Il-blu tal-metilen għat-tbajja’ tad-DNA u tal-RNA: applikazzjonijiet fil-gels u fuq il-membrani

Student jagħmel elettroforeżi fuq gel tal-agarose, itebbgħu bil-blu tal-metilen, u ma jara xejn fejn kien jistenna faxxa ċara. Fl-istazzjon ta’ ħdejh, riċerkatur postdottorali jtebba’ membrana Northern mill-istess flixkun taż-żebgħa blu u jikseb faxex ribosomali ċari fi tliet minuti. L-istudent jikkonkludi li l-gel falla. Il-gel ma falliex. Iż-żewġ kompiti kienu differenti, u l-istess żebgħa twettaqhom b’sensittività differenti, bi sfond differenti, u b’regoli differenti għall-passi li jmiss.

It-tbajja’ tad-DNA u t-tbajja’ tal-RNA bil-blu tal-metilen għandhom l-istess kimika, iżda mhux l-istess għan. F’gel, iż-żebgħa turi kemm hemm aċidu nuklejku ġo matriċi poruża. Fuq membrana, turi jekk it-trasferiment ħadimx u jekk il-korsiji ġewx mgħobbija b’mod uniformi. Ladarba din id-distinzjoni tkun ċara, il-protokolli, il-limiti tad-detezzjoni u l-limiti tal-kompatibbiltà jsiru jinftiehmu.

It-tweġiba fil-qosor

Il-blu tal-metilen huwa żebgħa katjonika planari li tintrabat mal-aċidi nuklejċi b’mod mhux kovalenti u riversibbli, permezz ta’ taħlita ta’ attrazzjoni elettrostatika lejn il-fosfat, interkalazzjoni bejn il-pari ta’ bażijiet, u assoċjazzjoni mal-kanal minuri. Din ir-riversibbiltà hija l-punt ewlieni. Il-faxex jistgħu jittebbgħu u jiġu osservati bid-dawl viżibbli, jiġu dokumentati, u mbagħad titneħħielhom iż-żebgħa jew jiġu ppurifikati għall-klonazzjoni, l-ibridizzazzjoni jew l-użu mill-ġdid ta’ sonda.

Għat-tbajja’ tad-DNA b’żewġ ktajjen f’gel tal-agarose bil-blu tal-metilen, ir-riċetta rapida standard hija 0.02 percent w/v (200 micrograms għal kull mL) fl-ilma, madwar 15-il minuta ta’ tbajja’ u madwar 15-il minuta ta’ tneħħija taż-żebgħa bl-ilma, b’osservazzjoni fuq kaxxa tad-dawl abjad. Għall-membrani, ir-riċetta klassika tal-Northern blot hija 0.02 sa 0.04 percent żebgħa fl-aċetat tas-sodju qrib pH 5.2, diversi minuti ta’ tbajja’ wara t-trasferiment u l-immobilizzazzjoni, imbagħad tlaħliħ bl-ilma u tneħħija sħiħa taż-żebgħa qabel l-ibridizzazzjoni. Is-sensittività hija modesta: għexieren sa mijiet ta’ nanogrammi għal kull faxxa tal-gel f’kundizzjonijiet tajbin, u gwidi konservattivi jindikaw 0.5 sa 1 microgram. Dan huwa diversi ordnijiet ta’ kobor ogħla mil-limiti tal-bromur tal-etidju u taż-żebgħat SYBR. Fuq il-membrani ma hemmx limitu wieħed utli għad-detezzjoni ta’ traskritt individwali, għax iż-żebgħa turi l-aktar RNA ribosomali abbundanti u l-materjal totali mgħobbi. Tużax soluzzjoni ta’ suppliment mibjugħa bl-imnut minflok iż-żebgħa f’ebda waħda mir-riċetti. Il-metodi vvalidati jassumu żebgħa ta’ grad analitiku, buffers definiti, u mmaniġġjar ħieles minn RNase fejn ikun involut l-RNA.

Kif jaħdem l-irbit, u fejn jista’ jqarraq

Il-mudell utli għandu tliet partijiet. L-ewwel, is-sistema taċ-ċrieki bi ħlas pożittiv tiġi attirata lejn l-iskeletru tal-fosfat bi ħlas negattiv. Studji spettroskopiċi jsibu li din il-komponent elettrostatika tiddomina f’konċentrazzjonijiet baxxi ta’ melħ, filwaqt li l-immudellar u d-dinamika molekulari jżommu l-interkalazzjoni u l-irbit mal-kanal minuri bħala modi stabbli għad-DNA b’żewġ ktajjen, kif miġbur fil-qosor fi studju spettroskopiku dwar l-irbit tal-blu tal-metilen mad-DNA. It-tieni, teżisti ċerta preferenza għall-GC: l-immudellar jiffavorixxi passi CpG u GpC, u esperimenti jirrapportaw assoċjazzjoni preferenzjali ma’ duplessi rikki fil-GC f’xogħol dwar il-preferenzi tal-interkalazzjoni tal-blu tal-metilen, iżda d-duplessi AT jintrabtu wkoll. It-tbajja’ ta’ rutina mhijiex speċifika għal sekwenza. It-tielet, id-DNA b’katina waħda u l-RNA jintrabtu l-aktar permezz tal-elettrostatika u l-istivar mal-bażijiet aċċessibbli u mar-reġjuni duplessi, u għalhekk l-intensità tat-tbajja’ tvarja skont it-tul, is-sekwenza u l-istruttura sekondarja.

Minn dan joħorġu żewġ konsegwenzi. Minħabba li l-irbit mhuwiex kovalenti, iż-żebgħa titneħħa bil-ħasil. Il-faxex tal-poliakrilammid jiċċaraw malajr sakemm ma jiġux iffissati apposta, u teżisti varjant speċifiku ta’ fissazzjoni permanenti proprju għax it-tbajja’ normali hija temporanja, kif deskritt minn Soto u Draper għall-gels PAGE. Minħabba li ż-żebgħa hija fotosensibilizzatur, illuminazzjoni qawwija u fit-tul tad-DNA mtebba’ fil-preżenza tal-ossiġnu tista’ tossida l-gwanina u eventwalment toħloq qtugħ f’katina, mekkaniżmu spjegat fid-dettall f’xogħol dwar l-ossidazzjoni tal-gwanina fotosensibilizzata bil-blu tal-metilen. Osservazzjoni qasira bid-dawl abjad tevita l-ħsara magħrufa tal-UV fil-flussi tax-xogħol klassiċi bil-bromur tal-etidju, u dan huwa vantaġġ reali għall-irkupru preparattiv. Id-dawl viżibbli jagħmel inqas ħsara, iżda mhuwiex bla ħsara. Żomm l-illuminazzjoni qasira meta d-DNA jkun se jintuża għall-klonazzjoni. Għall-fotokimika usa’ wara din il-kawtela, ara ż-żewġ mogħdijiet fil-fotokimika tal-blu tal-metilen. Għall-par redox u l-istati tal-ħlas li jispjegaw għaliex il-forma ossidata tintrabat u l-forma mnaqqsa ma tintrabatx, ara l-kimika tal-istruttura u l-proprjetajiet tal-blu tal-metilen.

L-ewwel kompitu: tbajja’ ġewwa l-gels

It-tbajja’ tal-gels twieġeb mistoqsija waħda: hemm biżżejjed aċidu nuklejku f’din il-faxxa biex jidher bl-għajn? Id-DNA b’żewġ ktajjen fl-agarose huwa l-każ studjat bl-aktar dettall. Il-metodu oriġinali ta’ Flores u l-kollegi għall-gels bil-blu tal-metilen ivvalida l-protokoll rapidu ta’ 0.02 percent fuq agarose ta’ 1 percent u wera rkupru u klonazzjoni b’suċċess wara t-tbajja’. L-istess protokoll tal-fornitur jidher fuq il-paġna tal-prodott tal-blu tal-metilen ta’ IBI Scientific, li telenka r-riċetta ta’ 0.04 percent għall-membrani u l-varjant rapidu għall-gels ħdejn xulxin.

Fluss tax-xogħol prattiku:

1. Agħmel l-elettroforeżi tal-gel bħas-soltu. Tebba’ wara l-elettroforeżi, mhux matulha, sakemm it-trasferiment jew ir-riżoluzzjoni ma jkunux ġew ivvalidati għal metodu modifikat.
2. Għaddas f’0.02 percent w/v blu tal-metilen f’ilma distillat, b’aġitazzjoni ħafifa, għal madwar 15-il minuta.
3. Neħħi ż-żebgħa billi tibdel l-ilma diversi drabi, għal madwar 15-il minuta b’kollox, sakemm il-kulur tal-isfond tal-matriċi jonqos u l-faxex jispikkaw.
4. Ħu ritratt minnufih fuq illuminatur bid-dawl abjad.

L-agarose u l-poliakrilammid iġibu ruħhom b’mod differenti. L-agarose iżomm iż-żebgħa fil-matriċi, għalhekk it-tneħħija taż-żebgħa hija l-pass bil-mod. Gels irqaq tal-poliakrilammid jittebbgħu malajr iżda wkoll jitilfu ż-żebgħa malajr, u dan jgħin fil-qtugħ preparattiv iżda jagħmel ħsara lir-rekords arkivjali. Oligonukleotidi sintetiċi fil-poliakrilammid jistgħu jiġu lokalizzati bl-istess riċetta ta’ 0.02 percent fi 20 sa 30 minuta b’ħasil ripetut bl-ilma, skont metodi PAGE stabbiliti tat-tip Current Protocols. Ġew irrappurtati varjanti dilwiti ħafna qrib 0.0002 percent f’TBE dilwit għal oligonukleotidi preparattivi fuq medda ta’ diversi sigħat, iżda l-bażi tal-evidenza hija aktar dgħajfa.

Id-differenza bejn id-DNA u l-RNA hija importanti. Id-DNA b’żewġ ktajjen jagħti l-aktar irbit strutturat b’saħħtu. L-RNA u d-DNA b’katina waħda jittebbgħu, iżda b’mod aktar dgħajjef u inqas prevedibbli. Għall-gels tal-RNA tal-agarose bil-formaldeid, il-biċċa l-kbira tal-laboratorji jaqbżu t-tbajja’ bil-blu fil-gel u l-ewwel jittrasferixxu l-RNA għal membrana, imbagħad itebbgħuh hemm. Dan il-pass jissostitwixxi sinjal dgħajjef fil-gel b’sinjal aktar ċar fuq il-membrana u rekord tat-tagħbija.

It-tieni kompitu: tbajja’ fuq il-membrani

It-tbajja’ tal-membrani twieġeb mistoqsija differenti: it-trasferiment ħadem, u l-korsiji huma komparabbli? L-applikazzjoni klassika hija t-tbajja’ riversibbli tal-Northern blot ta’ Herrin u Schmidt, oriġinarjament 0.04 percent żebgħa f’50 mM aċetat tas-sodju f’pH 5.0 għal 2 sa 3 minuti bi tlaħliħ bl-ilma, li titneħħa b’SDS dilwit f’SSPE qabel l-ibridizzazzjoni.

Il-varjant modern użat ħafna jsir kif ġej:

1. Ittrasferixxi l-RNA jew id-DNA żnaturat fuq najlon jew nitroċelluloża, imbagħad immobilizzah permezz ta’ ħolqien ta’ rabtiet trasversali bl-UV jew tisħin f’forn sabiex il-kampjun ma jintilifx waqt it-tbajja’.
2. Mhux obbligatorju iżda komuni: xarrab il-membrana f’aċidu aċetiku ta’ 5 percent għal madwar 15-il minuta.
3. Tebba’ għal 5 sa 10 minuti f’0.02 sa 0.04 percent blu tal-metilen f’0.3 sa 0.5 M aċetat tas-sodju qrib pH 5.2.
4. Laħlaħ u neħħi ż-żebgħa fl-ilma għal 5 sa 15-il minuta, iddokumenta, imbagħad neħħi ż-żebgħa residwa qabel l-ibridizzazzjoni.

In-najlon bi ħlas pożittiv jiddomina fix-xogħol Northern. In-nitroċelluloża taħdem ukoll bl-istess fluss tax-xogħol bl-aċidu aċetiku u l-aċetat. L-immaġni tintuża biex tikkonferma t-trasferiment, tqabbel il-faxex 28S u 18S (jew 23S u 16S għall-RNA batterjali), timmarka s-slielem u l-istandards, u żżomm rekord approssimattiv tan-normalizzazzjoni tal-RNA totali. Metodi Northern ippubblikati jikkwantifikaw il-faxex ribosomali mtebbgħin għall-kontroll tat-tagħbija, inkluż xogħol fix-xjenza tal-ħalib li uża faxex ribosomali mtebbgħin bil-blu tal-metilen għan-normalizzazzjoni. Il-membrani Southern jistgħu jiġu viżwalizzati bl-istess mod, iżda ż-żebgħa hija ferm aktar stabbilita bħala kontroll tat-tagħbija u tat-trasferiment fin-Northern, u d-DNA tas-Southern jiġi żnaturat qabel it-trasferiment, għalhekk iċ-ċifri tas-sensittività tal-gels ma japplikawx direttament.

Il-limiti tad-detezzjoni u l-isfond: fejn il-blu jitlef

Il-paragun ta’ hawn taħt huwa approssimattiv apposta. Il-prestazzjoni taż-żebgħa tiddependi fuq il-perċentwal tal-gel, il-wisa’ tal-faxxa, l-ottika u l-kura fit-tneħħija taż-żebgħa. Ittratta kull numru bħala ordni ta’ kobor, mhux bħala speċifikazzjoni.

Il-kontroll tal-isfond jiddetermina jekk is-sinjal modest jistax jintuża. Iż-żebgħa ħielsa għandha kulur intens, għalhekk il-kuntrast jiġi mit-tneħħija taż-żebgħa mhux marbuta mingħajr ma titneħħa dik marbuta. Żebgħa aktar ikkonċentrata rari żżid is-sensittività. Prinċipalment iżżid il-ħin meħtieġ biex titneħħa ż-żebgħa. Ittestja serje ta’ dilwizzjonijiet bl-istess gel, membrana u kamera, u uża biss il-medda fejn id-densità integrata tibqa’ proporzjonali għall-kwantità introdotta. Il-blu tal-metilen jippermetti normalizzazzjoni semikwantitattiva tat-tagħbija. Mhuwiex test kwantitattiv b’medda dinamika għolja għax il-kapaċità tal-membrana, l-effiċjenza tat-trasferiment, is-saturazzjoni u t-tneħħija taż-żebgħa jvarjaw minn korsija għal oħra.

Il-limiti tal-kompatibbiltà: x’jibqa’ possibbli wara t-tbajja’

Il-klonazzjoni wara t-tbajja’ bil-blu ġiet murija. Flores u l-kollegi qatgħu faxex tal-agarose mtebbgħin, irkupraw id-DNA, u wettqu ligazzjoni u trasformazzjoni bih, u rrappurtaw klonazzjoni aħjar milli wara l-użu tal-bromur tal-etidju bl-UV. Ir-raġuni probabbli hija inqas ħsara mid-dawl, mhux benefiċċju miż-żebgħa nnifisha. Żomm l-espożizzjoni għad-dawl abjad qasira u ppurifika d-DNA rkuprat permezz ta’ proċedura normali ta’ estrazzjoni mill-gel.

L-evidenza għall-PCR u s-sekwenzar hija aktar limitata. Iż-żebgħa residwa tintrabat mal-aċidi nuklejċi, għalhekk neħħi ż-żebgħa u ppurifika qabel il-passi enżimatiċi. Huwa mistenni li DNA ppurifikat sew minn gel blu jaħdem, iżda t-tolleranza għaż-żebgħa li tinġarr direttament għall-pass li jmiss mhijiex ikkwantifikata sew għall-polimerażi u l-kimiki tas-sekwenzar differenti. Tassumihiex.

L-ibridizzazzjoni tal-blot hija kompatibbli meta l-ordni tiġi segwita strettament: trasferiment, immobilizzazzjoni, tbajja’, dokumentazzjoni, tneħħija taż-żebgħa, ibridizzazzjoni. Dik is-sekwenza hija d-disinn ta’ Herrin u Schmidt. It-tbajja’ qabel it-trasferiment, jew il-qbiż tat-tneħħija taż-żebgħa, hija metodu differenti u teħtieġ il-validazzjoni tagħha stess. Wara t-tneħħija taż-żebgħa, it-tneħħija standard tas-sonda u l-użu mill-ġdid ta’ sonda jipproċedu bħas-soltu. Għat-tbajja’ fil-livell taċ-ċelloli bl-istess familja ta’ żebgħat u għaliex il-loġika ta’ preparati ffissati ma tapplikax għall-metodi taċ-ċelloli ħajjin, ara l-atlas tat-tbajja’ fil-mikroskopija.

Il-qtugħ tal-faxex jaħdem għall-agarose preparattiv u għall-oligonukleotidi PAGE lokalizzati bil-blu, sakemm jiġi evitat il-varjant ta’ fissazzjoni permanenti. L-elettroeluzzjoni wara t-tneħħija taż-żebgħa hija kimikament plawżibbli għal sustanza li tintrabat b’mod riversibbli, iżda d-data kkontrollata dwar ir-rendiment speċifika għall-blu tal-metilen hija skarsa. Neħħi l-melħ jew ippreċipita wara l-eluzzjoni.

Problemi li jirrepetu ruħhom

Faxex ħfief fil-gel normalment ifissru massa żgħira wisq għal żebgħa kolorimetrika, speċjalment għal miri qosra b’katina waħda jew tal-RNA. Għabbi aktar materjal, uża żebgħa friska, estendi l-ħin tat-tbajja’ qabel iżżid il-konċentrazzjoni, u waqqaf it-tneħħija taż-żebgħa aktar kmieni. Gel kollu blu mingħajr kuntrast normalment ifisser tbajja’ żejda jew ftit wisq tibdil tal-ilma. Faxex PAGE li jiċċaraw huma riżultat mistenni tal-kimika, mhux tbajja’ li falliet. Ħu ritratt malajr. Sfond mhux uniformi fuq membrana jindika tiwi, bżieżaq, marki tas-swaba’, aġitazzjoni mhux uniformi jew trasferiment mhux uniformi. Tinterpretax dan bħala tagħbija mhux ugwali mingħajr kontroll bl-ibridizzazzjoni. Mudell ribosomali dgħajjef u mċajpar jista’ jfisser degradazzjoni, iżda wkoll trasferiment mhux komplut, ftit wisq RNA totali (korsiji tipiċi jkun fihom diversi mikrogrammi sa għexieren ta’ mikrogrammi), jew tneħħija eċċessiva taż-żebgħa. Iż-żebgħa turi RNA ribosomali abbundanti. Ma turix traskritt speċifiku. Dak huwa xogħol is-sonda.

Sigurtà u mmaniġġjar mingħajr pretensjonijiet żejda

Il-blu tal-metilen huwa aktar sempliċi biex timmaniġġjah mill-bromur tal-etidju, iżda mhuwiex bla ħsara. Skeda attwali tad-data tas-sigurtà ta’ MilliporeSigma tikklassifika ż-żebgħa bħala tossiċità orali akuta tal-Kategorija 4, ta’ ħsara jekk tinbela’, b’rimi permezz ta’ rotta approvata għall-iskart skont l-SDS tal-blu tal-metilen ta’ Sigma-Aldrich. Il-bromur tal-etidju għandu twissijiet aktar qawwija dwar il-ġenotossiċità, inklużi effetti ssuspettati fuq iċ-ċelloli ġerminali fl-SDS tal-bromur tal-etidju ta’ Sigma-Aldrich, u l-gels u s-soluzzjonijiet tiegħu spiss jinżammu separati bħala skart kimiku perikoluż kif indikat fil-gwida ta’ Thermo Fisher għaż-żebgħat tal-aċidi nuklejċi. Segwi l-SDS u r-regoli istituzzjonali għat-tnejn. Żomm iż-żebgħa niexfa magħluqa sew u niexfa, erġa’ uża s-soluzzjoni tax-xogħol taż-żebgħa biss kif jippermetti l-protokoll, aħżen il-membrani mtebbgħin niexfa bejn folji tal-filtru, u ħu ritratti tal-gels qabel ma l-faxex jinfirxu bid-diffużjoni.

Ftakar fil-frażi għall-bank tal-laboratorju. Il-gels jittestjaw il-viżibbiltà b’tagħbija għolja taħt dawl abjad. Il-membrani jittestjaw it-trasferiment u t-tagħbija qabel ma s-sonda tagħmel ix-xogħol sensittiv. Żebgħa waħda taqdi t-tnejn, b’sensittività modesta, irbit riversibbli u ordni stretta tal-operazzjonijiet.