Il-blu tal-metilen fir-riċerka fuq il-ħut żebra: addittiv tat-trobbija u fattur ta’ konfużjoni sperimentali

L-ilma tal-bajd tal-ħut żebra spiss ikollu lewn blu ċar, u kważi ħadd ma jniżżel għaliex. Iż-żebgħa hija l-blu tal-metilen, miżjuda kontra l-fungi, u l-biċċa l-kbira tal-protokolli jqisuha bħala parti mill-isfond. L-isfond huwa l-kunċett żbaljat hawnhekk. Kunċett aħjar huwa fattur sperimentali mhux elenkat: xi ħaġa preżenti fid-dixxijiet ittrattati u assenti fil-kontrolli, farmakoloġikament attiva fil-konċentrazzjonijiet użati, u kapaċi tbiddel proprju l-parametri finali li jkejjel l-esperiment.

Din id-distinzjoni tiggwida dak kollu li ġej. It-trobbija b’użu ta’ rutina kontra l-fungi hija kwistjoni waħda. Jekk l-addittiv huwiex newtrali għall-assaġġ tiegħek hija kwistjoni oħra. Il-letteratura reċenti dwar il-ħut żebra twieġeb l-ewwel waħda b’mod rassiguranti u t-tieni b’mod inkwetanti.

X’jippreskrivu fil-fatt il-linji gwida

Ma hemmx standard wieħed, u dan huwa parti mill-problema. Il-gwida tal-Kunsill Kanadiż dwar il-Kura tal-Annimali tippermetti 0.5 mg/L, jew 0.00005%, fis-soluzzjoni għat-trasport tal-bajd u l-larvi biex jitnaqqas it-tkabbir tal-fungi. Il-gwida Ewropea dwar l-annimali tal-laboratorju tiddeskrivi embrijuni miżmuma f’medju li spiss ikun fih l-istess 0.00005%. Ir-riċetta E3 ta’ Cold Spring Harbor tispeċifika d-doppju, 1 mg/L jew 0.0001%, bħala ingredjent tar-riċetta. Min-naħa l-oħra, hemm ommissjoni li tispikka: il-linja gwida tal-OECD għat-test tat-tossiċità fuq l-embrijuni tal-ħut tispeċifika ilma tad-dilwizzjoni rikostitwit u s-sustanza kimika tat-test, mingħajr ebda rakkomandazzjoni dwar il-blu tal-metilen la fil-verżjoni tal-2013 u lanqas fir-reviżjoni ta’ wara. Għalhekk laboratorju wieħed irabbi embrijuni tal-ħut żebra bil-blu tal-metilen f’ilma blu mill-ewwel sigħat tal-ħajja, ieħor iwettaq l-assaġġ regolatorju tal-embrijuni f’ilma ċar, u t-tnejn isejħu l-medju tagħhom normali. Kull min iqabbel ir-riżultati bejn il-laboratorji, jew jiġbor flimkien kontrolli storiċi, jiret dik l-inkonsistenza.

Biex il-konċentrazzjonijiet jitqiegħdu f’kuntest, 0.00005% huwa madwar 1.56 mikromolari u 0.0001% madwar 3.13 mikromolari. Dawn huma numri baxxi, u faċli titħajjar tqishom baxxi wisq biex ikollhom importanza. L-istudji hawn taħt jittestjaw proprju dik is-suppożizzjoni, proprju f’dawk il-konċentrazzjonijiet.

Il-qarrejja li ġejjin mit-trobbija tal-ħut aktar milli mil-laboratorju jiltaqgħu mal-istess molekula f’kuntest differenti, diskuss fil-gwida għall-blu tal-metilen fl-akkwarju. Il-kimika hija l-istess; id-diskussjoni dwar kif iż-żebgħa tittrasferixxi l-elettroni fiċ-ċelloli tispjega għaliex kompost attiv fir-redox jibqa’ jidher f’artikli dwar il-metaboliżmu. Dak li ġej huwa speċifiku għall-ilma tal-bajd tal-ħut żebra bil-blu tal-metilen.

Il-metaboliżmu: l-effett ibiddel id-direzzjoni skont l-istadju

L-aktar studju informattiv espona ħut żebra li kien qed jiżviluppa normalment mill-ewwel jum tal-ħajja sa 5 ijiem wara l-fertilizzazzjoni u kejjel il-metaboliżmu ossidattiv f’kull stadju, kif jiddeskrivi r-rapport ippubblikat tal-esperimenti dwar il-metaboliżmu tal-embrijuni. Tajjeb li l-mudell jiġi deskritt bir-reqqa għax id-direzzjoni tiegħu tinqaleb.

F’jum 1 wara l-fertilizzazzjoni, il-konsum bażali tal-ossiġnu żdied fl-embrijuni esposti fiż-żewġ konċentrazzjonijiet tat-trobbija. F’jum 2, il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali fis-saff tal-wiċċ tal-larvi kien ogħla fl-espożizzjonijiet ta’ 0.00005%, 0.0001% u 0.0003%. Sa 4 sa 5 ijiem, wara t-tfaqqis, id-direzzjoni kienet inqalbet: in-nefqa tal-enerġija ossidattiva naqset, kemm meta l-espożizzjoni kienet kontinwa mill-fertilizzazzjoni kif ukoll meta kienet akuta minn jum 3 sa jum 4 biss. Fl-istess ħin, it-traskritti għas-subunitajiet tal-kumplessi respiratorji mitokondrijali naqsu kemm f’jum 1 kif ukoll f’jum 4, flimkien ma’ traskritti marbuta mal-isterojdoġenesi u l-glukoneoġenesi.

Żewġ osservazzjonijiet oħra jagħmlu l-istampa aktar ċara. It-tfaqqis seħħ ftit qabel fil-konċentrazzjoni ogħla tat-trobbija, bl-embrijuni esposti jkunu aktar avvanzati f’jum 2 u l-kontrolli laħquhom sa jum 3. U l-assi tar-rispons għall-istress innifsu deher intatt: meta larvi ta’ 5 ijiem ġew soġġetti għal fattur ta’ stress li dawwarhom fl-ilma, il-kortisol fil-ġisem kollu żdied normalment fiż-żewġ gruppi. Għalhekk iż-żebgħa mhijiex velenu ġenerali għall-iżvilupp f’dawn id-dożi, u ma trażżanx kull rispons fiżjoloġiku. Tibdel il-metaboliżmu tal-enerġija b’mod li jiddependi mill-istadju: iżżidu qabel it-tfaqqis u tnaqqsu wara.

L-imġiba: għaliex żewġ studji ma jaqblux, u għaliex it-tnejn jistgħu jkunu korretti

Il-letteratura dwar l-imġiba tidher kontradittorja sakemm id-disinji tal-espożizzjoni jitqiegħdu ħdejn xulxin. Studju wieħed dwar is-sikurezza tal-iżvilupp u tal-imġiba espona embrijuni minn madwar 6 sigħat wara l-fertilizzazzjoni għal konċentrazzjonijiet sa 10 mikromolari, ġedded is-soluzzjonijiet kuljum sa jum 4, imbagħad ċaqlaq il-larvi għal medju mingħajr żebgħa għal jiem 5 u 6 u ttestja l-lokomozzjoni f’assaġġ tad-dawl u d-dlam f’jum 6. Ir-riżultat: ebda effett sinifikanti fuq il-mortalità, it-tfaqqis jew il-morfoloġija, u ebda effett tat-trattament fuq il-lokomozzjoni. L-awturi raġonevolment irrakkomandaw 10 mikromolari bħala limitu massimu taħt il-kundizzjonijiet tagħhom.

It-tieni grupp, b’xi awturi komuni mal-istudju tal-metaboliżmu, wettaq l-espożizzjoni kif fil-fatt issir fit-trobbija: iż-żebgħa preżenti minn 2 sa 3 sigħat wara l-fertilizzazzjoni b’tiġdid parzjali kuljum, u l-imġiba mkejla waqt li l-espożizzjoni kienet għadha għaddejja jew kienet reċenti. Fl-istess konċentrazzjonijiet ta’ rutina, il-larvi wrew lokomozzjoni mnaqqsa f’assaġġ ta’ 24 siegħa, riproduċibbli f’razez u laboratorji differenti, u l-istudju dwar il-konfużjoni fil-kejl tal-imġiba rabat l-effett mat-ton serotonerġiku, b’mod konsistenti mal-inibizzjoni magħrufa tal-monoamine oxidase miż-żebgħa. L-aktar osservazzjoni sinifikanti kienet li l-medju tal-embrijuni li kien fih il-blu tal-metilen ħeba r-rispons lokomotorju mistenni għall-SSRI fluoxetine. Għalhekk assaġġ ta’ skrining imwettaq f’ilma blu jista’ ma jidentifikax effett ta’ mediċina li ilma ċar jiżvela.

Ma hemm ebda kontradizzjoni reali. Kompost jista’ ma jħalli ebda effett residwu li jista’ jinstab jumejn wara t-tneħħija tiegħu f’assaġġ wieħed u xorta jkun attiv waqt li jkun preżenti f’ieħor. L-interpretazzjoni prattika hija li r-riżultat null jiġġustifika limitu massimu tal-konċentrazzjoni, mhux pretensjoni ta’ newtralità, filwaqt li r-riżultat pożittiv jiddeskrivi r-riskju li jgħodd: espożizzjoni attiva matul il-perjodu tal-kejl, proprju fil-konfigurazzjoni li jużaw il-biċċa l-kbira tal-laboratorji.

Żebgħa redox f’assaġġ redox

Nassa oħra jistħoqqilha paragrafu għaliha għax tfixkel l-istrument tal-kejl aktar milli l-annimal. L-assaġġ tan-nefqa tal-enerġija Alamar Blue innifsu huwa kimika redox: resazurin jitnaqqas għal resorufin fluworexxenti. Il-blu tal-metilen ukoll jinvolvi kimika redox. F’kontrolli mingħajr ċelloli, iż-żewġ konċentrazzjonijiet tat-trobbija naqqsu ftit iżda b’mod sinifikanti l-fluworexxenza ta’ Alamar Blue wara 24 siegħa. Fl-esperimenti fuq l-annimali, l-embrijuni esposti nħaslu mill-inqas tliet darbiet f’medju mingħajr żebgħa qabel l-assaġġ, u l-effett bijoloġiku fil-larvi mfaqqsa kien akbar mill-interferenza mingħajr ċelloli. Għalhekk iż-żewġ affarijiet huma veri: l-annimali maħsula jġorru effett metaboliku reali, u ż-żebgħa li ma titneħħiex bil-ħasil iżżid artefatt kimiku dirett miegħu. Il-kontrolli jridu jisseparaw it-tnejn, inkella ebda wieħed miż-żewġ numri ma jfisser xejn. Il-gwida ġenerali dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati tal-assaġġi bbażati fuq iż-żebgħat tapplika hawnhekk b’importanza partikolari.

Kronoloġija tal-istadji tal-iżvilupp

Il-materjal oriġinali għal dan l-artiklu. Il-konċentrazzjonijiet huma ż-żewġ valuri standard tat-trobbija, 0.00005% u 0.0001%, sakemm ma jkunx indikat mod ieħor.

Il-mudell li għandek tiftakar huwa żieda bikrija u tnaqqis aktar tard fil-parametri metaboliċi finali, b’effetti fuq l-imġiba preżenti waqt l-espożizzjoni u li ma setgħux jinstabu wara d-depurazzjoni fl-uniku assaġġ li ttestja dan.

Lista ta’ kontroll għat-tfassil tal-kontrolli

It-tieni materjal oriġinali. Użah meta protokolli tal-ħut żebra bil-blu tal-metilen jiltaqgħu ma’ esperiment.

1. Irrapporta ż-żebgħa bħala reaġent, mhux bħala ilma. Indika l-konċentrazzjoni kemm bħala perċentwal kif ukoll f’mikromolari, il-bidu u t-tmiem f’sigħat jew jiem wara l-fertilizzazzjoni, l-iskeda tat-tiġdid, u l-intervall tat-tneħħija qabel kull kejl.
2. Fassal il-kontrolli skont il-mistoqsija. Studju tas-sustanza kimika tat-test jeħtieġ kontrolli mingħajr żebgħa; studju tat-trobbija jeħtieġ gruppi mingħajr żebgħa mqabbla ma’ gruppi biż-żebgħa, bir-riżultat kontra l-fungi rreġistrat, billi ebda wieħed miż-żewġ studji ċċitati ma kejjel l-effikaċja kontra l-fungi.
3. Aħsel qabel l-assaġġi redox, imbagħad ivverifika. Laħlaħ mill-inqas tliet darbiet f’medju mingħajr żebgħa u wettaq ukoll kontroll mingħajr ċelloli biż-żebgħa u r-reaġent flimkien, għax iż-żebgħa tnaqqas direttament is-sinjal ta’ Alamar Blue.
4. Qis il-parametri finali tal-imġiba u tal-monoamini bħala ta’ riskju għoli. Studji dwar il-lokomozzjoni, ir-rispons għal stimolu għal għarrieda, imġiba simili għall-ansjetà, antidepressanti u inibituri tal-MAO għandhom jevitaw iż-żebgħa waqt il-kejl jew juru newtralità speċifika għall-parametru finali; perjodu ta’ tneħħija ta’ jum sa jumejn elimina effett wieħed fuq il-lokomozzjoni iżda mhuwiex ippruvat għal paradigmi oħra.
5. Qis il-parametri finali metaboliċi u mitokondrijali bħala ta’ riskju għoli f’kull stadju. Il-konsum tal-ossiġnu, in-nefqa tal-enerġija, il-potenzjal tal-membrana u t-traskritti tal-katina respiratorja jinbidlu fil-konċentrazzjonijiet tat-trobbija, f’direzzjonijiet opposti qabel u wara t-tfaqqis.
6. Tassumix li n-newtralità minn disinn wieħed tapplika għal ieħor. Riżultat null wara t-tneħħija ma jkoprix espożizzjoni li għadha għaddejja; riżultat morfoloġiku null ma jkoprix il-metaboliżmu jew l-interazzjoni ma’ mediċina; riżultat f’razza, temperatura jew tul ta’ assaġġ wieħed ma jkoprix oħrajn.
7. Indika l-linja gwida li segwejt u l-alternattiva tagħha. Semmi espliċitament il-konċentrazzjonijiet tas-CCAC, tal-gwida Ewropea jew ta’ Cold Spring Harbor, u indika fejn it-test tal-embrijuni tal-OECD iħalli barra ż-żebgħa, sabiex il-qarrej ikun jista’ jqiegħed l-annimali tiegħek fil-kuntest xieraq.

Xejn minn dan ma huwa argument kontra l-użu taż-żebgħa biex il-bajd jinżamm ħaj. Huwa argument kontra li għażla tat-trobbija tidħol fid-data mingħajr ma tiġi eżaminata. Il-blu fid-dixx huwa molekula bi proprjetajiet farmakoloġiċi, u l-esperimenti li l-aktar x’aktarx jiġu distorti huma proprju l-iskrining metaboliku u newrokomportamentali ta’ kapaċità għolja li għalih illum huwa ppreferut ħut żebra żgħir. Irreġistrah, ikkontrollah, neħħih qabel ma tkejjel, u ċċekkja l-assaġġ li fih jista’ jkun qed jipparteċipa mingħajr ma tinduna.