Il-kejl ta’ speċijiet reattivi tal-ossiġnu f’esperimenti bil-blu tal-metilen

Żewġ laboratorji jwettqu dak li kull wieħed isejjaħ esperiment antiossidanti bil-blu tal-metilen. Wieħed jirrapporta li ż-żebgħa trażżan l-ispeċijiet reattivi tal-ossiġnu. L-ieħor jirrapporta li tiġġenerahom. It-tnejn juru kurvi ċari tar-rispons għad-doża. It-tnejn huma sinċieri. Id-differenza mhijiex frodi jew inkompetenza. Hija li ż-żewġ gruppi kejlu affarijiet differenti taħt dawl differenti, b’sondi li jwieġbu mistoqsijiet differenti, u mbagħad iddeskrivew iż-żewġ tweġibiet bl-istess kelma: ROS.

Il-blu tal-metilen huwa molekula diffiċli biex titkejjel bi preċiżjoni għax jipparteċipa fil-kimika li suppost qiegħed josserva. Fid-dlam jittrasporta l-elettroni bejn donaturi u aċċettaturi u jerġa’ lura għall-forma inizjali tiegħu, lest biex jerġa’ jibda ċ-ċiklu. Taħt id-dawl isir fotosensitizzatur, u jilħaq stat triplet eċċitat li minnu jista’ jittrasferixxi l-enerġija lill-ossiġnu biex jipproduċi ossiġnu singlet jew jittrasferixxi elettroni biex jipproduċi radikali u perossidu tal-idroġenu. Kwalunkwe sonda li titqiegħed f’dik is-sistema tista’ tiġi ossidata, ridotta, ibbliċjata jew mgħottija ottikament miż-żebgħa nnifisha. Għalhekk l-ewwel mistoqsija dwar kwalunkwe qari tar-ROS qatt ma tkun x’inhu n-numru. Tkun x’jidentifika t-test fil-fatt, u x’tagħmel iż-żebgħa lit-test.

Amplex Red: test ikkalibrat għall-perossidu tal-idroġenu

Il-kombinazzjoni ta’ blu tal-metilen u Amplex Red hija l-aktar waħda li tista’ tiġi difiża f’din il-letteratura, meta titħejja kif suppost. Il-kimika hija speċifika: il-perossidażi tar-ravanell selvaġġ tuża l-perossidu tal-idroġenu biex tossida s-sottostrat Amplex għal prodott fluworexxenti, ir-resorufin, fi stojkjometrija ta’ bejn wieħed u ieħor wieħed għal wieħed. Il-perossidu mill-kampjun isir fluworexxenza fid-ditekter. Xejn ieħor fil-familja konvenzjonali tar-ROS ma jmexxi dik ir-reazzjoni direttament.

Il-vantaġġ deċiżiv huwa l-kalibrazzjoni. Riċerkatur metikoluż jittestja standards magħrufa tal-perossidu fl-istess soluzzjoni buffer, bl-istess konċentrazzjonijiet ta’ perossidażi u sottostrat, bl-istess ħin ta’ inkubazzjoni, u bl-istess settings ottiċi, imbagħad jaqra l-kampjuni mqabbla ma’ dik il-kurva. Fl-istudju fuq mitokondriji iżolati mill-moħħ li fuqu huwa bbażat dan il-metodu, l-awturi għamlu eżattament hekk: żiedu kwantitajiet magħrufa ta’ perossidu fi tmiem kull prova, u n-numri ġew irrapportati bħala rati f’pikomoli kull minuta għal kull milligramma ta’ proteina minflok f’unitajiet arbitrarji ta’ fluworexxenza. Dan huwa dak li jibdel tiddix f’kejl.

Tliet dettalji minn dak l-istudju jistħoqqilhom jiġu segwiti. L-ewwel, l-awturi vverifikaw is-sinjal bil-katalażi, li teqred il-perossidu. Iż-żieda fil-fluworexxenza kkawżata mill-blu tal-metilen waqfet meta żdiedet il-katalażi, u dan ikkonferma li s-sinjal kien perossidu u mhux artefatt ottiku. It-tieni, ittestjaw l-illuminazzjoni direttament billi użaw shutter fuq ir-raġġ ta’ eċċitazzjoni sabiex il-kampjuni jirċievu wieħed minn tmienja tad-doża normali tad-dawl, u s-sinjal naqas b’disgħa fil-mija biss. Aktar minn disgħin fil-mija tal-perossidu li rrapportaw kien indipendenti mid-dawl tal-kejl. It-tielet, kejlu l-eliminazzjoni tal-perossidu separatament b’elettrodu u sabu li ż-żebgħa kemm żiedet il-produzzjoni kif ukoll naqqset ir-rata tal-eliminazzjoni. Sonda li tirrapporta biss il-fluworexxenza netta kienet tħallat dawn iż-żewġ effetti.

It-test xorta għandu modi kif jista’ jagħti riżultati żbaljati, u l-blu tal-metilen jikkawża diversi minnhom. Iż-żebgħa tassorbi fuq firxa wiesgħa fl-istess reġjun aħmar fejn ir-resorufin jemetti, għalhekk f’konċentrazzjonijiet għoljin taż-żebgħa l-kampjun jista’ jgħatti s-sinjal tiegħu stess permezz ta’ effetti ta’ filtru intern. Għalhekk l-istandards għandhom ikollhom l-istess konċentrazzjoni taż-żebgħa bħall-kampjuni. Amplex Red jista’ wkoll jgħaddi minn fotoossidazzjoni waħdu, u l-prodott tiegħu, ir-resorufin, jista’ jidħol f’ċikli fotoredox li jiġġeneraw superossidu u perossidu, fatt importanti ħafna meta l-esperiment idawwal ukoll fotosensitizzatur. Is-soluzzjoni prattika hija li l-kampjuni tal-blu tal-metilen jiġu irradjati l-ewwel u mbagħad jiġu ttestjati alikwoti bir-reaġenti Amplex fid-dlam, minflok iż-żebgħa u s-sonda jiddawwlu flimkien. Fl-aħħar nett, is-superossidu dismutażi mhux sempliċement trażżan sinjal Amplex: il-konverżjoni tas-superossidu f’perossidu tista’ żżidu. Kontroll bis-SOD li jżid il-fluworexxenza ma jkunx falla. Ikun identifika s-superossidu bħala speċi aktar kmieni fil-katina tar-reazzjonijiet.

DCFDA: indikatur mhux speċifiku tal-ossidazzjoni

Il-kombinazzjoni ta’ blu tal-metilen u DCFDA hija s-sors tal-biċċa l-kbira tal-konfużjoni. DCFH-DA huwa prekursur li jiddaħħal fiċ-ċelloli. L-esterażi ġewwa ċ-ċellola jneħħulu l-gruppi tal-aċetat biex iħallu DCFH mhux fluworexxenti, u l-ossidazzjoni tad-DCFH tagħti DCF fluworexxenti. Il-lista ta’ dak li jossidah hija twila: radikali idrossili, intermedji tal-perossidażi u tal-eme, diossidu tan-nitroġenu, aċidu ipokloruż, u radikali derivati mill-perossinitrit. Il-perossidu tal-idroġenu waħdu ma jossidahx direttament b’xi rata utli; il-fluworexxenza dipendenti fuq il-perossidu ġeneralment teħtieġ ħadid, proteini tal-eme, jew kimika tal-perossidażi fil-proċess.

Il-kritika li kull taqsima tal-metodi għandha tiċċita ġejja mill-analiżi tad-DCFH bħala sonda minn Kalyanaraman u l-kollegi tiegħu, kif imqassra fl-istudju fuq il-mitokondriji tal-moħħ li ċaħad id-DCFDA għal din ir-raġuni. Huma wrew li ż-żebgħa tirreaġixxi bil-mod, bi stojkjometrija mhux ikkaratterizzata, mingħajr kalibrazzjoni valida, u ma’ komposti li mhumiex ROS. Is-sonda tamplifika wkoll dak li tkejjel: l-ossidazzjoni tad-DCFH b’elettron wieħed tipproduċi radikal DCF li jirreaġixxi mal-ossiġnu biex jagħmel superossidu, li jgħaddi minn dismutazzjoni għal perossidu addizzjonali. Il-qari parzjalment joħloq il-kimika li jirrapporta.

Xejn minn dan ma jagħmel id-DCFDA inutli. Jagħmlu test ta’ skrinjar, mhux identifikazzjoni. Żieda fil-fluworexxenza tad-DCF tfisser li żdiedet l-ossidazzjoni tas-sonda dipendenti fuq l-ossidanti. Ma tfissirx li żdied il-perossidu, u żgur ma tfissirx li żdiedu r-ROS totali, kwantità li ebda sonda waħda ma tkejjel. Xogħol preċedenti fuq il-blu tal-metilen li kien jiddependi fuq l-ossidazzjoni tad-DCF f’konċentrazzjonijiet ogħla minn mikromolar wieħed irrapporta effetti proossidanti, filwaqt li sistemi oħra fl-istess żmien irrapportaw protezzjoni kontra l-mewt taċ-ċelloli kkawżata mill-perossidu. Iż-żewġ osservazzjonijiet jistgħu jkunu veri għall-istess żebgħa f’kuntesti redox differenti, u r-riżultat tad-DCF waħdu ma jistax jgħid liema ossidant kien responsabbli għas-sinjal. L-importanza tax-xogħol preċedenti fuq il-mitokondriji tal-moħħ hija li ssostitwixxa dan it-test ta’ skrinjar b’kejl ikkalibrat tal-perossidu u identifika l-piż direttament: anki mitt nanomolar taż-żebgħa żiedu r-rilaxx tal-perossidu b’diversi drabi għal kull sottostrat u stat respiratorju ttestjat.

Id-DCFDA għandu nassa oħra speċifika għall-blu tal-metilen. Iż-żebgħa għandha kulur intens u hija attiva fir-reazzjonijiet redox, għalhekk tista’ tibbliċja l-fluworexxenza, titfi l-emissjoni, jew tossida l-kimika tas-sonda indipendentement mir-ROS ċellulari. Kontroll mingħajr ċelloli, biż-żebgħa u s-sonda iżda mingħajr ċelloli, mhuwiex tiżjin fakultattiv. Huwa l-esperiment li jgħidlek jekk iż-żebgħa tinteraġixxix mas-sonda.

Il-qbid tal-ispin u l-konsum tal-ossiġnu: identità u fluss

Fejn is-sondi fluworexxenti jirrapportaw li dehret xi ħaġa ossidabbli, ir-reżonanza tal-ispin tal-elettroni b’nases tal-ispin tirrapporta xi ħaġa eqreb lejn x’kienet. L-istudju klassiku tal-fotokimika tal-blu tal-metilen uża l-ESR biex jidentifika r-radikal tal-askorbat miż-żebgħa, l-askorbat u d-dawl, imbagħad wera l-formazzjoni tal-perossidu f’esperimenti tal-konsum tal-ossiġnu u l-formazzjoni ta’ radikali idrossili kkatalizzata mill-ħadid fi provi tal-qbid tal-ispin. Kull teknika wieġbet il-mistoqsija li l-oħrajn ma setgħux: l-ESR tat l-identità tar-radikali, il-konsum tal-ossiġnu ta l-fluss tar-reazzjoni indipendentement minn kwalunkwe sonda fluworexxenti, u l-kombinazzjoni wriet li kemm il-mogħdijiet tal-ossiġnu singlet kif ukoll dawk tar-radikali kienu qed jaħdmu fl-istess sistema mdawla.

Dak ir-riżultat tal-1984 għadu jinqara bħala tikketta ta’ twissija. Fil-preżenza tal-illuminazzjoni u ta’ aġent riduċenti, iż-żebgħa ġġenerat perossidu, u fil-preżenza tal-ħadid is-sistema pproduċiet ir-radikal idrossil, l-aktar speċi reattiva fil-grupp. L-awturi rabtu dan mal-askorbat fl-għajn u qajmu dubji dwar l-użu oftalmiku mhux meqjus. Il-qarrejja tal-lum għandhom jinnotaw il-kundizzjonijiet: dawl flimkien ma’ aġent riduċenti u ħadid. Neħħi kwalunkwe wieħed minnhom u l-mogħdija tiddgħajjef jew tisparixxi.

L-elettrodi tal-ossiġnu jiġġustifikaw posthom b’mod differenti. Elettrodu tat-tip Clark ikejjel il-konsum nett tal-ossiġnu, li jistabbilixxi li l-kimika redox immexxija miż-żebgħa qed tikkonsma ossiġnu molekulari u jagħti kinetika li ebda artefatt tal-fluworexxenza ma jista’ jiffalsifika. Ma jidentifikax il-prodott. Il-perossidu, is-superossidu, l-ilma, u d-dekadenza tal-ossiġnu singlet kollha jikkonsmaw l-ossiġnu. Fluss mingħajr identità huwa inkomplet daqs identità mingħajr fluss, u għalhekk l-istudji b’saħħithom jgħaqqdu l-elettrodu ma’ test ikkalibrat għall-perossidu jew ma’ nassa.

Għaliex ir-riżultati antiossidanti jikkonfliġġu

Poġġi t-tliet tipi ta’ qari maġenb xulxin u l-kontradizzjonijiet apparenti fil-letteratura dwar il-blu tal-metilen jissolvew f’differenzi fil-metodi flimkien ma’ tliet fatti bijoloġiċi.

L-ewwel, iż-żebgħa hija kemm trasportatur tal-elettroni kif ukoll sors ta’ perossidu. Billi tiddevja l-elettroni ’l bogħod mis-siti respiratorji fejn l-ossiġnu altrimenti jsir superossidu, tista’ tnaqqas speċi waħda ta’ ROS waqt li l-forma ridotta tagħha tirriduċi l-ossiġnu direttament għal perossidu, u żżid oħra. Laboratorju li jkun qed jittratta l-kimika redox mitokondrijali u r-rwol taż-żebgħa bħala rotta alternattiva għalhekk għandu jistenna tweġibiet li jiddependu fuq is-sonda: qari sensittiv għas-superossidu jonqos waqt li qari tal-perossidu jiżdied fl-istess kuvett.

It-tieni, il-perossidu f’dożi baxxi huwa sinjal, mhux biss ħsara. L-istudju fuq il-mitokondriji tal-moħħ tal-ġrieden li segwa x-xogħol preċedenti sab ġenerazzjoni ta’ perossidu minn ammont baxx daqs ħamsin nanomolar taż-żebgħa mingħajr leżjonijiet fid-DNA mitokondrijali f’livelli terapewtiċi, bi protezzjoni kontra leżjonijiet ikkawżati mir-rotenone wara trattament minn qabel. Kien biss f’mitt mikromolar, ferm ’il fuq mill-firxa terapewtika, li ż-żebgħa għamlet ħsara lil frammenti magħżula tad-DNA, u dawl aħmar flimkien ma’ għoxrin mikromolar taż-żebgħa pproduċew ossiġnu singlet li għamel ħsara lill-frammenti kollha ttestjati. Il-mekkaniżmu propost huwa ormetiku: produzzjoni ħafifa ta’ perossidu tattiva difiżi antiossidanti marbuta ma’ Nrf2 u bijoġenesi mitokondrijali, għalhekk qari proossidanti fuq medda qasira ta’ żmien jiġi qabel riżultat antiossidanti fuq medda itwal. Test li jinqara wara siegħa u test li jinqara wara jum jistgħu ma jaqblux għax il-bijoloġija nbidlet bejniethom.

It-tielet, id-dawl jiddeċiedi liema molekula tkun saħansitra preżenti. L-illuminazzjoni tneħħi gruppi metiliċi miż-żebgħa, u twassal lejn Azure B u prodotti relatati, u l-lampa tal-mikroskopju fuq dixx hija biżżejjed biex tikkawża l-fotosensitizzazzjoni tagħha. Esperimenti fid-dlam u esperimenti mdawla huma esperimenti differenti, u t-taqsima dwar il-kontrolli tal-illuminazzjoni u l-immaniġġjar taż-żebgħa fi kwalunkwe protokoll għandha tittrattahom hekk.

Sett minimu ta’ kontrolli, u kif taqra kwalunkwe stqarrija

It-tqabbil ta’ hawn taħt huwa l-materjal ta’ referenza oriġinali għal dan l-artiklu. Qabel ma taċċetta kwalunkwe riżultat tar-ROS bil-blu tal-metilen, iċċekkja liema ringiela mlew l-awturi u liema ħallew barra.

Minn dan toħroġ regola prattika għall-interpretazzjoni. Amplex bil-perossidażi, ikkalibrat, b’verifika bil-katalażi, huwa evidenza dwar il-perossidu. DCFDA huwa evidenza dwar ossidazzjoni mhux speċifika tas-sonda u xejn aktar. Il-qbid tal-ispin b’kontrolli li jużaw aġenti li jaqbdu r-radikali huwa evidenza dwar l-identità tar-radikali. Il-konsum tal-ossiġnu huwa evidenza dwar il-fluss. Sentenza li ssostni aktar milli t-test tagħha jista’ jappoġġa, tkun kemm tkun miktuba b’kunfidenza, hija sentenza dwar is-sonda, mhux dwar iż-żebgħa. Diskussjonijiet relatati dwar id-dipendenza fuq id-doża u l-firxa ormetika, il-fluss tal-elettroni mitokondrijali, l-interferenza fit-testijiet f’kampjuni miżbugħa, u l-artefatti tal-illuminazzjoni fil-mikroskopija jespandu kull wieħed minn dawn il-punti, u kull wieħed jibqa’ validu ladarba r-referenza proviżorja tiegħu tiġi sostitwita.