Min żviluppa ż-żebgħa vjola għad-demm? Il-blu tal-metilen, Malachowski, Romanowsky u Giemsa

L-eosina hija ħamra. Il-blu tal-metilen huwa blu. Ħallat it-tnejn, applika t-taħlita fuq saff irqiq ta’ demm imnixxef, u partijiet mis-saff isiru vjola.

Mhux kull parti. Fi preparazzjoni tajba, in-nuklei taċ-ċelloli bojod tad-demm jieħdu lewn aħmar-vjola, u ġewwa parassita tal-malarja l-kromatina tieħu l-istess kulur, filwaqt li ċ-ċelloli ħomor ta’ madwaru jibqgħu roża u ċ-ċitoplażma tibqa’ griża-blu. Il-vjola huwa dak li jagħmel it-tipi ta’ ċelloli jintgħarfu minn xulxin.

Ebda wieħed miż-żewġ fliexken ma fih il-vjola. Il-kulur jidher biss meta prodott partikolari tad-degradazzjoni tal-blu tal-metilen jiltaqa’ mal-eosina fuq is-slajd, u fis-snin 1880 u 1890 ħadd ma kien jaf li dan il-prodott kien jeżisti, aħseb u ara x’kien. In-nies li kienu qed ifittxu dan il-kulur kienu jaħdmu b’żebgħat impuri, waħedhom, mingħajr mod affidabbli biex isiru jafu x’kien hemm fi flixkun wara li jkun ilu xahrejn fuq xkaffa.

Għalhekk il-mistoqsija fit-titlu għandha aktar minn tweġiba waħda li tista’ tiġi difiża, u għalhekk it-tweġiba nbidlet fl-2011.

Riżultat viżiv li nbidel mat-taħlita

Iż-żebgħa ma ġietx ivvintata. Żviluppat ftit ftit. Kull bidla fit-taħlita żiedet eżattament biċċa waħda ġdida ta’ informazzjoni viżibbli, u s-sekwenza ta’ dawn il-biċċiet hija l-aktar mod ċar biex taqra l-istorja.

Il-mudell fl-aħħar kolonna huwa dak importanti. Kull avvanz wessa’ l-firxa tal-kuluri, u kull twessigħ għamel struttura oħra viżibbli. Il-vjola mhuwiex tiżjin tat-teknika; huwa d-differenza bejn li tara li hemm parassita u li tara minn xiex huwa magħmul. Kif iż-żebgħa nnifisha għaddiet minn fabbrika taż-żebgħat tal-BASF għall-mediċina hija storja itwal bid-dokumenti tagħha stess. Is-sekwenza sħiħa ta’ hawn fuq, bis-sors wara kull entrata, tinżamm bħala kronoloġija tal-kontributuri b’links għas-sorsi.

Figura: l-istess sitt taħlitiet imfassla biex juru x’kien hemm fid-dixx u x’ħareġ minnu. Iċ-ċrieki juru ż-żebgħat; il-blokok ta’ taħthom juru l-kuluri li dawk iż-żebgħat setgħu jipproduċu f’saff irqiq tad-demm. Qabel l-1890 ma tidher ebda blokka ħamra-vjola, u wara dik is-sena ebda taħlita ma tħalliha barra.

Ir-raġel li uża l-borax apposta

Ernst Malachowski kien tabib fi Breslau, illum Wrocław, li qatta’ l-karriera tiegħu fi prattika privata u fi klinika żgħira li kien imexxi ma’ kollega, u jagħmel xogħol tal-laboratorju fil-ħin liberu tiegħu. Twieled fi Strzelno fit-12 ta’ Marzu 1857, studja l-mediċina fl-Università ta’ Breslau, u mill-1882 sal-1887 ħadem bħala assistent fil-mediċina interna fl-Isptar tal-Qaddisin Kollha, li dak iż-żmien kien it-tieni l-akbar sptar fil-Ġermanja.

Beda fl-1888 biż-żebgħa doppja ta’ Chęciński u Plehn. Fi preparazzjoni magħmula fl-1889 ra l-kromatina tan-nukleu tal-plasmodju tieħu kulur differenti miċ-ċitoplażma, u mbagħad sab li ma setax jirriproduċi r-riżultat. Ipprova jaċidifika l-blu tal-metilen, u dan mar għall-agħar. Ipprova jagħmlu alkalin bil-borax, u dan ħadem kull darba. Wera l-metodu pubblikament fil-15 ta’ Ġunju 1890 u ppubblika deskrizzjoni aktar sħiħa f’Awwissu 1891, inkluża l-istruzzjoni dwar il-borax. Innota li t-tiżbigħ kien jieħu erbgħa u għoxrin siegħa u li r-riżultati kienu faċli biex jiġu riprodotti.

Erbgħa u għoxrin siegħa huma żmien twil f’laboratorju dijanjostiku, u l-artiklu tiegħu ma tax ħafna attenzjoni lill-kulur vjola-aħmar tan-nukleu tal-parassita. Hi x’inhi r-raġuni, ħadd ma adotta l-alkalinizzazzjoni deliberata tal-blu tal-metilen sakemm Nocht reġa’ għamilha fl-1898. Malachowski qatt ma reġa’ kiteb dwar it-tiżbigħ tad-demm.

Ir-raġuni għaliex sa ftit ilu kien magħruf tant ftit dwaru għandha x’taqsam mal-arkivji aktar milli ma’ xi misteru. Kważi ebda traċċa ta’ ħajtu ma baqgħet fil-letteratura medika, u dak li baqa’ wasal minn rotta waħda. Bintu Marie telqet mill-Ġermanja għal Londra fl-1939, serviet fl-Armata Brittanika u marret tgħix fil-Kanada, u l-kollezzjoni tagħha ta’ dokumenti tal-familja spiċċat fl-Istitut Leo Baeck fi New York. Ħuha Leo nqatel fl-Ewwel Gwerra Dinjija. Oħtha Eva ġiet deportata minn Breslau lejn il-kamp ta’ tranżitu ta’ Izbica f’April 1942 u qatt ma reġgħet lura. Ommha Hedwig temmet ħajjitha fit-22 ta’ April 1942 minflok stenniet l-istess deportazzjoni. Malachowski kien miet fl-1934, qabel ma seħħ dan kollu.

Storja ta’ familja li tispiċċa hekk hija storja ta’ familja li ma tibqax tiġi ċċitata. Iż-żewġ artikli li reġgħu taw lil Malachowski post fl-iżvilupp taż-żebgħa, it-tnejn ippubblikati fl-2011, inġabru minn dokumenti tal-arkivji f’Poznań u Wrocław u mid-dokumenti ta’ Marie fi New York.

Flixkun bil-moffa u Russu xortih tajba

Dmitri Romanowsky studja l-mediċina fl-Akkademja Medika Militari f’San Pietruburgu u ħadem fuq il-malarja għal ħafna mill-karriera tiegħu. Fl-1890 ppubblika metodu li, fuq il-karta, kien kważi identiku għal dak ta’ Chęciński: blu tal-metilen mhux mibdul u eosina, bi ftit aktar eosina.

F’Settembru 1891 ppubblika l-metodu li għamlu magħruf, u d-dettall li kien importanti kien moħbi fost l-istruzzjonijiet. L-aħjar riżultati tiegħu ġew minn is-soluzzjoni tal-metilen miżmuma bħala ħażna, soluzzjoni tal-blu tal-metilen li kienet ilha wieqfa aktar minn xahrejn bil-moffa tikber fuqha. Il-moffa u ż-żmien li damet wieqfa kienu parzjalment demetilaw iż-żebgħa. Romanowsky ma kienx jaf dan u ma setax jikkontrollah, u ħaddiema oħra li ppruvaw il-metodu tiegħu ma setgħux jiksbu l-vjola. It-teżi tiegħu kienet ġiet ippreżentata f’San Pietruburgu f’Ġunju 1891, u għalhekk ir-rakkont standard iqis l-1891 bħala s-sena tal-iskoperta.

Id-dimostrazzjoni ta’ Malachowski kienet saret f’Ġunju 1890, aktar minn sena qabel, u l-metodu tiegħu ħadem apposta.

Għaliex iż-żebgħa ngħatat isem ir-raġel żbaljat

L-argument favur Malachowski nġabar minn Kristine Krafts, Ernst Hempelmann u Barbara Oleksyn, u jistrieħ fuq erba’ affarijiet. Id-data tad-dimostrazzjoni pubblika, Ġunju 1890 meta mqabbel ma’ Settembru 1891. Il-kelma deliberat meta mqabbla mal-kelma aċċidentali. Il-fatt li Malachowski ppubblika l-metodu tiegħu, inkluż il-borax, filwaqt li dak ta’ Romanowsky kien jiddependi fuq varjabbli mhux ikkontrollata. U l-osservazzjoni li d-deskrizzjoni tan-nukleu tal-plasmodju, flimkien mal-vjola li rrendieh viżibbli, effettivament għabet mil-letteratura għal seba’ snin, għax ħadd ma seta’ jirriproduċi l-verżjoni aċċidentali.

Huma ċari ħafna dwar il-konklużjoni. Fl-artiklu bijografiku jsejħu l-attribuzzjoni "tgħawwiġ tal-verità", u jikkwotaw lil Ralph Lillie, li fl-1978 kiteb li "forsi għandna nirreferu għal din il-familja ta’ żebgħat bħala żebgħat ta’ Malachowski".

Din il-pretensjoni hija kkontestata, kif normalment ikunu l-pretensjonijiet ta’ prijorità, u ta’ min jispjega n-natura tal-kontestazzjoni aktar milli jsolviha. Argument dwar il-prijorità jrid jiddefinixxi x’kienet l-iskoperta. Jekk l-iskoperta hija l-kulur vjola, Malachowski għandu l-ewwel dimostrazzjoni dokumentata. Jekk l-iskoperta hija l-metodu ppubblikat, iż-żewġt irġiel ippubblikaw fl-1891 u ż-żebgħa ssemmiet għal Romanowsky. Jekk l-iskoperta hija l-ispjegazzjoni, ebda wieħed minnhom ma jista’ jitlob il-mertu, għax ebda wieħed ma kien jaf li l-maturazzjoni kienet demetilazzjoni u ebda wieħed ma seta’ jgħid għaliex il-kulur kien jidher. Dan l-aħħar punt huwa dak li r-rakkonti popolari jaqbżu. L-ingredjent attiv kien impurità li ħadd ma kien identifika, u l-ewwel persuna li pproduċiet il-kulur apposta għamlet dan minn riċetta empirika riproduċibbli, mhux minn fehim ta’ x’kienet tagħmel ir-riċetta.

Iż-żewġ artikli tal-2011 huma l-aktar preżentazzjoni sħiħa ppubblikata tal-argument favur Malachowski, u t-tnejn jistgħu jinqraw b’xejn fuq PubMed: ir-reviżjoni twila fuq PMID 21235291 u l-artiklu bijografiku fuq PMID 21660627. Ir-rekord ta’ PubMed għar-reviżjoni jelenka wkoll kumment dwarha, ippubblikat fl-istess ġurnal aktar tard dik is-sena f’86(5):366, li jfakkar sewwa li l-argument ġie kkontestat bil-miktub malli deher.

Dak li din it-tilwima mhijiex huwa nuqqas ta’ qbil dwar il-kimika. Kulħadd involut jaqbel dwar x’inhu l-vjola u liema komponenti jipproduċuh. In-nuqqas ta’ qbil huwa dwar min wasal hemm l-ewwel, u dwar jekk inċident li ħadd ma seta’ jirrepeti jgħoddx bħala li wieħed ikun wasal hemm.

X’żiedu l-ismijiet li ġew wara

Jekk Malachowski pproduċa l-vjola l-ewwel, għaliex iż-żebgħa ġġib l-ismijiet ta’ Romanowsky, Wright u Giemsa?

Għax żebgħa li taħdem darba f’idejn l-inventur tagħha mhijiex reaġent. Ix-xogħol ta’ wara biddel taħlita kapriċċuża f’xi ħaġa li tekniku f’pajjiż ieħor seta’ juża nhar ta’ Tlieta.

Nocht wasal hemm bir-raġunament. Wara li ma rnexxilux jikseb riżultat affidabbli minn żebgħa newtrali sempliċi, ikkonkluda li l-vjola kellu jiġi minn xi ħaġa fil-blu tal-metilen li ma kinitx blu tal-metilen, u beda jfittixha. Unna kien diġà nnota li soluzzjonijiet tal-blu tal-metilen li kienu qdiemu kienu jiżbgħu l-granuli taċ-ċelloli mast ħomor, u ppropona li kienet tifforma sustanza ġdida hekk kif iż-żebgħa timmatura. Bernthsen kien wera fl-1885 li kundizzjonijiet alkalini jneħħu gruppi metiliċi mill-blu tal-metilen, u li dawn il-prodotti huma dawk li llum insejħulhom azures. Nocht estratta l-frazzjoni attiva bil-kloroform u seta’ jsejħilha biss aħmar mill-blu tal-metilen; Michaelis semmieha azure I fl-1901. Jenner solva l-loġistika. Meta ħoll mill-ġdid il-preċipitat tal-blu tal-metilen u l-eosina f’metanol assolut, kiseb soluzzjoni stabbli waħda li kienet tiffissa s-saff waqt li tiżbogħu u temmet il-ħtieġa għall-iffissar bis-sħana. Leishman u Reuter għaqqdu żebgħa polikromatika ma’ solvent alkoħoliku u kisbu kemm l-istabbiltà kif ukoll il-vjola. Wright issostitwixxa inkubazzjoni ta’ tnax-il siegħa f’65 °C u għaxart ijiem ta’ mistrieħ b’siegħa f’fluss ta’ fwar. Giemsa ma baqax jiddependi affattu fuq soluzzjoni li kienet immaturat b’mod każwali, u uża kwantitajiet imkejla ta’ żebgħat magħrufa bil-gliċerol fil-metanol sabiex il-prodott jiflaħ għas-sħana tropikali. Qatt ma ppubblika kif kien jagħmel il-methylene azure pur. Biegħu lil-laboratorju ta’ Dr Grübler f’Leipzig, li kkummerċjalizzah bħala azure I u sostna li l-verżjoni tiegħu biss kienet iż-żebgħa awtentika ta’ Giemsa.

L-identità ta’ dak l-azure għadha tiġi diskussa. Xi wħud isostnu li kien sempliċement blu tal-metilen polikromatiku, oħrajn li kien rikk fl-azure B. It-tweġiba ħarġet minn gwerra. Meta ż-żebgħat Ġermaniżi ma baqgħux jinkisbu, tim tas-Servizz tas-Saħħa Pubblika tal-Istati Uniti, Ralph Lillie ma’ Maurice Roe u Aimee Wilcox, sab li l-aħjar tiżbigħ kien jiġi minn tliet komponenti sseparati: blu tal-metilen mhux modifikat, il-prodott demetilat tad-degradazzjoni tiegħu azure B, u eosina. Azure B ħa post l-azure I li ma setax jinkiseb, u dawk it-tliet komponenti għadhom il-bażi taż-żebgħa użata llum għad-dijanjosi tal-malarja.

Il-kimika ta’ kif dawk it-tliet komponenti jinteraġixxu fuq slajd hija mistoqsija separata u paġna differenti. Il-paġna dwar ir-rwoli taż-żebgħat u l-kimika taż-żebgħat tat-tip Romanowsky tispjega x’jagħmlu l-azure B u l-eosina, kull wieħed minnhom, u għaliex it-tnejn flimkien jipproduċu kulur li ebda wieħed ma jipproduċi waħdu. Il-paġna dwar il-mikroskopija u l-applikazzjonijiet fil-laboratorju tittratta n-naħa prattika: x’turi preparazzjoni partikolari, u kif tiġġudika jekk prodott partikolari huwiex adattat għall-metodu li biħsiebek tuża.

Il-parti tal-istorja li għadha rilevanti llum

Dettall wieħed f’din l-istorja ma waqafx ikun veru fl-1902. Għal madwar ħamsin sena, l-aktar komponent importanti taż-żebgħa standard fid-dinja għall-malarja kien impurità bla isem. Kien hemm b’kumbinazzjoni, il-kwantità tiegħu kienet tvarja bejn flixkun u ieħor, l-identità tiegħu kienet sigriet kummerċjali għal parti minn dak iż-żmien, u l-proporzjon tiegħu baqa’ jiġi diskuss sas-snin 1940. In-nies li kienu jużaw iż-żebgħa ma kinux traskurati. Ma kellhom ebda mod biex ikunu jafu x’kien hemm fil-flixkun.

Il-verżjoni moderna tal-istess problema hija speċifikazzjoni li tiddeskrivi biss parti mill-materjal. Il-konformità mal-USP hija t-triq lejn l-ogħla purità li joffri s-suq, għax hija standard sħiħ ippubblikat aktar milli kejl wieħed: identità, purità, impuritajiet organiċi inklużi ż-żebgħat azure, solventi residwi, impuritajiet elementali, residwu wara t-tqabbid, limiti mikrobjali u endotossini batteriċi. Blupreme tikseb il-blu tal-metilen tagħha mingħand manifattur farmaċewtiku u tippubblika ċ-ċertifikat sħiħ tal-analiżi, sabiex kull linja ta’ dik il-lista tkun tista’ tiġi vverifikata minflok sempliċement iddikjarata. Ċertifikat li jirrapporta riżultat għall-metalli tqal u jsejjaħlu konformità mal-USP huwa l-ekwivalenti tal-lum ta’ flixkun bit-tikketta "blu tal-metilen immaturat": possibbilment reaġent tajjeb, iżda t-tikketta ma tgħidlekx x’hemm fih.