Il-kejl tal-effetti mitokondrijali tal-blu tal-metilen: ossiġnu, ATP, u potenzjal tal-membrana

Immaġina li laboratorju jżid il-blu tal-metilen ma’ mitokondriji b’respirazzjoni indebolita u josserva żieda fil-konsum tal-ossiġnu. Is-sentenza li tiġi naturali li tinkiteb hi li ż-żebgħa rrestawrat il-funzjoni mitokondrijali. Dik is-sentenza tista’ tkun żbaljata. Il-fluss tal-ossiġnu, is-sinteżi tal-ATP, u l-potenzjal tal-membrana huma tliet kunċetti distinti. Jikkondividu l-istess organellu bħalma l-kopja ta’ riżerva, is-sinkronizzazzjoni, u l-kondiviżjoni jikkondividu l-istess folder fil-cloud: huma relatati, iżda mmexxija minn regoli differenti. Jekk tħawwad wieħed mal-ieħor, l-interpretazzjoni tfalli, anki meta kull kejl ikun teknikament korrett.

Il-blu tal-metilen jagħmel din il-konfużjoni probabbli għax jipparteċipa fis-sistema li jkejjel. Huwa kompost li jgħaddi minn ċikli redox u jaċċetta elettroni minn stadji aktar bikrin u jagħtihom lil stadji aktar tard, katjon lipofiliku li jakkumula f’mitokondriji enerġizzati, u kompost ta’ kulur blu qawwi li jassorbi u jemetti d-dawl fl-istess meded bħal sondi komuni. Qari wieħed ma jistax ikopri dan kollu. L-approċċ affidabbli, muri fl-istudji mitokondrijali ta’ Budapest, huwa li jitkejlu l-fluss tal-ossiġnu flimkien mar-rata tas-sinteżi tal-ATP, il-potenzjal tal-membrana, u r-rilaxx tal-perossidu tal-idroġenu, b’kontrolli speċifiċi għaż-żebgħa f’kull pass.

Ir-respirometrija tkejjel il-fluss tal-ossiġnu, mhux il-produzzjoni tal-enerġija

Ir-respirometrija b’riżoluzzjoni għolja, kemm bl-Oroboros Oxygraph kif ukoll bl-analizzatur tal-fluss ekstraċellulari Seahorse, tirrapporta ħaġa waħda: kemm qed jitnaqqas malajr l-ossiġnu permezz ta’ riduzzjoni. Ma tirrapportax kemm ġew ippumpjati protoni għal kull elettron, kemm ġie kkonservat mill-gradjent, jew jekk l-ATP sintasi użatux.

It-terminoloġija hija importanti. F’mitokondriji iżolati, sottostrat mingħajr ADP jagħti respirazzjoni tat-tnixxija, sottostrat b’ADP f’konċentrazzjoni saturanti jagħti l-kapaċità ta’ fosforilazzjoni ossidattiva, u titrazzjoni b’aġent li jneħħi l-akkoppjament tagħti l-kapaċità massima tat-trasferiment tal-elettroni. F’ċelloli intatti, l-ekwivalenti ta’ Seahorse huma r-respirazzjoni bażali, ir-respirazzjoni marbuta mal-ATP u sensittiva għall-oligomiċina, it-tnixxija tal-protoni, ir-respirazzjoni massima definita bl-FCCP, u l-konsum mhux mitokondrijali tal-ossiġnu reżistenti għar-rotenone flimkien mal-antimiċina. Li ssejjaħ ir-riżultati ta’ Seahorse Stat 3 u Stat 4 jagħtihom preċiżjoni li l-preparazzjoni ma ssostnix, kif jagħmilha ċara l-qafas tal-Agilent Mito Stress Test.

Il-blu tal-metilen jikser ir-rabta intuwittiva bejn aktar ossiġnu u aktar enerġija. F’mitokondriji iżolati mill-moħħ tal-fenek tal-Indi, 100 nM sa 1 uM taż-żebgħa żiedu l-konsum tal-ossiġnu waqt il-mistrieħ bis-sottostrati glutamat flimkien mal-malat, suċċinat, u alfa-gliċerofosfat, b’żieda ta’ madwar 64 fil-mija bl-alfa-gliċerofosfat, iżda r-respirazzjoni stimulata bl-ADP f’mitokondriji b’saħħithom baqgħet essenzjalment l-istess, skont l-istudju tal-mitokondriji iżolati tal-moħħ. Billi t-tnixxija żdiedet filwaqt li l-fluss stimulat bl-ADP baqa’ kostanti, il-proporzjon ikkalkulat tal-kontroll respiratorju jonqos. Dan it-tnaqqis ma jfissirx li ż-żebgħa għamlet ħsara lill-mitokondriji. Ifisser li ż-żebgħa żiedet ċiklu redox li jikkonsma l-ossiġnu flimkien mar-respirazzjoni normali. Assaġġ tal-konsum tal-ossiġnu bil-blu tal-metilen li jirrapporta biss iż-żieda jkun kejjel kimika reali u ma jkun qal xejn dwar il-konservazzjoni tal-enerġija.

L-esperimenti ta’ rkupru juru l-istess diskrepanza fuq skala akbar. Bil-Kumpless I imblukkat, il-fluss tal-ossiġnu rkupra bejn wieħed u ieħor bi tliet darbiet, filwaqt li s-sinteżi tal-ATP irkuprat biss b’madwar 1.5 darbiet. Aktar ossiġnu laħaq l-elettrodu. Inqas minnu kkontribwixxa għall-produzzjoni tal-ATP. Kwalunkwe stqarrija ta’ titjib fil-fosforilazzjoni ossidattiva teħtieġ il-kejl tal-ATP ukoll, idealment espress bħala proporzjon ta’ ATP għal kull ossiġnu, bil-konvenzjoni tad-denominatur iddikjarata.

L-assaġġi tal-ATP ikejlu r-rata tas-sinteżi, li l-kontenut ma jistax jieħu postha

Assaġġ tal-ATP iwieġeb mistoqsija differenti: kemm jiġi ġġenerat ATP għal kull unità ta’ ħin. Qari kinetiku, jew bil-luminixxenza tal-luċiferażi tal-musbieħ il-lejl segwita fuq diversi minuti jew b’assaġġ akkoppjat tal-eżokinażi flimkien mal-glukożju-6-fosfat deidroġenażi moqri f’340 nm, jagħti rata. Kejl wieħed tal-ATP totali f’punt finali jagħti l-kontenut, li jirrifletti s-sinteżi nieqsa l-konsum u waħdu ftit jgħidlek dwar il-fosforilazzjoni ossidattiva.

Il-grupp ta’ Budapest uża l-metodu enżimatiku akkoppjat bl-adenilat kinażi mrażżna, u sab li l-blu tal-metilen f’1 sa 2 uM żied b’mod modest iżda sinifikanti l-produzzjoni tal-ATP f’mitokondriji ttrattati bir-rotenone u bl-antimiċina. Dan huwa rkupru ġenwin, u huwa parzjali. L-istudju dwar it-tossiċità tat-TEGDMA wasal għall-istess tip ta’ tweġiba f’mudell differenti: 5 mM tal-monomeru dentali TEGDMA naqqsu drastikament ir-respirazzjoni marbuta mal-Kumpless I minn madwar 286 għal 28 unità ta’ fluss, u 2 uM taż-żebgħa rrestawrawha għal madwar 86.

Żewġ kontrolli huma indispensabbli ma’ kompost redox ikkulurit. L-ewwel, uża l-oligomiċina biex tistabbilixxi kemm mis-sinteżi tal-ATP imkejla tiddependi fuq l-ATP sintasi. It-tieni, wettaq test ta’ rkupru ta’ ATP miżjud f’sistema mingħajr ċelloli, b’ammont magħruf ta’ ATP flimkien mar-reaġent sħiħ u l-konċentrazzjonijiet eżatti taż-żebgħa użati, tal-inqas 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, u 2 uM. Iż-żebgħa tista’ tassorbi d-dawl emess, tinibixxi l-enżima li tiġġenera s-sinjal, jew tbiddel il-kimika redox tar-reaġent, u l-gwida ġenerali għall-assaġġi tal-luċiferażi tirrakkomanda testijiet bijokimiċi ta’ kontroverifika għal preċiżament din il-klassi ta’ interferenza. Tassumix li 1 uM huwa ħieles minn artefatti għax it-tifi tal-fluworexxenza ġeneralment ikun agħar f’konċentrazzjonijiet ogħla.

Is-sondi tal-potenzjal tal-membrana jkejlu d-distribuzzjoni taż-żebgħa, mhux il-fluss

Safranin O, TMRM u TMRE, rodamin 123, u JC-1 huma kollha katjoni li jistgħu jgħaddu mill-membrana. Jakkumulaw fil-matriċi ċċarġjata negattivament skont l-ekwilibriju elettrokimiku, għalhekk il-fluworexxenza totali tirrapporta l-potenzjal indirettament permezz tal-post fejn tinsab is-sonda. L-ebda waħda minnhom ma tkejjel l-ATP jew il-fluss tal-elettroni.

Kull sonda għandha preparazzjoni li taqbel magħha l-aħjar. Safranin O jaqbel ma’ mitokondriji iżolati u ċelloli permeabilizzati, tipikament qrib 2 uM b’eċċitazzjoni qrib 495 nm u emissjoni qrib 585 nm, u jaħdem f’reġim ta’ tifi tal-fluworexxenza fejn id-dħul tas-sonda jbiddel il-fluworexxenza totali. TMRM u TMRE jaqblu ma’ ċelloli intatti b’konċentrazzjoni ta’ tagħbija nanomolari baxxa f’modalità mingħajr tifi tal-fluworexxenza, fejn id-depolarizzazzjoni tirrilaxxa ż-żebgħa u l-fluworexxenza mitokondrijali tonqos; b’tagħbija għolja d-direzzjoni tas-sinjal tista’ tinqaleb permezz ta’ tifi awtoindott. JC-1 jagħti proporzjon konvenjenti bejn l-aħdar u l-aħmar iżda jiddependi fuq it-tagħbija u l-massa mitokondrijali, u għalhekk huwa inqas adattat għal xogħol kwantitattiv minn TMRM ikkontrollat bir-reqqa. Dawn il-kompromessi huma miġbura f’reviżjoni użata ħafna tas-sondi tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali.

Il-blu tal-metilen jinterferixxi ottikament preċiżament fil-konċentrazzjonijiet operattivi. Il-meded ta’ assorbiment tiegħu qrib 600 sa 665 nm jikkoinċidu mal-emissjoni tas-sondi ħomor, għalhekk l-effetti tal-filtru intern, it-tifi tal-fluworexxenza, u l-assorbiment tad-dawl tal-eċċitazzjoni huma kollha possibbli. Iż-żebgħa hija wkoll it-tieni katjon lipofiliku li d-distribuzzjoni tiegħu tinbidel mal-potenzjal li qed jitkejjel. Id-difiża hija l-użu ta’ kejl żejjed u kampjuni vojta: sonda waħedha, żebgħa waħedha, sonda flimkien ma’ kull konċentrazzjoni taż-żebgħa, depolarizzazzjoni sħiħa bl-FCCP bħala r-referenza taż-żero, u idealment it-tieni sonda ottikament distinta. L-istudju dwar il-qbiż tal-Kumpless III stabbilixxa dan il-preċedent billi rrepeta l-irkupru tal-potenzjal tal-membrana kemm b’safranin O kif ukoll b’TMRM wara inibizzjoni bl-antimiċina u bil-my xothiazol, u kiseb l-istess irkupru kwalitattiv. Sonda ottika waħda hija indikazzjoni. Żewġ sondi indipendenti huma evidenza.

Tliet preparazzjonijiet, tliet mistoqsijiet differenti

Mitokondriji iżolati, ċelloli permeabilizzati, u ċelloli intatti mhumiex settings interkambjabbli ta’ sensittività fuq assaġġ wieħed. Huma kunċetti differenti bi prinċipji operattivi differenti.

Il-mitokondriji iżolati jippreservaw il-katina tat-trasport tal-elettroni, il-membrana interna, u l-makkinarju tal-matriċi filwaqt li jneħħu l-membrana plażmatika, iċ-ċitosol, u l-arkitettura tan-netwerk. Din it-tneħħija hija l-għan: is-sottostrati, l-ADP, l-inibituri, u l-konċentrazzjonijiet taż-żebgħa huma definiti eżattament, sabiex tkun tista’ tiġi identifikata mogħdija. Il-prezz huwa t-telf tal-provvista naturali tas-sottostrati, tas-sinjalar, u tad-domanda.

Iċ-ċelloli permeabilizzati jżommu l-mitokondriji f’ħafna mill-arkitettura ċellulari tagħhom filwaqt li jħallu sottostrati esoġeni u ADP jgħaddu mill-membrana plażmatika miftuħa. Huma l-għodda t-tajba biex tidentifika difett f’mogħdija ta’ sottostrat f’kuntest ċellulari. Permeabilizzazzjoni eċċessiva tagħmel ħsara lill-membrana esterna, u r-regolazzjoni ċitosolika tintilef bil-ħasil.

Iċ-ċelloli intatti jippreservaw kollox: il-barriera tal-membrana plażmatika, l-aġenti riduċenti ċitosoliċi, it-trasport endoġenu tas-sottostrati, in-netwerk mitokondrijali, u d-domanda għall-ATP. Huma l-eqreb lejn il-fiżjoloġija u l-aktar ’il bogħod mill-mekkaniżmu, għax id-dħul, ir-riduzzjoni, u s-sekwestrazzjoni taż-żebgħa kollha jsawru l-espożizzjoni mitokondrijali effettiva.

L-istudju tat-TEGDMA uża t-tliet livelli apposta: mitokondriji iżolati tal-moħħ għall-irkupru tal-ossidazzjoni u tal-potenzjal permezz taż-żebgħa, ċelloli staminali tal-polpa dentali permeabilizzati prinċipalment biex jillokalizzaw il-ħsara fl-ossidazzjoni tas-sottostrati marbuta mal-Kumpless I, u ċelloli staminali intatti għall-effett fiżjoloġiku nett ta’ 2 uM taż-żebgħa fuq il-konsum imrażżan tal-ossiġnu. Għall-qarrejja li jqabblu qari mitokondrijali minn preparazzjonijiet differenti, l-artiklu kumplimentari dwar kif il-blu tal-metilen iċaqlaq l-elettroni tul il-katina respiratorja jagħti l-isfond tal-mogħdija, u l-gwida għall-qari tal-istudji tar-respirazzjoni bil-blu tal-metilen tkopri l-loġika tal-konċentrazzjonijiet u tal-inibituri.

Il-kontrolli li teħtieġ żebgħa attiva fir-redox

Kompost li jgħaddi minn ċikli redox jeħtieġ lista ta’ kontrolli itwal minn inibitur ordinarju, għax il-kimika taż-żebgħa waħedha tista’ timita l-bijoloġija.

Għar-respirometrija, uża kamra b’soluzzjoni tampun biss biex tivverifika ċ-ċaqliq tas-sinjal maż-żmien, kamra b’soluzzjoni tampun flimkien maż-żebgħa mingħajr materjal bijoloġiku, żebgħa flimkien ma’ kwalunkwe aġent riduċenti ekstraċellulari preżenti fl-assaġġ, u fl-aħħar rotenone flimkien mal-antimiċina biex tiddefinixxi l-konsum mhux mitokondrijali tal-ossiġnu f’ċelloli intatti. Innota li ż-żebgħa ridotta terġa’ tossida billi tittrasferixxi elettroni lill-ossiġnu biex tifforma l-perossidu tal-idroġenu, għalhekk kampjun vojt biż-żebgħa biss mingħajr donatur tal-elettroni jissottovaluta l-konsum tal-ossiġnu mingħajr ċelloli li jidher ladarba NADH jew NADPH ikunu disponibbli.

Għall-perossidu tal-idroġenu, ippreferi Amplex UltraRed ikkalibrat flimkien mal-perossidażi tar-rafan minflok iż-żebgħat DCFDA mhux selettivi, ivverifika bil-katalażi, u ttestja d-dipendenza fuq l-illuminazzjoni, billi ż-żebgħa hija fotosensibilizzatur. L-istudju tal-mitokondriji tal-moħħ sab li l-piż tal-perossidu żdied b’aktar minn erba’ darbiet b’100 nM biss taż-żebgħa filwaqt li l-eliminazzjoni naqset, bil-perossidu ffurmat direttament miż-żebgħa ridotta mingħajr intermedju superossidu. Id-dettalji tal-għażla tas-sondi u tal-kontrolli tad-dawl jinsabu fl-artiklu kumplimentari dwar il-kejl tal-ispeċi reattivi tal-ossiġnu f’esperimenti biż-żebgħa, u l-mistoqsija usa’ dwar meta l-perossidu jaġixxi bħala sinjal jew bħala piż hija koperta flimkien mal-bilanċ redox ċellulari u l-istqarrijiet dwar l-antiossidanti.

Għal stqarrijiet dwar il-mogħdijiet, ittestja ż-żewġ siti tal-inibituri tal-Kumpless III: antimiċina A fis-sit Qi u myxothiazol fis-sit Qo, flimkien ma’ punt finali tal-Kumpless IV biċ-ċjanur. Studju preċedenti fuq il-moħħ tal-ġurdien irrapporta rkupru permezz taż-żebgħa tar-respirazzjoni mblukkata bir-rotenone iżda mhux ta’ dik imblukkata bl-antimiċina, filwaqt li l-istudju aktar tard fuq tliet speċi sab irkupru parzjali biż-żewġ inibituri u evidenza ta’ riduzzjoni diretta taċ-ċitokromu c. Ittratta l-qbiż tal-mogħdija bħala kompatibbli mad-data l-aktar riċenti aktar milli bħala fatt stabbilit, billi l-konċentrazzjoni taż-żebgħa, is-sit tal-inibitur, l-istat tas-sottostrat, u d-distribuzzjoni taż-żebgħa kollha jbiddlu r-rotta osservata.

Matriċi għall-għażla tal-assaġġi

Uża din it-tabella biex tagħżel il-kejl skont il-mistoqsija, mhux bil-maqlub.

Bħala minimu, stqarrija konvinċenti tittestja l-istess konċentrazzjonijiet taż-żebgħa, 100 nM, 300 nM, 1 uM, u 2 uM, għall-fluss tal-ossiġnu taħt kundizzjonijiet ta’ tnixxija, ADP, oligomiċina, u aġent li jneħħi l-akkoppjament, għar-rata tas-sinteżi tal-ATP, għall-potenzjal tal-membrana preferibbilment b’żewġ sondi, u għar-rilaxx ikkalibrat tal-perossidu b’kontrolli bil-katalażi u mingħajr ċelloli. Irrapporta s-sett marbut: fluss tal-ossiġnu flimkien mar-rata tal-ATP, ATP għal kull ossiġnu, potenzjal, u perossidu. Kwalunkwe wieħed minn dawk in-numri waħdu huwa kejl li għadu jfittex tifsira.