DNA နှင့် RNA အရောင်ဆိုးရန် မီသိုင်လင်းဘလူး အသုံးပြုခြင်း — ဂျယ်နှင့် အမြှေးပါးဆိုင်ရာ အသုံးချမှုများ

ကျောင်းသားတစ်ဦးက အဂါရို့စ်ဂျယ်တွင် အီလက်ထရိုဖိုရီစစ်လုပ်ပြီး မီသိုင်လင်းဘလူးဖြင့် အရောင်ဆိုးသည်။ ထင်ရှားသော အစင်းတစ်ခု ပေါ်မည်ဟု မျှော်လင့်ထားသည့် နေရာတွင် ဘာမျှမမြင်ရပါ။ ကပ်လျက်လုပ်ငန်းခွင်တွင် ပါရဂူဘွဲ့လွန် သုတေသီတစ်ဦးက ထိုအပြာရောင်ဆိုးဆေးပုလင်းကိုပင် သုံး၍ Northern အမြှေးပါးကို အရောင်ဆိုးရာ သုံးမိနစ်အတွင်း ပြတ်သားသော ရိုင်ဘိုဆိုမ်ဆိုင်ရာ အစင်းများကို ရရှိသည်။ ကျောင်းသားက ဂျယ်စမ်းသပ်မှု မအောင်မြင်ဟု ကောက်ချက်ချသည်။ ဂျယ်စမ်းသပ်မှု မအောင်မြင်ခြင်း မဟုတ်ပါ။ လုပ်ငန်းနှစ်ခု၏ ရည်ရွယ်ချက် ကွာခြားပြီး တူညီသောဆိုးဆေးက ထောက်လှမ်းနိုင်စွမ်း၊ နောက်ခံအရောင်နှင့် နောက်ဆက်တွဲလုပ်ငန်းအတွက် လိုက်နာရမည့် စည်းမျဉ်းများ မတူညီစွာဖြင့် ထိုလုပ်ငန်းနှစ်ခုကို ဖြေရှင်းပေးခြင်းဖြစ်သည်။

မီသိုင်လင်းဘလူးဖြင့် DNA အရောင်ဆိုးခြင်းနှင့် RNA အရောင်ဆိုးခြင်းတို့သည် ဓာတုအခြေခံတူသော်လည်း ရည်ရွယ်ချက် မတူပါ။ ဂျယ်အတွင်းတွင် ဆိုးဆေးက အပေါက်ငယ်များပါသော အခြေခံဖွဲ့စည်းပုံအတွင်း နျူကလိယစ်အက်ဆစ် မည်မျှရှိသည်ကို ဖော်ပြသည်။ အမြှေးပါးပေါ်တွင်မူ လွှဲပြောင်းမှု အောင်မြင်ခြင်းရှိမရှိနှင့် နမူနာလမ်းကြောင်းများတွင် ပမာဏညီမျှစွာ ထည့်ထားခြင်းရှိမရှိကို ဖော်ပြသည်။ ထိုကွာခြားချက်ကို ရှင်းလင်းစွာ နားလည်သည်နှင့် လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများ၊ ထောက်လှမ်းနိုင်သည့် ပမာဏကန့်သတ်ချက်များနှင့် လိုက်ဖက်မှု ကန့်သတ်ချက်များကို နားလည်ရန် လွယ်ကူလာသည်။

အကျဉ်းချုပ်အဖြေ

မီသိုင်လင်းဘလူးသည် ပြားချပ်သော ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် အပေါင်းဓာတ်ရှိသည့် ဆိုးဆေးဖြစ်သည်။ ဖော့စဖိတ်နှင့် လျှပ်စစ်ဓာတ်ဆွဲငင်မှု၊ ဘေ့စ်အတွဲများကြား ညှပ်ဝင်မှုနှင့် အကျဉ်းမြောင်းဘက် ချိုင့်ကြောင်းတွင် တွဲကပ်မှုတို့ ပေါင်းစပ်ကာ နျူကလိယစ်အက်ဆစ်များနှင့် ကိုဗေးလင့်နှောင်ကြိုး မဖွဲ့ဘဲ ပြန်လည်ခွဲထုတ်နိုင်သည့်ပုံစံဖြင့် တွဲကပ်သည်။ ထိုပြန်လည်ခွဲထုတ်နိုင်မှုသည် အဓိကအချက်ဖြစ်သည်။ အစင်းများကို မြင်နိုင်သည့်အလင်းဖြင့် အရောင်ဆိုးထားသည့်အတိုင်း ကြည့်ရှုမှတ်တမ်းတင်ပြီးနောက် မျိုးပွားကူးယူခြင်း၊ ဟိုက်ဘရစ်ဖွဲ့ခြင်း သို့မဟုတ် ပရုဘ်ဖြင့် ထပ်မံစစ်ဆေးခြင်းအတွက် အရောင်ချွတ်ခြင်း သို့မဟုတ် သန့်စင်ခြင်း ပြုလုပ်နိုင်သည်။

နှစ်ကြိုးတွဲ DNA ကို မီသိုင်လင်းဘလူးဖြင့် အဂါရို့စ်ဂျယ်အတွင်း အရောင်ဆိုးရာတွင် စံအမြန်နည်းသည် ရေတွင် 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ဖျော်၍ အရောင်ဆိုးချိန် 15 minutes ခန့်၊ ရေဖြင့် အရောင်ချွတ်ချိန် 15 minutes ခန့် ပြုလုပ်ပြီး အဖြူရောင်အလင်းပုံးပေါ်တွင် ကြည့်ရှုခြင်းဖြစ်သည်။ အမြှေးပါးများအတွက် မူလ Northern blot နည်းသည် pH 5.2 ဝန်းကျင်ရှိ ဆိုဒီယမ်အက်စီတိတ်တွင် ဆိုးဆေး 0.02 to 0.04 percent ဖျော်ကာ လွှဲပြောင်းပြီး နေရာတကျချည်နှောင်ထားပြီးနောက် မိနစ်အနည်းငယ် အရောင်ဆိုးခြင်း၊ ရေဆေးခြင်းနှင့် ဟိုက်ဘရစ်မဖွဲ့မီ အရောင်အပြည့်အဝ ချွတ်ခြင်းတို့ဖြစ်သည်။ ထောက်လှမ်းနိုင်စွမ်းမှာ အလယ်အလတ်သာရှိသည်။ အခြေအနေကောင်းများတွင် ဂျယ်အစင်းတစ်ခုလျှင် နာနိုဂရမ် ဆယ်ဂဏန်းမှ ရာဂဏန်းအထိ လိုအပ်ပြီး ပိုမိုသတိထားသတ်မှတ်ထားသော လမ်းညွှန်များတွင် 0.5 to 1 microgram ဟု ဖော်ပြထားသည်။ ထိုပမာဏသည် အီသီဒီယမ်ဘရိုမိုက်နှင့် SYBR ဆိုးဆေးများထက် ဆယ်ဆအဆင့်များစွာ ပိုများသည်။ အမြှေးပါးပေါ်တွင် ဆိုးဆေးက အဓိကအားဖြင့် များပြားစွာရှိသော ရိုင်ဘိုဆိုမ် RNA နှင့် ထည့်သွင်းထားသော စုစုပေါင်းပစ္စည်းကို ပြသသောကြောင့် ထရန်စခရစ်တစ်မျိုးတည်းအတွက် အသုံးဝင်သော ထောက်လှမ်းနိုင်သည့် အနည်းဆုံးပမာဏ မရှိပါ။ နည်းနှစ်မျိုးစလုံးတွင် လက်လီရောင်းချသည့် ဖြည့်စွက်စာသုံး ပျော်ရည်ကို အစားမထိုးပါနှင့်။ အတည်ပြုထားသော နည်းလမ်းများသည် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရေးအဆင့် ဆိုးဆေး၊ သတ်မှတ်ထားသော ဘပ်ဖာများနှင့် RNA ပါဝင်ပါက RNase ကင်းစင်သော ကိုင်တွယ်မှုကို အခြေခံထားသည်။

တွဲကပ်မှု မည်သို့ဖြစ်ပေါ်သနည်း၊ မည်သည့်နေရာတွင် နားလည်မှုလွဲစေနိုင်သနည်း

အသုံးဝင်သော ရှင်းလင်းဖော်ပြမှုပုံစံတွင် အပိုင်းသုံးပိုင်းရှိသည်။ ပထမ၊ အပေါင်းဓာတ်ရှိသော ကွင်းဖွဲ့စည်းပုံကို အနုတ်ဓာတ်ရှိသော ဖော့စဖိတ်ကျောရိုးက ဆွဲငင်သည်။ ဆားပါဝင်မှုနည်းသည့်အခါ ထိုလျှပ်စစ်ဓာတ်ဆွဲငင်မှုက အဓိကဖြစ်ကြောင်း ရောင်စဉ်လေ့လာမှုများက တွေ့ရှိထားသည်။ တစ်ဖက်တွင် မော်ဒယ်ပြုလုပ်မှုနှင့် မော်လီကျူးလှုပ်ရှားမှု လေ့လာချက်များအရ ဘေ့စ်အတွဲကြား ညှပ်ဝင်ခြင်းနှင့် အကျဉ်းမြောင်းဘက် ချိုင့်ကြောင်းတွင် တွဲကပ်ခြင်းတို့သည် နှစ်ကြိုးတွဲ DNA အတွက် တည်ငြိမ်သော ပုံစံများဖြစ်သည်။ ယင်းကို မီသိုင်လင်းဘလူးနှင့် DNA တွဲကပ်မှုဆိုင်ရာ ရောင်စဉ်လေ့လာချက် တွင် အကျဉ်းချုပ်ဖော်ပြထားသည်။ ဒုတိယ၊ GC ကို အနည်းငယ်ပိုနှစ်သက်သော သဘောရှိသည်။ မီသိုင်လင်းဘလူး၏ ဘေ့စ်အတွဲကြား ညှပ်ဝင်မှုဆိုင်ရာ ဦးစားပေးရွေးချယ်မှုများ လေ့လာချက်တွင် မော်ဒယ်များက CpG နှင့် GpC အဆင့်များကို ပိုနှစ်သက်ကြောင်းနှင့် စမ်းသပ်မှုများက GC များသော နှစ်ကြိုးတွဲများနှင့် ပိုမိုတွဲကပ်ကြောင်း ဖော်ပြထားသော်လည်း AT နှစ်ကြိုးတွဲများနှင့်လည်း တွဲကပ်သည်။ ပုံမှန်အရောင်ဆိုးခြင်းသည် ဘေ့စ်အစဉ်လိုက်အပေါ် သီးသန့်မူတည်ခြင်း မဟုတ်ပါ။ တတိယ၊ တစ်ကြိုးတည်း DNA နှင့် RNA တို့တွင် လျှပ်စစ်ဓာတ်ဆွဲငင်မှုနှင့် ထိတွေ့နိုင်သော ဘေ့စ်များ၊ နှစ်ကြိုးတွဲအပိုင်းများနှင့် ထပ်ဆင့်စီတန်းတွဲကပ်မှုတို့က အဓိကဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် အရောင်ဆိုးအားသည် အလျား၊ ဘေ့စ်အစဉ်နှင့် ဒုတိယအဆင့်ဖွဲ့စည်းပုံအလိုက် ကွာခြားသည်။

ထိုမှ အကျိုးဆက်နှစ်ခု ဖြစ်ပေါ်သည်။ တွဲကပ်မှုသည် ကိုဗေးလင့်နှောင်ကြိုး မဟုတ်သောကြောင့် ဆိုးဆေးကို ဆေးချနိုင်သည်။ တမင်အတည်တကျ မထိန်းထားလျှင် ပေါလီအက်ခရီလမိုက် အစင်းများ လျင်မြန်စွာ မှိန်သွားသည်။ ပုံမှန်အရောင်ဆိုးမှုသည် ယာယီသာဖြစ်သောကြောင့် အမြဲတမ်းအတည်တကျ ထိန်းထားသည့် သီးခြားနည်းမျိုး ရှိနေခြင်းဖြစ်ကြောင်း PAGE ဂျယ်များအတွက် Soto နှင့် Draper ၏ ဖော်ပြချက် တွင် ရှင်းပြထားသည်။ ဆိုးဆေးသည် အလင်းဖြင့် ဓာတုတုံ့ပြန်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသော ပစ္စည်းဖြစ်သဖြင့် အောက်ဆီဂျင်ရှိချိန်တွင် အရောင်ဆိုးထားသော DNA ကို တောက်ပသည့်အလင်းဖြင့် ကြာမြင့်စွာ ထွန်းပေးပါက ဂွါနင်းကို အောက်စီဒေးရှင်းဖြစ်စေနိုင်ပြီး နောက်ဆုံးတွင် ကြိုးတစ်ဖက်၌ ပြတ်ရာများ ဖြစ်လာနိုင်သည်။ ထိုဖြစ်စဉ်ကို မီသိုင်လင်းဘလူးဖြင့် လှုံ့ဆော်သော ဂွါနင်းအောက်စီဒေးရှင်း ဆိုင်ရာ လေ့လာချက်တွင် အသေးစိတ်ဖော်ပြထားသည်။ အဖြူရောင်အလင်းဖြင့် ခဏတာကြည့်ရှုခြင်းသည် မူလအီသီဒီယမ်ဘရိုမိုက် လုပ်ငန်းစဉ်များတွင် လူသိများသော UV ကြောင့် ပျက်စီးမှုကို ရှောင်ရှားနိုင်ပြီး နောက်ထပ်အသုံးပြုရန် ပြန်လည်ထုတ်ယူမှုအတွက် ယင်းအားသာချက်သည် အမှန်တကယ်ရှိသည်။ မြင်နိုင်သည့်အလင်းသည် ပိုနူးညံ့သော်လည်း အန္တရာယ်လုံးဝကင်းခြင်း မဟုတ်ပါ။ DNA ကို မျိုးပွားကူးယူမည်ဆိုပါက အလင်းထိတွေ့ချိန်ကို တိုတောင်းစွာထားပါ။ ထိုသတိပေးချက်၏ နောက်ခံ အလင်းဓာတုဗေဒကို ပိုမိုသိလိုပါက မီသိုင်လင်းဘလူး အလင်းဓာတုဗေဒ၏ လမ်းကြောင်းနှစ်ခု ကို ကြည့်ပါ။ အောက်စီဒေးရှင်းဖြစ်ထားသော ပုံစံက တွဲကပ်ပြီး ရီဒတ်ရှင်းဖြစ်ထားသော ပုံစံက မတွဲကပ်ရခြင်းကို ရှင်းပြသည့် အောက်စီဒေးရှင်း-ရီဒတ်ရှင်း အတွဲနှင့် လျှပ်စစ်ဓာတ်အခြေအနေများအတွက် မီသိုင်လင်းဘလူး၏ ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ဂုဏ်သတ္တိများဆိုင်ရာ ဓာတုဗေဒ ကို ကြည့်ပါ။

လုပ်ငန်းတစ် — ဂျယ်အတွင်း အရောင်ဆိုးခြင်း

ဂျယ်အရောင်ဆိုးခြင်းက မေးခွန်းတစ်ခုကို ဖြေပေးသည်။ ယင်းအစင်းတွင် မျက်စိဖြင့် မြင်နိုင်လောက်အောင် နျူကလိယစ်အက်ဆစ် ပမာဏရှိသလားဟူ၍ ဖြစ်သည်။ အဂါရို့စ်အတွင်းရှိ နှစ်ကြိုးတွဲ DNA သည် အသေးစိတ်ဆုံး လေ့လာထားသော အခြေအနေဖြစ်သည်။ Flores နှင့် လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များ၏ မူလမီသိုင်လင်းဘလူး ဂျယ်နည်းလမ်း သည် 1 percent အဂါရို့စ်တွင် 0.02 percent အမြန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး နောက်ပိုင်း ပြန်လည်ထုတ်ယူခြင်းနှင့် မျိုးပွားကူးယူခြင်း အောင်မြင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ အလားတူ ပေးသွင်းသူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို IBI Scientific မီသိုင်လင်းဘလူး ထုတ်ကုန်စာမျက်နှာ တွင် တွေ့နိုင်ပြီး 0.04 percent အမြှေးပါးနည်းနှင့် အမြန်ဂျယ်နည်းတို့ကို ယှဉ်တွဲဖော်ပြထားသည်။

လက်တွေ့လုပ်ငန်းစဉ် —

1. ဂျယ်ကို ပုံမှန်အတိုင်း အီလက်ထရိုဖိုရီစစ်လုပ်ပါ။ ပြင်ဆင်ထားသော နည်းအတွက် လွှဲပြောင်းမှု သို့မဟုတ် ခွဲခြားပြတ်သားမှုကို အတည်ပြုထားခြင်း မရှိလျှင် အီလက်ထရိုဖိုရီစစ် လုပ်နေစဉ်မဟုတ်ဘဲ ပြီးနောက်မှ အရောင်ဆိုးပါ။
2. ပေါင်းခံရေတွင် ဖျော်ထားသော 0.02 percent w/v မီသိုင်လင်းဘလူးထဲ၌ ညင်သာစွာ လှုပ်ပေးလျက် 15 minutes ခန့် စိမ်ပါ။
3. အခြေခံဖွဲ့စည်းပုံ၏ နောက်ခံအရောင် လျော့ကျပြီး အစင်းများ ထင်ရှားလာသည်အထိ ရေအကြိမ်ကြိမ်လဲ၍ စုစုပေါင်း 15 minutes ခန့် အရောင်ချွတ်ပါ။
4. အဖြူရောင်အလင်းပေးကိရိယာပေါ်တွင် ချက်ချင်း ဓာတ်ပုံရိုက်ပါ။

အဂါရို့စ်နှင့် ပေါလီအက်ခရီလမိုက်တို့၏ အပြုအမူ မတူပါ။ အဂါရို့စ်သည် အခြေခံဖွဲ့စည်းပုံအတွင်း ဆိုးဆေးကို ထိန်းထားသဖြင့် အရောင်ချွတ်ခြင်းက အချိန်ကြာသည့်အဆင့်ဖြစ်သည်။ ပါးလွှာသော ပေါလီအက်ခရီလမိုက်ဂျယ်များသည် အရောင်ဆိုးလွယ်သော်လည်း ဆိုးဆေးလည်း လျင်မြန်စွာ ဆုံးရှုံးသည်။ ယင်းသည် နောက်ထပ်အသုံးပြုရန် အစင်းဖြတ်ထုတ်မှုကို အထောက်အကူပြုသော်လည်း ရေရှည်မှတ်တမ်းထားရှိမှုအတွက် အဆင်မပြေပါ။ အတည်ပြုထားသော Current Protocols ပုံစံ PAGE နည်းများအတိုင်း ပေါလီအက်ခရီလမိုက်အတွင်းရှိ ဓာတုနည်းဖြင့် ဖန်တီးထားသော အိုလီဂိုနျူကလီယိုတိုက်များကို တူညီသော 0.02 percent နည်းဖြင့် ရေအကြိမ်ကြိမ်ဆေးကာ 20 to 30 minutes အတွင်း ရှာဖွေနိုင်သည်။ နောက်ထပ်အသုံးပြုမည့် အိုလီဂိုများအတွက် ပျော့သော TBE တွင် 0.0002 percent ဝန်းကျင်ရှိ အလွန်ပျော့သော နည်းမျိုးများကို နာရီအတော်ကြာ အသုံးပြုကြောင်း အစီရင်ခံထားသော်လည်း သက်သေအထောက်အထား အခြေခံမှာ ပိုအားနည်းသည်။

DNA နှင့် RNA တို့၏ ကွာခြားချက်က အရေးပါသည်။ နှစ်ကြိုးတွဲ DNA သည် ဖွဲ့စည်းပုံအလိုက် အခိုင်မာဆုံး တွဲကပ်မှုကို ပေးသည်။ RNA နှင့် တစ်ကြိုးတည်း DNA တို့လည်း အရောင်စွဲသော်လည်း ပိုအားနည်းပြီး ခန့်မှန်းရခက်သည်။ ဖော်မယ်လ်ဒီဟိုက်ပါ အဂါရို့စ် RNA ဂျယ်များအတွက် ဓာတ်ခွဲခန်းအများစုသည် ဂျယ်အတွင်း အပြာရောင်ဆိုးခြင်းကို ကျော်၍ RNA ကို အမြှေးပါးသို့ ဦးစွာလွှဲပြောင်းပြီး ထိုနေရာတွင် အရောင်ဆိုးသည်။ ထိုသို့လုပ်ခြင်းက အားနည်းသော ဂျယ်အချက်ပြကို ပိုပြတ်သားသော အမြှေးပါးအချက်ပြနှင့် နမူနာထည့်သွင်းမှု မှတ်တမ်းတို့ဖြင့် အစားထိုးပေးသည်။

လုပ်ငန်းနှစ် — အမြှေးပါးပေါ်တွင် အရောင်ဆိုးခြင်း

အမြှေးပါးအရောင်ဆိုးခြင်းက မတူသော မေးခွန်းကို ဖြေပေးသည်။ လွှဲပြောင်းမှု အောင်မြင်သလား၊ နမူနာလမ်းကြောင်းများကို နှိုင်းယှဉ်နိုင်သလားဟူ၍ ဖြစ်သည်။ မူလအသုံးချမှုမှာ Herrin နှင့် Schmidt ၏ ပြန်လည်ဖယ်ရှားနိုင်သော Northern blot အရောင်ဆိုးနည်းဖြစ်သည်။ မူလနည်းတွင် pH 5.0 ရှိ 50 mM ဆိုဒီယမ်အက်စီတိတ်ထဲ၌ ဆိုးဆေး 0.04 percent ဖြင့် 2 to 3 minutes အရောင်ဆိုးကာ ရေဆေးပြီး ဟိုက်ဘရစ်မဖွဲ့မီ SSPE ထဲရှိ ပျော့သော SDS ဖြင့် ဖယ်ရှားနိုင်သည်။

ကျယ်ပြန့်စွာ အသုံးပြုသော ခေတ်မီနည်းမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်။

1. RNA သို့မဟုတ် မူလဖွဲ့စည်းပုံ ဖြေလျော့ထားသော DNA ကို နိုင်လွန် သို့မဟုတ် နိုက်ထရိုဆယ်လူလိုစ်သို့ လွှဲပြောင်းပါ။ ထို့နောက် အရောင်ဆိုးစဉ် နမူနာ မဆုံးရှုံးစေရန် UV ဖြင့် အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ခြင်း သို့မဟုတ် အပူပေးခြင်းဖြင့် နေရာတကျ ချည်နှောင်ထားပါ။
2. မဖြစ်မနေမဟုတ်သော်လည်း အသုံးများသောအဆင့် — အမြှေးပါးကို 5 percent အက်စီတစ်အက်ဆစ်တွင် 15 minutes ခန့် စိုစွတ်စေပါ။
3. pH 5.2 ဝန်းကျင်ရှိ 0.3 to 0.5 M ဆိုဒီယမ်အက်စီတိတ်ထဲ၌ မီသိုင်လင်းဘလူး 0.02 to 0.04 percent ဖြင့် 5 to 10 minutes အရောင်ဆိုးပါ။
4. ရေဆေးပြီး ရေထဲတွင် 5 to 15 minutes အရောင်ချွတ်ကာ မှတ်တမ်းတင်ပါ။ ထို့နောက် ဟိုက်ဘရစ်မဖွဲ့မီ ကျန်ရှိသည့် ဆိုးဆေးကို ဖယ်ရှားပါ။

Northern လုပ်ငန်းများတွင် အပေါင်းဓာတ်ရှိသော နိုင်လွန်ကို အများဆုံးသုံးသည်။ နိုက်ထရိုဆယ်လူလိုစ်ကိုလည်း တူညီသော အက်စီတစ်အက်ဆစ်နှင့် အက်စီတိတ်လုပ်ငန်းစဉ်ဖြင့် အသုံးပြုနိုင်သည်။ ပုံရိပ်ကို လွှဲပြောင်းမှု အတည်ပြုရန်၊ 28S နှင့် 18S အစင်းများ (သို့မဟုတ် ဘက်တီးရီးယား RNA အတွက် 23S နှင့် 16S) ကို နှိုင်းယှဉ်ရန်၊ အရွယ်အစားအဆင့်ပြ နမူနာများနှင့် စံနမူနာများကို မှတ်သားရန်၊ စုစုပေါင်း RNA ပမာဏ ညှိနှိုင်းစံပြုမှု အကြမ်းဖျဉ်းမှတ်တမ်း ထားရှိရန် အသုံးပြုသည်။ ထုတ်ဝေထားသော Northern နည်းလမ်းများတွင် နမူနာထည့်သွင်းမှုပမာဏကို စစ်ဆေးရန် အရောင်ဆိုးထားသော ရိုင်ဘိုဆိုမ်အစင်းများကို ပမာဏတွက်ချက်ကြသည်။ ယင်းတို့တွင် ပမာဏညှိနှိုင်းစံပြုရန် မီသိုင်လင်းဘလူးဖြင့် ဆိုးထားသော ရိုင်ဘိုဆိုမ်အစင်းများကို အသုံးပြုသည့် နို့ထွက်ပစ္စည်းသိပ္ပံဆိုင်ရာ လေ့လာချက်လည်း ပါဝင်သည်။ Southern အမြှေးပါးများကိုလည်း အလားတူ မြင်သာအောင် ပြုလုပ်နိုင်သော်လည်း ဆိုးဆေးကို Northern နမူနာထည့်သွင်းမှုနှင့် လွှဲပြောင်းမှုစစ်ဆေးရန် ပိုမိုခိုင်မာစွာ အသုံးပြုလာခဲ့သည်။ ထို့အပြင် Southern DNA ကို မလွှဲပြောင်းမီ မူလဖွဲ့စည်းပုံ ဖြေလျော့ထားသဖြင့် ဂျယ်ထောက်လှမ်းနိုင်စွမ်း ကိန်းဂဏန်းများကို တိုက်ရိုက်အသုံးမချနိုင်ပါ။

ထောက်လှမ်းနိုင်သည့် ပမာဏကန့်သတ်ချက်နှင့် နောက်ခံအရောင် — အပြာရောင်ဆိုးဆေး အားနည်းသည့်နေရာ

အောက်ပါနှိုင်းယှဉ်ချက်ကို ရည်ရွယ်ချက်ရှိရှိ အကြမ်းဖျဉ်းသာ ဖော်ပြထားသည်။ ဆိုးဆေး၏ စွမ်းဆောင်ရည်သည် ဂျယ်ရာခိုင်နှုန်း၊ အစင်းအကျယ်၊ အလင်းကြည့်စနစ်နှင့် အရောင်ချွတ်မှုကို စနစ်တကျ လုပ်ဆောင်ခြင်းတို့အပေါ် မူတည်သည်။ ကိန်းဂဏန်းတစ်ခုစီကို တိကျသော သတ်မှတ်ချက်အဖြစ်မဟုတ်ဘဲ ပမာဏအဆင့်တစ်ခုအဖြစ် သဘောထားပါ။

နောက်ခံအရောင် ထိန်းချုပ်မှုက အလယ်အလတ်သာရှိသော အချက်ပြကို အသုံးပြုနိုင်ခြင်းရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ပေးသည်။ လွတ်နေသော ဆိုးဆေးသည် အရောင်အလွန်ပြင်းသောကြောင့် တွဲကပ်နေသည့် ဆိုးဆေးကို မဖယ်ရှားဘဲ မတွဲကပ်သည့် ဆိုးဆေးကို ဖယ်ရှားခြင်းမှ အရောင်ကွာခြားချက် ရရှိသည်။ ပိုပြင်းသော ဆိုးဆေးက ထောက်လှမ်းနိုင်စွမ်းကို တိုးပေးခဲသည်။ အဓိကအားဖြင့် အရောင်ချွတ်ချိန်ကိုသာ တိုးစေသည်။ အသုံးပြုမည့် ဂျယ်၊ အမြှေးပါးနှင့် ကင်မရာအတိအကျဖြင့် အဆင့်ဆင့်ဖျော့ထားသော နမူနာစီးရီးကို စမ်းသပ်ပါ။ တစ်စုတစ်စည်းတည်း တွက်ချက်ထားသော အရောင်သိပ်သည်းမှုသည် ထည့်သွင်းပမာဏနှင့် အချိုးကျနေသော အပိုင်းအခြားကိုသာ သုံးပါ။ မီသိုင်လင်းဘလူးသည် နမူနာထည့်သွင်းမှုပမာဏကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ပမာဏတွက်ချက်၍ ညှိနှိုင်းစံပြုရန် အထောက်အကူပြုသည်။ အမြှေးပါး၏ လက်ခံနိုင်စွမ်း၊ လွှဲပြောင်းထိရောက်မှု၊ ပြည့်ဝမှုနှင့် အရောင်ချွတ်မှုတို့သည် နမူနာလမ်းကြောင်းတစ်ခုနှင့်တစ်ခု ကွာခြားသောကြောင့် တိုင်းတာနိုင်သည့် ပမာဏအပိုင်းအခြား ကျယ်ပြန့်သော ပမာဏတွက်ချက်စမ်းသပ်မှု မဟုတ်ပါ။

လိုက်ဖက်မှု ကန့်သတ်ချက်များ — အရောင်ဆိုးပြီးနောက် မည်သည့်လုပ်ငန်းများ ဆက်လုပ်နိုင်သနည်း

အပြာရောင်ဆိုးပြီးနောက် မျိုးပွားကူးယူနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။ Flores နှင့် လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များသည် အရောင်ဆိုးထားသော အဂါရို့စ်အစင်းများကို ဖြတ်ထုတ်၍ DNA ကို ပြန်လည်ထုတ်ယူကာ ဆက်ချိတ်ပြီး ဆဲလ်အတွင်း ထည့်သွင်းခဲ့ကြသည်။ အီသီဒီယမ်ဘရိုမိုက်နှင့် UV သုံးပြီးနောက်ထက် မျိုးပွားကူးယူမှု ပိုကောင်းကြောင်း အစီရင်ခံထားသည်။ ဖြစ်နိုင်ခြေများသော အကြောင်းရင်းမှာ ဆိုးဆေးကိုယ်တိုင်၏ အကျိုးကျေးဇူးကြောင့်မဟုတ်ဘဲ အလင်းကြောင့် ပျက်စီးမှု ပိုနည်းခြင်းဖြစ်သည်။ အဖြူရောင်အလင်း ထိတွေ့ချိန်ကို တိုတောင်းစွာထားပြီး ပြန်လည်ထုတ်ယူထားသော DNA ကို ပုံမှန်ဂျယ်ထုတ်ယူသန့်စင်မှုဖြင့် သန့်စင်ပါ။

PCR နှင့် ဘေ့စ်အစဉ်ဖတ်ခြင်းအတွက် သက်သေအထောက်အထား ပိုနည်းသည်။ ကျန်ရှိသည့် ဆိုးဆေးသည် နျူကလိယစ်အက်ဆစ်များနှင့် တွဲကပ်သောကြောင့် အင်ဇိုင်းအသုံးပြုသည့် အဆင့်များမတိုင်မီ အရောင်ချွတ်ပြီး သန့်စင်ပါ။ အပြာရောင်ဂျယ်မှ မှန်ကန်စွာ သန့်စင်ထားသော DNA သည် အသုံးပြုနိုင်မည်ဟု မျှော်လင့်ရသော်လည်း ပေါလီမာရေ့စ်အမျိုးမျိုးနှင့် ဘေ့စ်အစဉ်ဖတ်သည့် ဓာတုစနစ်အမျိုးမျိုးတွင် ဆိုးဆေးတိုက်ရိုက် ပါလာမှုကို မည်မျှခံနိုင်သည်ကို ကောင်းစွာ ပမာဏသတ်မှတ်မထားပါ။ အလိုအလျောက် အဆင်ပြေမည်ဟု မယူဆပါနှင့်။

ဘလော့ဟိုက်ဘရစ်ဖွဲ့ခြင်းသည် အစဉ်ကို တိတိကျကျ လိုက်နာသည့်အခါ လိုက်ဖက်သည် — လွှဲပြောင်းခြင်း၊ နေရာတကျချည်နှောင်ခြင်း၊ အရောင်ဆိုးခြင်း၊ မှတ်တမ်းတင်ခြင်း၊ အရောင်ချွတ်ခြင်း၊ ဟိုက်ဘရစ်ဖွဲ့ခြင်း။ ယင်းအစဉ်သည် Herrin နှင့် Schmidt ၏ နည်းဒီဇိုင်းဖြစ်သည်။ မလွှဲပြောင်းမီ အရောင်ဆိုးခြင်း သို့မဟုတ် အရောင်ချွတ်ခြင်းကို ကျော်ခြင်းသည် မတူသောနည်းလမ်းဖြစ်ပြီး သီးခြားအတည်ပြုရန် လိုအပ်သည်။ ဆိုးဆေးဖယ်ရှားပြီးနောက် စံပရုဘ်ဖယ်ရှားခြင်းနှင့် ပရုဘ်ဖြင့် ထပ်မံစစ်ဆေးခြင်းကို ပုံမှန်အတိုင်း ဆက်လုပ်နိုင်သည်။ တူညီသော ဆိုးဆေးမျိုးစုဖြင့် ဆဲလ်အဆင့် အရောင်ဆိုးခြင်းနှင့် အတည်တကျထိန်းထားသော နမူနာအလွှာဆိုင်ရာ သဘောတရားကို သက်ရှိဆဲလ်နည်းများတွင် တိုက်ရိုက်အသုံးမချနိုင်ရခြင်းအတွက် အဏုကြည့်အရောင်ဆိုးခြင်း လမ်းညွှန်ပုံစု ကို ကြည့်ပါ။

အမြဲတမ်းအတည်တကျ ထိန်းထားသည့် နည်းမျိုးကို ရှောင်လျှင် နောက်ထပ်အသုံးပြုရန် အဂါရို့စ်နမူနာများနှင့် အပြာရောင်ဆိုးဆေးဖြင့် နေရာရှာထားသော PAGE အိုလီဂိုများကို အစင်းဖြတ်ထုတ်နိုင်သည်။ အရောင်ချွတ်ပြီးနောက် လျှပ်စစ်အားဖြင့် ထုတ်ယူခြင်းသည် ပြန်လည်ခွဲထုတ်နိုင်သော တွဲကပ်ပစ္စည်းအတွက် ဓာတုဗေဒအရ ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော်လည်း မီသိုင်လင်းဘလူးအတွက် သီးသန့်ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်ထားသော ရရှိပမာဏဆိုင်ရာ ဒေတာ နည်းပါးသည်။ ထုတ်ယူပြီးနောက် ဆားဖယ်ရှားပါ သို့မဟုတ် အနည်ချပါ။

ထပ်တလဲလဲ ဖြစ်တတ်သော ပြဿနာများ

ဂျယ်အစင်းများ မှိန်နေခြင်းသည် ပုံမှန်အားဖြင့် အရောင်ဖြင့်ကြည့်ရသော ဆိုးဆေးအတွက် ပစ္စည်းပမာဏ နည်းလွန်းခြင်းကို ဆိုလိုသည်။ အထူးသဖြင့် တိုသော တစ်ကြိုးတည်း နမူနာများ သို့မဟုတ် RNA ပစ်မှတ်များတွင် ဖြစ်သည်။ နမူနာပိုထည့်ပါ၊ လတ်ဆတ်သော ဆိုးဆေးသုံးပါ၊ ဆိုးဆေးပြင်းအား မတိုးမီ အရောင်ဆိုးချိန် တိုးပါ၊ အရောင်ချွတ်ခြင်းကို ပိုစောစွာ ရပ်ပါ။ ဂျယ်တစ်ခုလုံး အပြာရောင်ဖြစ်၍ အရောင်ကွာခြားမှု မရှိခြင်းသည် ပုံမှန်အားဖြင့် အရောင်ဆိုးလွန်ခြင်း သို့မဟုတ် ရေလဲသည့်အကြိမ် နည်းလွန်းခြင်းဖြစ်သည်။ PAGE အစင်းများ မှိန်သွားခြင်းသည် မျှော်လင့်ထားသည့် ဓာတုသဘောဖြစ်ပြီး အရောင်ဆိုးမှု မအောင်မြင်ခြင်း မဟုတ်ပါ။ ဓာတ်ပုံကို မြန်မြန်ရိုက်ပါ။ အမြှေးပါးနောက်ခံအရောင် မညီခြင်းသည် ခေါက်ရာများ၊ လေပူဖောင်းများ၊ လက်ဗွေရာများ၊ လှုပ်ပေးမှု မညီခြင်း သို့မဟုတ် အကွက်လိုက်သာ လွှဲပြောင်းထားခြင်းကို ညွှန်ပြသည်။ ဟိုက်ဘရစ်ဖွဲ့ခြင်းဆိုင်ရာ ထိန်းချုပ်နမူနာမရှိဘဲ ယင်းကို နမူနာထည့်သွင်းမှုပမာဏ မညီခြင်းဟု မကောက်ယူပါနှင့်။ မှိန်၍ ပြန့်ကျဲနေသော ရိုင်ဘိုဆိုမ်အစင်းပုံစံသည် ပြိုကွဲမှုကို ဆိုလိုနိုင်သော်လည်း လွှဲပြောင်းမှု မပြည့်စုံခြင်း၊ စုစုပေါင်း RNA နည်းလွန်းခြင်း (ပုံမှန်နမူနာလမ်းကြောင်းများတွင် မိုက်ခရိုဂရမ် အနည်းငယ်မှ ဆယ်ဂဏန်းအထိ ပါဝင်သည်) သို့မဟုတ် အရောင်ချွတ်လွန်ခြင်းလည်း ဖြစ်နိုင်သည်။ ဆိုးဆေးက များပြားစွာရှိသော ရိုင်ဘိုဆိုမ် RNA ကို ဖော်ပြသည်။ သီးခြားထရန်စခရစ်တစ်မျိုးကို မဖော်ပြပါ။ ထိုအလုပ်သည် ပရုဘ်၏ တာဝန်ဖြစ်သည်။

ချဲ့ကားမပြောဘဲ ဘေးကင်းရေးနှင့် ကိုင်တွယ်မှုကို ရှင်းပြခြင်း

မီသိုင်လင်းဘလူးသည် အီသီဒီယမ်ဘရိုမိုက်ထက် ကိုင်တွယ်ရ ပိုလွယ်သော်လည်း အန္တရာယ်ကင်းသော ပစ္စည်း မဟုတ်ပါ။ လက်ရှိ MilliporeSigma ဘေးကင်းရေးဒေတာစာရွက်တွင် ဆိုးဆေးကို ပါးစပ်မှဝင်ရောက်လျှင် ရုတ်တရက်အဆိပ်သင့်မှု အမျိုးအစား 4၊ မျိုချမိပါက အန္တရာယ်ရှိသည်ဟု သတ်မှတ်ထားပြီး Sigma-Aldrich မီသိုင်လင်းဘလူး SDS အရ အတည်ပြုထားသော စွန့်ပစ်နည်းလမ်းဖြင့် စွန့်ပစ်ရန် ဖော်ပြထားသည်။ အီသီဒီယမ်ဘရိုမိုက်တွင် မျိုးဗီဇပစ္စည်းအပေါ် အဆိပ်သင့်မှုဆိုင်ရာ ပိုပြင်းထန်သော သတိပေးချက်များရှိပြီး ၎င်း၏ Sigma-Aldrich အီသီဒီယမ်ဘရိုမိုက် SDS တွင် မျိုးပွားဆဲလ်များအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိနိုင်သည်ဟု သံသယရှိကြောင်းလည်း ပါဝင်သည်။ ထို့အပြင် Thermo Fisher နျူကလိယစ်အက်ဆစ်ဆိုးဆေး လမ်းညွှန် တွင် ဖော်ပြသကဲ့သို့ ၎င်း၏ ဂျယ်များနှင့် ပျော်ရည်များကို အန္တရာယ်ရှိသော ဓာတုစွန့်ပစ်ပစ္စည်းအဖြစ် သီးခြားခွဲထားလေ့ရှိသည်။ နှစ်မျိုးစလုံးအတွက် SDS နှင့် အဖွဲ့အစည်း၏ စည်းမျဉ်းများကို လိုက်နာပါ။ ဆိုးဆေးခြောက်ကို လုံခြုံစွာ ပိတ်၍ ခြောက်သွေ့အောင်ထားပါ၊ အသုံးပြုနေသော ဆိုးဆေးပျော်ရည်ကို လုပ်ထုံးလုပ်နည်းက ခွင့်ပြုသည့်အတိုင်းသာ ပြန်သုံးပါ၊ အရောင်ဆိုးထားသော အမြှေးပါးများကို စစ်စက္ကူအလွှာများကြား ခြောက်သွေ့စွာ သိမ်းပါ၊ အစင်းများ ပျံ့နှံ့ပျောက်ကွယ်မသွားမီ ဂျယ်များကို ဓာတ်ပုံရိုက်ပါ။

ဓာတ်ခွဲခန်းစားပွဲပေါ်က အနှစ်ချုပ်ကို မှတ်ထားပါ။ ဂျယ်များသည် နမူနာပမာဏများသည့်အခါ အဖြူရောင်အလင်းအောက်တွင် မြင်နိုင်ခြင်းရှိမရှိကို စစ်ဆေးသည်။ အမြှေးပါးများသည် ပရုဘ်က ပိုမိုထောက်လှမ်းနိုင်စွမ်းကောင်းသော အလုပ်ကို မလုပ်မီ လွှဲပြောင်းမှုနှင့် နမူနာထည့်သွင်းမှုကို စစ်ဆေးသည်။ ဆိုးဆေးတစ်မျိုးတည်းက နှစ်မျိုးစလုံးကို ဆောင်ရွက်ပေးသော်လည်း ထောက်လှမ်းနိုင်စွမ်းမှာ အလယ်အလတ်သာရှိပြီး တွဲကပ်မှုကို ပြန်လည်ဖယ်ရှားနိုင်ကာ လုပ်ဆောင်မှုအစဉ်ကို တိကျစွာ လိုက်နာရသည်။