L-Artikolu
Il-blu tal-metilene fit-testijiet tal-laboratorju tal-G6PD: x'qed tagħmel tassew iż-żebgħa
Student josserva żewġ tubi wara l-inkubazzjoni. Wieħed ħa l-kulur mistenni. L-ieħor le. L-istudent jikkonkludi li t-tieni pazjent għandu defiċjenza ta' glukożju-6-fosfat deidroġenażi. Dik il-konklużjoni tista' tkun korretta, iżda r-raġunament jaqbeż il-kunċett li fuqu jaħdem it-test. Xejn fit-tubu ma jkejjel l-enzima direttament. It-tubu jkejjel dak li tipproduċi l-enzima, billi juża l-blu tal-metilene bħala intermedjarju.
Ladarba dan il-kejl indirett ikun ċar, il-proċedura, il-kontrolli u l-lista twila ta' riżultati foloz ma jibqgħux jidhru arbitrarji.
It-tweġiba fil-qosor
Il-blu tal-metilene fit-testijiet tal-G6PD huwa indikatur redox. L-enzima G6PD tiġġenera NADPH, u sistemi li jiddependu fuq in-NADPH jirriduċu l-blu tal-metilene blu għall-forma lewko tiegħu, li hija bla kulur (jew jużawh biex jittrasferixxu l-elettroni). Attività normali tal-enzima tagħti riduzzjoni effiċjenti. Attività defiċjenti tagħti riduzzjoni bil-mod jew mhux kompluta. Dan huwa s-sinjal kollu.
Żewġ metodi storiċi jużaw l-istess żebgħa iżda għandhom punti finali differenti. Żommhom distinti u l-biċċa l-kbira tal-konfużjoni tisparixxi.
Żewġ testijiet, żebgħa waħda, punti finali differenti
L-ewwel wieħed huwa t-test dirett tar-riduzzjoni tal-blu tal-metilene, deskritt minn Sass u l-kollegi tiegħu u evalwat aktar tard minn Gibbs. Hawnhekk il-punt finali huwa ż-żebgħa nnifisha: il-blu tal-metilene ossidat, li huwa blu, jiġi ridott lejn il-forma lewko bla kulur, u r-rata ta' dik il-bidla tirrifletti l-kapaċità li jiġi ġġenerat NADPH. L-artiklu oriġinali dwar l-iskrinjar huwa indiċjat fuq PubMed taħt Sass et al. (1966).
It-tieni wieħed huwa t-test ta' Brewer għar-riduzzjoni tal-metemoglobina. In-nitrit tas-sodju l-ewwel jossida l-emoglobina għal metemoglobina kannella. Il-blu tal-metilene mbagħad jaġixxi bħala medjatur tat-trasferiment tal-elettroni: il-blu tal-metilene ridott jgħaddi ekwivalenti riduċenti lill-metemoglobina, u jibdilha lura f'emoglobina ħamra. Għalhekk il-punt finali viżibbli huwa kannella kontra aħmar, mhux blu kontra bla kulur. Il-metodu oriġinali deher fil-Bulletin tal-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa (Brewer et al., 1960).
Li ssejjaħ l-analiżi ta' Brewer test ta' dekolorazzjoni taż-żebgħa mhuwiex preċiż kimikament. Iż-żebgħa tgħaddi minn ċiklu; l-emoglobina tbiddel il-kulur. Id-dijagramma hawn taħt turi ż-żewġ mogħdijiet.
Ir-reazzjoni sottostanti
Il-G6PD tikkatalizza l-ewwel pass ossidattiv tal-mogħdija tal-fosfat tal-pentożju:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Iċ-ċelloli ħomor maturi jiddependu ħafna fuq din il-mogħdija għan-NADPH, kif diskuss fir-reviżjoni ta' Luzzatto u l-kollegi tiegħu f'Blood (2020). In-NADPH iżomm il-glutatijon ridott u jipproteġi ċ-ċellola mill-ħsara ossidattiva. Il-blu tal-metilene jidħol f'din is-sistema bħala aċċettatur tal-elettroni. G6PD suffiċjenti tagħti NADPH suffiċjenti, li jagħti riduzzjoni effiċjenti. Livell baxx ta' G6PD jaqta' l-katina fl-ewwel ħolqa tagħha.
Aħseb fiż-żebgħa bħala indikatur tal-livell tal-fjuwil, mhux bħala l-magna. Turi l-provvista tan-NADPH. Kwalunkwe ħaġa oħra li tbiddel dik il-provvista, jew il-qari, tista' ċċaqlaq il-labra mingħajr ebda bidla fil-ġene.
Kif titwettaq il-proċedura tat-tip Brewer
Il-formulazzjonijiet tar-reaġenti nbidlu matul id-deċennji, għalhekk deskrizzjoni għat-tagħlim m'għandhiex titqies bħala protokoll kliniku. Kull laboratorju jsegwi l-proċedura operattiva standard ivvalidata tiegħu. B'din it-twissija, l-arranġament klassiku tat-tubi jaħdem kif ġej, f'forma dokumentata bi tliet tubi u inkubazzjoni ta' 3 sigħat f'din l-implimentazzjoni ppubblikata:
- Tubu tal-pazjent: demm sħiħ flimkien ma' glukożju, nitrit tas-sodju u blu tal-metilene. In-nitrit joħloq il-metemoglobina, il-glukożju jsostni l-metaboliżmu taċ-ċelloli ħomor, u ż-żebgħa tipprovdi l-mezz tat-trasferiment li jiddependi fuq in-NADPH.
- Kontroll ossidat: demm flimkien ma' nitrit u glukożju iżda mingħajr blu tal-metilene. Juri l-punt finali kannella tal-metemoglobina, ix-xejra defiċjenti.
- Kontroll tal-emoglobina: demm flimkien ma' ilma. Juri l-punt finali aħmar tal-emoglobina, ix-xejra normali.
- Inkuba t-tubi kollha qrib 37 C, tipikament għal 3 sigħat, waqt li tħallat bil-mod.
- Iddilwixxi alikwota żgħira minn kull tubu f'ilma ddistillat biex tilizza ċ-ċelloli u tagħmel it-tqabbil tal-kuluri faċli biex jinqara.
- Qabbel it-tubu tal-pazjent maż-żewġ kontrolli. Ritorn lejn l-aħmar jindika kapaċità riduċenti sostanzjali. Il-persistenza lejn il-kannella tissuġġerixxi defiċjenza qawwija.
Formulazzjoni storika waħda kienet tuża madwar 1 mL ta' demm b'reaġenti f'konċentrazzjonijiet qrib 180 mM ta' nitrit tas-sodju, 280 mM ta' destrożju u 0.4 mM ta' blu tal-metilene. Qis dawn in-numri bħala eżempju mil-letteratura, mhux bħala speċifikazzjoni universali.
Il-qari tar-riżultat
| Xejra | Dehra fit-test ta' Brewer | Tifsira |
|---|---|---|
| Normali | It-tubu tal-pazjent joqrob lejn il-kontroll tal-emoglobina ħamra | Kapaċità riduċenti ogħla mil-limitu tal-iskrinjar |
| Defiċjenti | It-tubu tal-pazjent jibqa' kannella, qrib il-kontroll tal-metemoglobina | L-iskrinjar jissuġġerixxi defiċjenza qawwija ta' G6PD |
| Intermedja | Il-kulur jinsab bejn il-kontrolli | Tassenjax fenotip; kejjel l-attività b'mod kwantitattiv |
Skrinjar kwalitattiv jiddistingwi l-aħjar madwar 30 sa 40 fil-mija tal-attività normali, kif diskuss f'din ir-reviżjoni f'Malaria Journal dwar il-lakuni fl-identifikazzjoni tal-G6PD. Għalhekk riżultat normali tal-iskrinjar ifisser li l-analiżi ma sabitx defiċjenza severa. Ma jiċċertifikax attività kompletament normali.
Għaliex l-iskrinjar jista' jqarraq
Ir-retikuloċitożi wara l-emoliżi hija l-każ klassiku ta' riżultat falz normali. Iċ-ċelloli ħomor żgħażagħ u r-retikuloċiti fihom aktar G6PD minn ċelloli qodma. Matul episodju emolitiku akut, l-eqdem ċelloli, li huma l-aktar defiċjenti, jistgħu jkunu diġà nqerdu, u tħalli popolazzjoni żagħżugħa li l-attività tagħha tidher normali fit-test. L-istess bijoloġija tqarraq ukoll bl-analiżijiet kwantitattivi, mhux biss bl-iskrinjar li juża ż-żebgħa.
Trasfużjoni riċenti taħbi d-defiċjenza għax iċ-ċelloli ħomor tad-donatur jikkontribwixxu l-enzima tagħhom stess għall-kampjun. Mayo Clinic Laboratories telenka t-trasfużjoni fost il-kawżi ta' riżultati tal-enzima mhux affidabbli, flimkien mar-retikuloċitożi u l-interferenza mil-lewkoċiti.
In-nisa eterożigoti huma l-aktar każ diffiċli. L-inattivazzjoni każwali tal-kromożoma X tipproduċi taħlita ta' ċelloli ħomor normali u defiċjenti, u l-attività ġenerali tista' tkun kullimkien bejn defiċjenza severa u attività li tidher normali. L-iskrinjar kwalitattiv ta' spiss ma jidentifikax fenotipi intermedji. Id-dokumentazzjoni tal-WHO dwar it-testijiet tal-G6PD tiddiskuti din il-limitazzjoni fid-dettall.
L-età tal-kampjun, it-temperatura tal-ħażna, is-suġġettività tal-punt finali viżwali, l-ematokrit u l-kwalità tar-reaġenti jżidu varjabbiltà analitika ma' dawn l-effetti bijoloġiċi.
L-iskrinjar mhuwiex dijanjosi
Riżultat tal-iskrinjar defiċjenti, intermedju jew li ma jaqbilx mal-istampa klinika jeħtieġ analiżi kwantitattiva tal-enzima G6PD. Il-WHO tqis l-ispettrofotometrija kwantitattiva b'temperatura kkontrollata bħala l-approċċ ta' referenza. F'dik l-analiżi, jiżdiedu glukożju-6-fosfat u NADP+ ma' emoliżat taċ-ċelloli ħomor, u n-NADPH iffurmat jiġi segwit miż-żieda fl-assorbanza f'340 nm. Ir-rata tal-bidla hija proporzjonali għall-attività tal-enzima, normalment normalizzata għall-emoglobina bħala unitajiet għal kull gramma. Il-prattika attwali tal-laboratorji kliniċi hija miġbura fil-paġna tal-katalgu tat-testijiet ta' Mayo għall-attività tal-G6PD.
L-interpretazzjoni tuża l-medda ta' referenza vvalidata mil-laboratorju, li spiss tiġi espressa b'relazzjoni mal-attività normali tal-popolazzjoni; id-defiċjenza normalment tiġi diskussa qrib il-limitu ta' 30 fil-mija u l-attività intermedja 'l fuq minnu. Il-profili tal-prodotti fil-mira tal-WHO għat-testijiet tal-G6PD (2022) jistabbilixxu dak il-qafas dijanjostiku. Jekk emoliżi jew trasfużjoni riċenti tagħmel id-determinazzjoni tal-fenotip mhux affidabbli, irrepeti t-test wara li l-popolazzjoni taċ-ċelloli ħomor terġa' tibbilanċja ruħha, u t-testijiet molekulari jistgħu jżidu informazzjoni mingħajr ma jieħdu post il-kejl tal-enzima.
Distinzjoni li ta' min iżomm
Il-blu tal-metilene f'dawn l-analiżijiet huwa reaġent tal-laboratorju ex vivo. Dan il-fatt jappartjeni għal diskussjoni differenti minn dik dwar is-sigurtà tal-għoti tal-blu tal-metilene lil pazjent, li hija koperta fil-gwida dwar il-kontraindikazzjonijiet tal-blu tal-metilene. Il-bijokimika torbothom flimkien, għax il-mediċina tiddependi wkoll fuq riduzzjoni li tiddependi fuq in-NADPH, iżda żebgħa f'tubu tat-test mhijiex doża fiċ-ċirkolazzjoni tad-demm. Għal kuntest dwar kif taġixxi ż-żebgħa fit-tbajja' f'ambjent differenti, ara l-prinċipji tat-tbajja' bil-blu tal-metilene, u għall-familja kimika li tappartjeni għaliha, iż-żebgħat redox fil-laboratorju.
L-iskrinjar jistaqsi jekk il-kapaċità riduċenti tidhirx intatta. Il-konferma tistaqsi kemm hemm enzima tassew. Iż-żebgħa sservi tajjeb l-ewwel mistoqsija, sakemm ħadd ma jitlobha twieġeb it-tieni waħda.