Farging av kinnceller med metylenblått: hva du skal observere

En elev legger en dråpe med en suspensjon av kinnceller på et objektglass, ser i mikroskopet og ser nesten ingenting. Noen få bleke skygger driver over et lyst synsfelt. Hun justerer fokus, øker deretter lyset og konkluderer så med at objektglasset er tomt. Objektglasset er ikke tomt. Cellene er der. De er nesten gjennomsiktige, og nettopp gjennomsiktigheten er problemet denne fargingen skal løse.

Det er verdt å sette ord på dette misforholdet mellom forventning og bilde før protokollen begynner. Nybegynnere forventer at et mikroskop skal vise detaljer slik kamerazoom gjør et fjernt skilt synlig. Et lysfeltmikroskop gjør noe mer avgrenset: Det viser forskjeller i lysabsorpsjon. En ufarget kinncelle absorberer nesten ikke lys og bidrar derfor med nesten ingen forskjell. Metylenblått skaper forskjellen. Det binder seg ujevnt inne i cellen og gjør struktur om til kontrast. Når elevene forstår dette prinsippet, fremstår hvert senere trinn som en konsekvens snarere enn en oppskrift.

Bakgrunnskunnskap om hvordan enkle farginger gir kontrast i skolelaboratoriet, er nyttig her, og en repetisjon av oppsett av et lysfeltmikroskop før farging forebygger halvparten av de mislykkede preparatene. Kjemien bak fargen hører hjemme i en innføring i metylenblått i mikroskopi, som forklarer hvorfor nettopp dette fargestoffet stadig dukker opp på laboratoriebenken.

Klasseromsprotokollen

Våtpreparatet nedenfor er det enklere standardvalget for vanlig undervisning. Det krever verken flamme eller fiksering. Varianten med fiksert utstryk, som brukes i enkelte laboratoriehåndbøker for høyere utdanning, legger til lufttørking og kort varmefiksering, som i øvelsen med kinncelleutstryk fra North Central Texas College, publisert via Biology LibreTexts, men varmefiksering er en mikrobiologisk praksis, ikke et krav for å se epitelceller.

Dette trenger du: rene objektglass og dekkglass, sterile engangspensler til prøvetaking (foretrukket) eller nye flate tannpirkere, en dråpeflaske med 0.5 til 1 prosent metylenblått i vannløsning, destillert eller avionisert vann, trekkpapir, hansker og et sammensatt lysmikroskop med 100x og 400x total forstørrelse.

1. Skyll munnen med rent vann. Dette fjerner matpartikler som senere tar opp mye farge og trekker oppmerksomheten bort fra cellene.
2. Hver elev tar bare prøve fra sitt eget kinn. Gni forsiktig på innsiden av kinnet med en ny steril prøvetakingspensel. Trykk, ikke skrap. Stopp lenge før det oppstår ubehag eller blødning.
3. Rull penselen over midten av et rent objektglass, slik at prøven fordeles i et tynt lag. En tynn film er den viktigste enkeltfaktoren for et preparat som lar seg tolke. Et tykt, hvitt belegg blir ved farging til en blå masse som ikke lar seg tolke.
4. Tilsett én dråpe metylenblått over utstryket. La det virke i 1 til 3 minutter. Ett minutt er tilstrekkelig i mange protokoller for høyere utdanning; NCERTs laboratoriehåndbok i naturfag for 9. klasse bruker omtrent 3 minutter for et midlertidig preparat. Lengre tid er ikke bedre, og overfarging er den vanligste feilen knyttet til tidsbruk.
5. Skyll forsiktig med destillert vann eller sug opp overskytende fargestoff med trekkpapir, i tråd med den lokale protokollen. Bakgrunnen skal bli blekblå, ikke mørk marineblå.
6. Senk et dekkglass på skrå slik at én kant berører først, og la det deretter falle langsomt ned. Dette hindrer luftbobler.
7. Begynn med lav forstørrelse for å finne cellene, kontroller fokus og sentrering, og gå deretter til 100x og til slutt 400x. Ved 400x skal du bare bruke finjusteringen.

Konsentrasjonen av fargestoffet fortjener en presisering. Skoleprotokoller bruker vanligvis rundt 1 prosent metylenblått i vannløsning. En sterkere stamløsning eller lengre eksponering gjør bakgrunnen mørkere raskere enn cellekjernen, slik at kontrasten øvelsen bygger på, snus.

Trygg håndtering av kinnprøver

Kinnprøver inneholder spytt og normale mikroorganismer fra munnen, så behandle hvert ferske utstryk som potensielt smittefarlig materiale selv om prøvegiverne er friske medelever. Retningslinjene for biosikkerhet i undervisningslaboratorier fra American Society for Microbiology beskriver de generelle prinsippene: Vurder risiko før økten, bruk hansker, beskytt øynene der det kan forekomme sprut, vask hendene etterpå, desinfiser benkene og kast forurenset engangsutstyr gjennom den godkjente ordningen for biologisk avfall.

Fire klasseromsregler dekker det meste av risikoen. Én prøvegiver per pensel og per objektglass, aldri deling. Bare prøvetaking fra eget kinn, aldri fra en medelev. Engangspensler og tannpirkere legges rett i den angitte avfallsbeholderen, aldri tilbake på benken. Metylenblått setter selv flekker på hud og klær og irriterer øynene, så hansker og vanlige hygienerutiner for håndtering av fargestoffer gjelder. Ikke utvid øvelsen til å dyrke noe fra utstryket, og ikke improviser varmefiksering av ferskt humant materiale utenfor skolens sikkerhetsprosedyre.

Hva du skal observere, og hvorfor det ser slik ut

Ved 100x ser du etter brede, flate, blekblå celler med uregelmessige ovale eller mangekantede omriss. De ligger enkeltvis eller i løse, overlappende flak. Hver celle har vanligvis én mørkere blå flekk. Denne flekken er cellekjernen. Legg også merke til hvordan cellene ligger: Plateepitelceller er tynne fliser, ikke kuler. Derfor ligner kantene deres sprukket glasur snarere enn runde ballonger.

Ved 400x kan tre kjennetegn skilles tydelig. Cellegrensen fremstår som en tynn, mørkere linje rundt cellen. Cytoplasmaet fyller innsiden med en lys, jevn blåfarge. Cellekjernen er mørkere og mer kompakt, ofte oval, vanligvis nær midten, men ikke alltid. Be elevene registrere alle tre, i tillegg til form og forstørrelse, fordi det er akkurat dette elevarket ber om.

Her er én presisering viktig, og mange elevark tar feil på dette punktet. Den synlige grensen tilsvarer området der plasmamembranen ligger, men selve membranen, et dobbelt lipidlag som er omtrent 7 til 10 nanometer tykt, er langt under det et skolemikroskop kan oppløse. Det elevene ser, er cellens optiske kant samt fargestoff som har samlet seg der. Det samme forbeholdet gjelder organeller. Mitokondrier, endoplasmatisk retikulum, golgiapparat og ribosomer er ikke synlige i dette preparatet. Et vanlig lysmikroskop kan under gode forhold skille detaljer ned til omtrent 0.2 mikrometer, slik NCBIs cellebiologiske bakgrunnsstoff om mikroskopiverktøy forklarer, og de fleste ultrastrukturer ligger under eller nær denne grensen. Ytterligere tom forstørrelse gjør bildet større uten å tilføre detaljer.

Hvorfor blir cellekjernen mørkest? Metylenblått er et kationisk fargestoff, positivt ladet i løsning, og det binder seg til negativt ladet materiale i cellen, fremfor alt nukleinsyrer. Kromatin konsentrerer DNA i cellekjernen, så kjernen samler mest fargestoff. Cytoplasma inneholder RNA og andre ladede molekyler og farges derfor også, men mer diffust og svakere. Det viktige forbeholdet: Metylenblått er ikke et DNA-spesifikt fargestoff. Forskning på fordelingen av metylenblått ved avbildning av cellekjerner beskriver hvordan kationet binder seg til nukleinsyrerike områder, og eldre kvantitativ forskning på binding av metylenblått i cellepreparater fant at mesteparten av det bundne fargestoffet var knyttet til nukleinsyrer. Mørk cellekjerne og lyst cytoplasma er derfor et kontrastmønster, ikke en molekylær analyse.

Feil elevene vil gjøre, og hvordan de kan tolkes

Nesten alle mislykkede preparater faller inn i ett av fem mønstre. Lær elevene å finne årsaken i preparatet i stedet for å gjenta fremgangsmåten blindt.

Overfarging gjør celler og bakgrunn jevnt mørke, slik at cellekjernen forsvinner i synsfeltet. Rett det opp med kortere fargetid eller grundigere skylling. Underfarging etterlater bleke skygger som forsvinner når lyset økes; forleng tiden i trinn på tretti sekunder. Tykke utstryk gir tette, overlappende masser der ingen omriss kan følges; løsningen er mekanisk: Fordel prøven tynnere neste gang, siden ingen skylling kan redde en haug med celler. Luftbobler fremstår som perfekte sirkler med skarpe, mørke kanter og distraherer nybegynnere som forveksler dem med strukturer; legg dekkglasset på nytt, langsomt og på skrå. Små mørke prikker spredt på eller rundt cellene er vanligvis normale bakterier fra munnen, slik skoleprotokoller som Ingrid Sciences fremgangsmåte for kinnceller påpeker. De bekrefter at munnen er bebodd, noe elevene kanskje husker godt, men de kan ikke artsbestemmes i denne øvelsen og skal ikke tegnes som celledeler. Matrester og slimtråder farges ujevnt og sterkt; skyllingen før prøvetaking skal redusere dem.

Hva denne øvelsen ikke kan gjøre

Dette er en observasjonsøvelse i undervisningen, ikke en diagnostisk test. Ingenting ved cellenes utseende i et farget klasseromspreparat kan diagnostisere infeksjon, kreft eller noen annen sykdom, og artikkelen skal ikke leses som om den antyder noe annet. Preparatet viser form, grense, cytoplasma og cellekjerne ved to forstørrelser. Det viser ikke membranens ultrastruktur, detaljer i organeller eller molekylær identitet. Å uttrykke begrensningen tydelig ivaretar både vitenskapen og elevene: Et godt resultat er en korrekt merket tegning med angitt forstørrelse og fargestoff, ikke en konklusjon om helse.

Elevark og merkede mikroskopibilder

De to prosjektressursene for denne siden er det merkede mikroskopibildet ovenfor og elevarket nedenfor. Skriv ut ett elevark per elev, eller vis det på skjerm og la elevene kopiere feltene til notatbøkene sine.

Slik bruker du det i en økt på 45 minutter: ti minutter til sikkerhetsgjennomgang og prøvetaking, ti minutter til farging og montering, femten minutter til observasjon og tegning ved begge forstørrelser, og ti minutter til sjekklisten og sammenligning med det merkede mikroskopibildet. Punktene på sjekklisten er bevisst konkrete. Tynt utstryk, riktig fargetid, cellekjerne mørkere enn cytoplasma, forstørrelse registrert. En elev som kan krysse av for alle fire, har forstått prinsippet undervisningen skal formidle: Mikroskoper viser forskjeller, og fargestoffer skaper forskjellene som er verdt å vise.