lite, flatt fenotiazinfargestoff som i PubChems oppføring for metylenblått beskrives som metyltioniniumklorid. Som kation binder det seg til fosfatryggraden i nukleinsyrer og sure grupper på bakterielle cellevegger, slik at cellene blir blå mot en lys bakgrunn.

Fordelen er forutsigbarhet. Cellekjerner og bakterier fremstår som blå. Kontrasten er moderat. Lite fremtredende organismer kan farges svakt, og det er nettopp denne begrensningen Loeffler ønsket å løse. For den bredere familien av enkle bakteriefarginger som denne løsningen tilhører, se en oversikt over enkel bakteriefarging. Nøyaktig identifikasjon er fortsatt viktig her: Metylblått er et helt annet molekyl, slik metylblått sammenlignet med metylenblått forklarer. Et katalogsøk basert bare på fargenavnet kan derfor gi feil fargestoffklasse.

Loefflers alkaliske metylenblått: samme fargestoff, sterkere farging

Den klassiske Loeffler-oppskriften kombinerer en alkoholisk stamløsning av metylenblått med fortynnet alkali i vann. Lærebokversjoner angir 0.3 g fargestoff i 30 mL 95% etanol pluss 100 mL 0.01% vandig kaliumhydroksid (eller tilsvarende 30 mL mettet alkoholisk metylenblått, 100 mL destillert vann og 1 mL 1% KOH). Dette gir en bruksløsning med nær 0.3% fargestoff ved tydelig alkalisk pH. Kommersielle varianter følger det samme prinsippet, og Thermo Fishers katalog over mikrobiologiske fargestoffer oppfører Loefflers alkaliske metylenblått sammen med polykrome og vandige varianter som separate katalogartikler med ulike tiltenkte bruksområder.

Alkaliet er det sentrale i prinsippet. Når pH økes, deprotoneres karboksyl- og fosfatgrupper i prøven, slik at tettheten av negativt ladede bindingssteder øker. Samtidig holder den alkoholiske stamløsningen fargestoffet fullstendig oppløst, slik at det når disse stedene i monomer form. Resultatet er raskere og mer intens farging av bakterier enn et nøytralt, vandig fargestoff gir, med de velkjente dypblå stavene og kokkene i et rutinemessig bakteriologisk utstryk. Fargingstiden er vanligvis ett til tre minutter, etterfulgt av skylling med vann.

Det klassiske bruksområdet er Corynebacterium diphtheriae dyrket på Loefflers serummedium: slanke, ofte kølleformede staver med sterkt fargede metakromatiske Babes-Ernst-granula av lagret polyfosfat. Koblingen mellom medium og fargestoff er historisk; begge tilskrives den samme bakteriologen, og kontrasten i granulaene gir den diagnostiske gevinsten. Utover arbeid med difteri brukes fargestoffet som et generelt bakteriologisk fargestoff for utstryk fra kulturer, til å undersøke Neisseria-morfologi i kliniske utstryk og der Gram-farging er unødvendig, men vanlig vandig metylenblått gir for svak farging. Det er en monokrom farging. Alt som er surt, får en eller annen blånyanse. Når en protokoll krever fargedifferensiering, kan ikke alkali alene gi det.

Én praktisk advarsel: Alkaliske fargestoffløsninger forringes og danner utfellinger ved lagring og opptak av karbondioksid. Laboratorier tilbereder derfor enten beskjedne mengder eller kjøper katalogløsningen og overholder holdbarhetstiden, fremfor å holde liv i en gammel flaske som nå legger bunnfall på hvert objektglass.

Polykromt metylenblått: ett navn, flere fargestoffer

Polykromt metylenblått tar utgangspunkt i det samme fargestoffet, men utsetter det for kontrollert oksidasjon i alkali, historisk kalt modning eller polykromering. Alkalisk aldring, oppvarming med karbonat eller oksidasjon med midler som dikromat fjerner metylgrupper trinnvis fra dimetylaminosubstituentene. Produktet er en blanding: gjenværende metylenblått pluss azure B (én metylgruppe fjernet), azure A og azure C (videre demetylering), tionin (fullstendig demetylert) og oksidative biprodukter fra metylenfiolettfamilien. Hver komponent har sin egen fargetone og vevsaffinitet, slik at blandingen farger metakromatisk: Cellekjerner, granula, muciner og brusk får hver sine tydelige toner fra blått til rødlilla.

Denne kjemien er den samme som ligger bak de berømte blodfargingene. Tidlige forskere fant at alkalisert metylenblått farget cellekjernene til malariaparasitter i lillatoner, men de vandige, modnede løsningene var ustabile og dannet utfellinger i løpet av få dager. Gjennomgangen av hvordan den lilla blodfargingen ble oppfunnet beskriver hvordan Malachowski og Romanowsky uavhengig av hverandre utnyttet denne effekten i 1891, hvordan metanol ble innført for å stabilisere fargestoffutfellingen og fiksere utstryk uten varme, og hvordan Giemsa senere standardiserte blandingen rundt oppmålte mengder azure B og eosin med glyserol som stabilisator. Moderne fargestoffer av Giemsa-typen stammer direkte fra polykromt metylenblått pluss eosin, kombinasjonen som gir Romanowsky-effekten. For mer om kombinasjonen med eosin og azure B-komponenten, se fargestoffer av Romanowsky-typen og samspillet mellom azure B og eosin.

Fordi det er en blanding, er polykromt metylenblått i sin natur den minst standardiserte av de tre. Den nøyaktige balansen mellom fargetonene avhenger av oksidasjonsmetoden og hvor langt oksidasjonen har gått. Derfor selger histologileverandører det som et eget produkt med egen funksjonstesting, ikke som lagret Loefflers løsning. Typiske bruksområder omfatter metakromatisk påvisning av mastcellegranula, muciner og brusk, detaljer i plasmaceller og Helicobacter pylori i vevssnitt med polykrome metoder av Goodpasture-typen. Det er riktig valg når spørsmålet er differensiering etter farge, og feil valg når protokollen forventer en tydelig, monokrom bakteriesilhuett.

Sammenligning av formulering og bruksområde

Les tabellen som en beslutningsveiledning. Hvis prøven farges for svakt, endrer du pH-prinsippet og velger Loefflers. Hvis alt farges, men ingenting skiller seg ut, endrer du fargestoffprinsippet og velger polykromt metylenblått. Hvis et Loeffler-farget utstryk viser granula tydelig, men veilederen spør hvorfor cellekjerner og cytoplasma har samme blåfarge, er svaret at ingen alkalisk monokrom farging kan utføre den oppgaven. Det spørsmålet hører hjemme i den polykrome familien og dens avledede blodfargestoffer.

Slik unngår du de vanlige forvekslingene

To feil forklarer det meste av forvirringen. Den første er å behandle Loefflers som utbyttbar med vanlig metylenblått fordi begge ser blå ut i flasken. De er forskjellige i pH og intensitet, og hvis du erstatter Loefflers med et nøytralt fargestoff der Loefflers er angitt, mister du nettopp den granulakontrasten protokollen er utformet for. Den andre er å behandle enhver gammel eller utilsiktet aldret alkalisk blå løsning som polykrom. Ukontrollert aldring gir en ukjent blanding med ukjent styrke, mens ekte polykrome løsninger tilberedes med definerte oksidasjonsmetoder og, i blodfargingstradisjonen, kombineres med oppmålte mengder eosin. Historien er lærerik her: De ustabile, vandige, modnede løsningene fra 1890-årene ble erstattet av metanolstabiliserte formuleringer nettopp fordi ukontrollerte blandinger ikke kunne reproduseres. Det er verdt å huske før du farger et diagnostisk objektglass med en flaske av ukjent alder.

Nøyaktig navnebruk fullfører kontrollen. Bekreft katalogartikkelen (vandig, Loefflers eller polykrom), fargestoffinnholdet og det tiltenkte bruksområdet på etiketten, fremfor å trekke slutninger ut fra fargen. De tre formuleringene har en felles kromofor som utgangspunkt. De har ikke et felles bruksområde.