Enkel farging med metylenblått versus gramfarging: hva hver metode kan påvise

En student lager et utstryk fra en kultur merket E. coli, dekker det med metylenblått i ett minutt, skyller og ser gjennom oljeimmersjonsobjektivet. Blå staver dekker synsfeltet. I laboratorierapporten står det: «Gramnegative staver identifisert som E. coli.» Observasjonen er riktig. Preparatet gir ikke grunnlag for konklusjonen.

Feilen er begrepsmessig, ikke teknisk. Studenten behandlet en enkel farging som om den var en differensierende test. Enkel farging og gramfarging besvarer ulike spørsmål fordi de bygger på ulike fargingsprinsipper. Den ene spør: Hvilken form er til stede? Den andre spør: Hvordan reagerer celleveggen når den utsettes for en test? Bland dem sammen, og et korrekt farget preparat gir en rapport med en ubegrunnet konklusjon.

Denne sammenligningen holder de to metodene atskilt, viser hvilke utsagn hvert resultat gir grunnlag for, og besvarer de to spørsmålene studenter oftest stiller: Kan metylenblått brukes ved gramfarging, og hva viser egentlig farging av E. coli med metylenblått?

Det korte svaret

Enkel farging med metylenblått gir alle celler som lar seg farge, den samme blåfargen. Dermed viser den morfologi (staver, kuler, spiraler) og gruppering (enkeltvis, par, kjeder), men ingenting om gramkategori. Gramfarging inkluderer jod, et avfargingstrinn og en motfarging. Dermed skiller den bakterier i grampositive (lilla) og gramnegative (rosa eller røde) ut fra hvordan cellehylstrene holder på fargestoffet. Blå staver etter metylenblått betyr «stavformede celler er til stede». Rosa staver etter en full gramfargingssekvens betyr «gramnegative staver er til stede». Det andre utsagnet har et sterkere grunnlag fordi prosedyren har utført en ekstra test.

For den bredere gruppen av bakteriefargingsmetoder med ett fargestoff som denne artikkelen tilhører, se atlaset over farging for mikroskopi.

Enkel farging: ett fargestoff, ett spørsmål

Metylenblått er et basisk (kationisk) fargestoff. Det fargede ionet har positiv ladning og binder seg til negativt ladede strukturer i cellen, blant annet nukleinsyrer og sure overflategrupper. Cellene fremstår derfor som blå mot en lys bakgrunn. OpenStax beskriver dette prinsippet for positiv farging i kapittelet om farging. Selve fargestoffkationet er det lille, flate fenotiazinionet som beskrives nærmere i kjemireferansen for metylenblått; kloridmot-ionet står ikke for fargen.

En standard undervisningsprotokoll er bevisst enkel: Lag et tynt utstryk, la det lufttørke, varmefikser, dekk det med omtrent 1% metylenblått i vann i rundt ett minutt, skyll forsiktig med vann, tørk ved å trykke lett med absorberende papir, og undersøk med oljeimmersjon. En undervisningsprotokoll fra LibreTexts angir nettopp denne fremgangsmåten med 1% i ett minutt, samtidig som den bemerker at noen laboratorier bruker lengre tid. Ingen beisemiddel, ingen avfargingsmiddel, intet annet fargestoff. Nettopp dette fraværet er poenget. Med bare ett fargestoff og ingen selektiv fjerning får alle celler som binder fargestoffet, samme farge.

Med E. coli forventes et synsfelt med blå staver (basiller), enkeltvis, i par eller i små grupper. Blåfargen kommer fra fargestoffet. Stavformen kommer fra organismen. Men kombinasjonen identifiserer ikke organismen, fordi mange arter er stavformede, og mange staver blir blå ved enkel farging. ATCC gjør denne begrensningen til morfologi tydelig i sin veiledning for mikrobiologiske kulturer. En korrekt rapport sier: «Blå basiller observert.» Alt utover form og gruppering krever mer dokumentasjon.

Gramfarging: fire reagenser, én test av reaksjonsmåte

Gramfarging er en differensierende farging. Alle cellene gjennomgår den samme sekvensen, og man undersøker hvilke celler som beholder det første fargestoffet, og hvilke som mister det. Gramfargingsprotokollene fra American Society for Microbiology definerer standardrekkefølgen med fire trinn: krystallfiolett (primærfarging), Gram-jod (beisemiddel), alkohol eller aceton–alkohol (avfargingsmiddel), deretter safranin (motfarging).

Standardmodellen i undervisningen forklarer forskjellen ut fra cellehylsterets struktur. Grampositive celler har en tykk peptidoglykanvegg som dehydreres og holder på krystallfiolett–jod-komplekset under alkoholvasken. Gramnegative celler har et tynt peptidoglykanlag og en lipidrik ytre membran som avfargingsmiddelet bryter opp. Dermed vaskes komplekset ut, og cellene tar deretter opp safranin. Oversiktsartikkelen om gramfarging i NCBI Bookshelf gir denne forklaringen basert på celleveggen. Fagspesialister påpeker at den samlede fysikalske kjemien er mer komplisert enn veggtykkelsen alene, men ved praktisk laboratorietolkning gjelder regelen for reaksjonsmåten: Lilla betyr at fargestoffet er beholdt, rosa betyr at det er mistet og deretter erstattet ved motfarging.

Illustrasjoner. Stiliserte tegninger for sammenligning av metoder, ikke mikrofotografier tatt med kamera. Fargene er forenklet for å forklare prinsippet: én farge ved enkel farging, to farger etter avfarging i gramfargingsprosedyren.

Kan metylenblått brukes ved gramfarging

Dette spørsmålet kan forstås på to måter, og de krever ulike svar.

Den første tolkningen: Kan én påføring av metylenblått erstatte hele gramfargingssekvensen? Nei. Uten jod, avfargingsmiddel og motfarging finnes det ikke noe differensierende trinn, så ingen gramkategori blir testet. Et blått synsfelt etter bruk av bare metylenblått er et resultat av enkel farging, selv om flasken står ved siden av gramfargingsreagensene. Ikke registrer det som et gramfargingsresultat.

Den andre tolkningen: Kan metylenblått erstatte safranin som motfarging i trinn 4? Funksjonelt kan det farge de avfargede cellene, og en lærebokøvelse tilsier at et slikt bytte vil gi lilla grampositive celler og blå gramnegative celler. Resonnementet er holdbart fordi korrekt avfargede gramnegative celler er nesten fargeløse og vil ta opp et annet kationisk fargestoff. Men dette er ikke standardprotokollen. ASM-protokollene angir safranin, med anerkjente alternativer som basisk fuksin i enkelte varianter, ikke metylenblått. Det har også en praktisk ulempe: Blått mot lilla er vanskeligere å skille enn rosa mot lilla, særlig for nybegynnere og spesielt med svake mikroskoplamper. I undervisning og for alle resultater som har betydning, bør du bruke motfargingen protokollen angir, vanligvis safranin, og behandle motfarging med metylenblått som en demonstrasjonsvariant fremfor en likeverdig standard.

Det beslektede spørsmålet om hvordan metylenblått sammenlignes med andre alternativer med ett fargestoff, behandles i en sammenligning av enkle bakteriefarginger.

Hva farging av E. coli med metylenblått påviser, og hva den ikke påviser

E. coli er en gramnegativ stav, men denne setningen kombinerer fakta fra flere metoder: morfologi fra mikroskopi, gramreaksjon fra gramfarging og identitet fra dyrking kombinert med biokjemiske eller molekylære tester. Et utstryk farget med metylenblått bidrar bare med den første delen. Det fastslår at stavformede celler er til stede i den fargede prøven, og hvordan de er gruppert. Det fastslår ikke gramreaksjonen, fordi det ikke ble gjennomført noen avfargingstest. Det identifiserer ikke arten, fordi staver fra mange arter ser like ut ved denne oppløsningen.

Det er her rapporter feiler på en forutsigbar måte. Skribenten tar bakgrunnskunnskap («denne kulturen skal være E. coli, og E. coli er gramnegativ») inn i observasjonslinjen, slik at preparatet ser ut til å bekrefte det som egentlig bare ble antatt. En ryddigere rapport skiller mellom nivåene: «Enkel farging med metylenblått: blå basiller observert; kun morfologi, ingen gramkategori testet.» Deretter, dersom en gramfarging ble utført korrekt med kontroller: «Gramfarging: rosa staver, forenlig med gramnegative bakterier.» Artsidentiteten kommer senere, fra identifikasjonsprosessen, ikke fra fargen alene.

En praktisk tolkningsveiledning

Bruk denne beslutningsregelen ved laboratoriebenken. Hvis alle cellene har én farge og protokollen brukte ett fargestoff uten avfargingsmiddel, utførte du en enkel farging. Rapporter form, anslått størrelse og gruppering. Stopp der. Hvis protokollen brukte krystallfiolett, jod, avfargingsmiddel og motfarging med kjente positive og negative kontroller, utførte du en gramfarging. Rapporter farge sammen med morfologi: lilla kokker i kjeder, rosa staver og så videre.

Tre feil står for det meste av forvirringen. Den første er å overtolke blå staver som en bekreftelse på E. coli. Den andre er å føre et preparat farget med metylenblått under overskriften «Gramfarging» i en laboratorienotatbok, noe senere lesere vil feiltolke. Den tredje er å bytte motfarging uten videre og deretter sammenligne farger på tvers av laboratorier som om fargepalettene var like. Alle feilene har samme løsning: Oppgi metoden som faktisk ble utført, og hev bare det denne metoden tester.

Enkel farging har sin plass nettopp fordi den gir grunnlag for begrensede påstander. Den er rask, tåler mindre avvik og er tilstrekkelig når spørsmålet gjelder morfologi: Er det noe der, og hvilken form har det? Når spørsmålet gjelder klassifisering, må du utføre den differensierende testen. Det blå preparatet forteller deg hvordan cellene ser ut. Det lilla eller rosa preparatet forteller deg hvordan celleveggene reagerer. Ingen av preparatene forteller deg arten alene.