L-Artikolu
Interpretazzjoni tad-dehra ta’ kolonji ta’ E. coli u oħrajn fuq agar EMB
Student jiżra’ kampjun mhux magħruf bi strixxi fuq agar tal-eosina u l-blu tal-metilen, jinkubah matul il-lejl, u jerġa’ lura għal pjanċa b’kolonji skuri b’leqq aħdar. In-nota fil-pitazz tgħid "E. coli, ikkonfermata." Dik in-nota ssostni aktar milli tista’ tappoġġja l-pjanċa. Il-pjanċa turi fenotip ta’ tkabbir u fermentazzjoni taħt kundizzjonijiet speċifiċi. L-identità tal-ispeċi hija konklużjoni separata li teħtieġ evidenza separata.
Din il-gwida tittratta r-riżultati tal-agar EMB bħala kompitu ta’ interpretazzjoni. Tispjega l-prinċipju sottostanti, tippreżenta atlas illustrattiv tal-pjanċi bil-kontrolli, u tindika l-każijiet fejn l-istampa tal-kotba tista’ tqarraq.
Il-prinċipju wara l-pjanċa
L-agar EMB huwa kemm selettiv kif ukoll differenzjali. Iż-żebgħat eosina Y u blu tal-metilen irażżnu ħafna organiżmi Gram-pożittivi, u għalhekk il-mezz jiffavorixxi t-tkabbir ta’ organiżmi Gram-negattivi. L-istess żebgħat jaġixxu bħala indikaturi: meta organiżmu jiffermenta z-zokkor disponibbli u jipproduċi biżżejjed aċidu lokalment, il-kolonja tassorbi ħafna żebgħa u ssir vjola skur sa iswed blu. Bi produzzjoni qawwija ta’ aċidu, il-wiċċ tal-kolonja jista’ juri iridixxenza ħadra metallika. Il-protokoll tal-ASM għall-pjanċi tal-agar tal-eosina u l-blu tal-metilen jiddeskrivi din il-kombinazzjoni ta’ selezzjoni u differenzjazzjoni u jipprovdi ritratti ta’ referenza għat-tagħlim.
Dettall wieħed huwa importanti qabel ma tinterpreta kwalunkwe riżultat: iċċekkja liema formulazzjoni qed tintuża. Il-formulazzjoni aktar antika ta’ Holt Harris Teague fiha lattożju flimkien ma’ sukrożju, filwaqt li Levine EMB fih lattożju biss. Organiżmu li jiffermenta s-sukrożju iżda mhux il-lattożju, bħal ħafna iżolati ta’ Serratia marcescens, jista’ jidher differenti fuq iż-żewġ verżjonijiet. Id-dokumentazzjoni tal-manifattur għall-mezzi EMB tiddikjara din id-differenza fil-formulazzjoni b’mod espliċitu. Irreġistra l-manifattur u l-formulazzjoni fil-pitazz flimkien mar-riżultat.
L-agar EMB ippreparat iżda mhux inokulat tipikament ikun kannella ħamrani sa vjola ħamrani, xi drabi b’lewn ħadrani jew preċipitat fin. Dak il-kulur fl-isfond mhuwiex tkabbir. Qabbel kull interpretazzjoni ma’ pjanċa mhux inokulata jew mal-kundizzjoni bażi dokumentata, u aqra l-pjanċa primarja wara madwar 18 sa 24 siegħa ta’ inkubazzjoni aerobika f’35 sa 37 C sakemm il-protokoll tat-tagħlim ma jispeċifikax mod ieħor. Inkubazzjoni estiża tista’ tbiddel id-dehra tal-fermentazzjoni.
Kif tħares lejn il-pjanċa
Uża żewġ tipi ta’ dawl. L-ewwel spezzjona l-pjanċa taħt dawl rifless jew oblikwu u mejjilha: il-leqq metalliku huwa iridixxenti u jista’ jidher jew jisparixxi skont l-angolu minn fejn tħares. Imbagħad eżaminaha b’dawl trażmess biex tevalwa l-kulur tal-kolonji u ċ-ċentri skuri. Aħdem minn kolonji iżolati sew, billi l-iffullar u l-kolonji ġirien ibiddlu l-akkumulazzjoni lokali tal-aċidu u jistgħu jrażżnu jew jesaġeraw il-kulur. Is-sett ta’ stampi tal-ASM juri dan direttament: E. coli f’kultura mħallta tista’ titlef il-leqq mistenni tagħha minħabba li l-organiżmi ta’ madwarha jbiddlu l-ambjent aċiduż.
Inkludi kontrolli kull meta l-eżerċizzju jippermetti. Sett komuni għat-tagħlim huwa E. coli ATCC 25922 għall-fenotip ta’ kulur iswed blu u leqq metalliku, nonfermentatur bħal Salmonella Typhimurium ATCC 14028 jew Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 għall-fenotip bla kulur, u organiżmu Gram-pożittiv bħal Enterococcus faecalis jew Staphylococcus aureus bħala kontroll tal-inibizzjoni, kif elenkat fit-tabelli standard tal-kontroll tal-kwalità għall-mezzi EMB. Jekk il-kontroll pożittiv ma jkollux leqq, issuspetta l-inkubazzjoni, l-iffullar, jew il-formulazzjoni qabel ma tissuspetta l-kampjun mhux magħruf.
Atlas illustrattiv tal-pjanċi
Il-pjanċi hawn taħt huma illustrazzjonijiet iġġenerati, mhux ritratti ta’ kulturi reali. Juru l-mudell li għandek tfittex, mhux l-isfumatura eżatta ta’ xi razza partikolari. Qabbilhom mar-ritratti ta’ referenza tal-ASM u ma’ pjanċi reali mil-laboratorju tat-tagħlim.
Pjanċa 1: Escherichia coli fuq agar EMB, fermentatur qawwi tal-lattożju
E. coli fuq agar EMB tipikament tkun vjola skur sa iswed blu, spiss b’ċentru skur u leqq aħdar metalliku minn produzzjoni qawwija ta’ aċidu. Il-leqq huwa s-sejba magħrufa li l-istudenti jfittxu, iżda ttrattah bħala evidenza ta’ sostenn aktar milli bħala definizzjoni. L-intensità tal-leqq tvarja skont ir-razza, il-ħin tal-inkubazzjoni, id-densità tal-kolonji, u l-angolu minn fejn tħares. In-nuqqas ta’ leqq ma jeskludix E. coli, u kolonja skura mingħajr leqq tindika diversi fermentaturi oħra. Agħżel kolonja iżolata sew għal kwalunkwe xogħol sussegwenti aktar milli tinterpreta settur iffullat.
Pjanċa 2: Klebsiella pneumoniae fuq agar EMB, fermentatur mukojdi
Klebsiella pneumoniae fuq agar EMB tipikament tifforma kolonji kbar, ileqqu u mukojdi fi sfumaturi minn roża vjola sa kannella vjola, spiss b’ċentri skuri iżda ġeneralment mingħajr leqq metalliku qawwi. Morfoloġija simili sseħħ b’fermentaturi relatati bħal Enterobacter. In-nisġa mukojdi u d-daqs tal-kolonja huma parti mill-interpretazzjoni: kolonja roża li hija żgħira u ċatta għandha piż interpretattiv differenti minn waħda kbira, imqabbża u mukojdi. Bħal fil-każ ta’ E. coli, il-pjanċa tissuġġerixxi fenotip ta’ fermentazzjoni, u l-identifikazzjoni fil-livell tal-ispeċi teħtieġ il-konferma bijokimika deskritta hawn taħt.
Pjanċa 3: Salmonella fuq agar EMB u nonfermentaturi oħra, kolonji bla kulur
Salmonella fuq agar EMB u organiżmi relatati li ma jiffermentawx il-lattożju, inklużi Shigella u ħafna iżolati ta’ Pseudomonas, tipikament jikbru bħala kolonji bla kulur sa trasluċidi jew ta’ lewn ambra ċar. Xi formulazzjonijiet u kundizzjonijiet jagħtu lewn ħafif roża, għalhekk kolonja roża ċar mhijiex awtomatikament fermentatur. EMB ma jiddistingwix bejn Salmonella u Shigella jew nonfermentaturi oħra; dik id-distinzjoni ssir b’testijiet aktar tard. Innota wkoll li ġew dokumentati razez ta’ Salmonella pożittivi għall-fermentazzjoni tal-lattożju b’kolonji metalliċi bħal dawk ta’ E. coli, li hija raġuni oħra għaliex pjanċa waħda ma tistax tagħti konklużjoni definittiva.
Pjanċa 4: Serratia marcescens u n-nassa tal-formulazzjoni
Serratia marcescens jistħoqqilha taqsima għaliha għaliex l-istudenti spiss jistennew kolonji ħomor u mbagħad jinterpretaw il-pjanċa ħażin. Il-biċċa l-kbira tal-iżolati kliniċi ma jiffermentawx il-lattożju, għalhekk fuq Levine EMB normalment jidhru ċari sa ftit ikkuluriti. Billi ħafna iżolati jiffermentaw is-sukrożju, formulazzjoni li fiha s-sukrożju tista’ tagħti reazzjoni aktar skura jew aktar assoċjata mal-aċidu. Lanqas m’għandek tistenna l-pigment aħmar klassiku prodigiosin f’35 sa 37 C; il-produzzjoni tal-pigment mhijiex affidabbli fit-temperatura tal-inkubatur. Meta l-protokoll isemmi Serratia marcescens fuq agar EMB, iċċekkja liema formulazzjoni qed tassumi d-dikjarazzjoni. Reviżjoni tal-metaboliżmu ta’ Serratia tiġbor fil-qosor il-mudell ta’ fermentazzjoni negattiva tal-lattożju u varjabbli tas-sukrożju wara din in-nassa.
Pjanċa 5: kontrolli u organiżmi inibiti
Organiżmi Gram-pożittivi bħal Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, u Bacillus ġeneralment jiġu inibiti jew imrażżna b’mod qawwi fuq agar EMB, għalkemm l-inibizzjoni mhijiex assoluta għal kull razza. Sett ta’ kontrolli jagħmel l-interpretazzjoni affidabbli: il-kontroll ta’ E. coli għandu juri tkabbir tajjeb b’kulur iswed blu u leqq, il-kontroll tan-nonfermentatur għandu juri tkabbir bla kulur, u l-kontroll tal-inibizzjoni għandu juri ftit tkabbir jew xejn. Jekk il-kontroll tal-inibizzjoni jikber sew, il-pass selettiv falla u kull interpretazzjoni oħra fuq dak il-lott tkun dubjuża. Il-metodi tat-tbajja’ jwieġbu mistoqsija differenti minn dik tal-mezzi tal-kultura; għall-parti tal-laboratorju li tittratta t-tbajja’ fuq slajds, ara l-atlas tat-tbajja’ bil-blu tal-metilen.
Tqabbil b’limiti ċari
| Osservazzjoni fuq agar EMB | Tifsira probabbli | Dak li ma tistabbilixxix |
|---|---|---|
| Kolonja skura ta’ kulur iswed blu b’leqq aħdar f’dawl oblikwu | Fermentazzjoni qawwija, E. coli fost il-kandidati ewlenin | L-identità tal-ispeċi; fermentaturi qawwija oħra jistgħu juru leqq |
| Kolonja kbira mukojdi ta’ kulur roża vjola, mingħajr leqq | Fermentatur b’karattru kapsulari, Klebsiella kandidat | Klebsiella pneumoniae speċifikament; Enterobacter tidher simili |
| Kolonja bla kulur jew trasluċida | Organiżmu li ma jiffermentax il-lattożju, pereżempju Salmonella, Shigella, Pseudomonas | Liema nonfermentatur; biex tiddistingwi Salmonella minn Shigella hemm bżonn testijiet oħra |
| Kolonja ċara fejn kien mistenni l-aħmar | Possibbilment Serratia fuq EMB b’lattożju biss f’37 C | In-nuqqas ta’ Serratia; iċċekkja l-formulazzjoni u t-temperatura |
| Ebda tkabbir jew kolonji ċkejkna mrażżna | Possibbilment inibizzjoni ta’ organiżmi Gram-pożittivi | Sterilità jew identità; xi razez jaħarbu mill-inibizzjoni |
Tliet sentenzi jiġbru fil-qosor id-dehriet li jistgħu jqarrqu. Kulur skur ma jfissirx E. coli, billi Klebsiella, Enterobacter, u fermentaturi oħra jiżviluppaw ċentri skuri mingħajr leqq. Roża ma jfissirx Klebsiella, billi fermentaturi moderati jew bil-mod u xi organiżmi normalment meqjusa bħala nonfermentaturi jidhru roża jew lewn lavanda. Il-leqq ma jfissirx E. coli definittivament, billi fermentaturi qawwija oħra jistgħu jipproduċuh. Il-protokoll tat-tagħlim u l-figuri tiegħu tal-kulturi mħallta juru kull wieħed minn dawn in-nuqqasijiet fl-interpretazzjoni.
Limiti tal-konferma
L-agar EMB juri fenotip, mhux speċi. Organiżmi differenti jistgħu jkollhom l-istess dehra tal-kolonja, u organiżmu wieħed jista’ jiddevja mill-istampa tiegħu fil-kotba skont ir-razza, l-età, l-iffullar, il-formulazzjoni, u l-inkubazzjoni. Huwa għalhekk li l-proċeduri tat-tagħlim u dawk kliniċi jittrattaw il-morfoloġija fuq EMB bħala preżuntiva.
Proċedura ġustifikabbli għal student hija: iddeskrivi l-kolonja iżolata (daqs, kulur, ċentru, leqq taħt dawl oblikwu, karattru mukojdi), irreġistra l-formulazzjoni, il-ħin u t-temperatura tal-inkubazzjoni, u l-kontrolli; imbagħad agħmel sottokultura ta’ kolonja iżolata sew biex tikseb kultura pura qabel kwalunkwe test ta’ konferma. Testijiet sussegwenti komuni jinkludu t-tbajja’ ta’ Gram flimkien mar-reazzjonijiet IMViC għall-identifikazzjoni preżuntiva ta’ E. coli u koliformi, TSI jew KIA u settijiet ta’ testijiet bijokimiċi speċifiċi għall-organiżmu għal organiżmi enteriċi, b’identifikazzjoni seroloġika, MALDI TOF, jew identifikazzjoni validata oħra fejn il-kompitu jeħtieġha. Għal tagħrif dwar fejn jidħol EMB fost il-mezzi enteriċi selettivi u differenzjali, ara introduzzjonijiet għall-mezzi tal-kultura enterika u testijiet sussegwenti għat-tbajja’ ta’ Gram. Għall-mistoqsija relatata dwar x’tista’ u x’ma tistax tipprova tbajja’ blu fuq slajd, l-atlas tat-tbajja’ bil-blu tal-metilen iżomm l-osservazzjoni u l-konklużjoni separati bl-istess mod.
Ikteb l-osservazzjoni qabel il-konklużjoni. "Kolonji skuri ta’ kulur iswed blu b’leqq aħdar li jiddependi mill-angolu fuq Levine EMB wara 24 siegħa, konsistenti ma’ fermentazzjoni qawwija tal-lattożju" hija dikjarazzjoni ġustifikabbli. "E. coli, ikkonfermata" teħtieġ il-pass ta’ konferma li l-pjanċa waħedha ma tistax tipprovdi.