Metilena biru dan Bartonella: dapatan makmal dan batas bukti klinikal

Piring kultur dan pesakit berkongsi satu perkataan, jangkitan, tetapi bukan satu konsep. Dalam piring, jangkitan ialah bilangan koloni pada agar. Dalam pesakit, jangkitan melibatkan bakteria di dalam sel dan salur darah, ubat yang bergerak melalui darah dan tisu, serta sistem imun yang menjalankan sebahagian daripada tugasnya. Jika kedua-duanya dikelirukan, angka makmal yang mengagumkan mula kelihatan seperti suatu rawatan. Jika kedua-duanya dipisahkan, angka yang sama kekal sebagaimana hakikatnya: alasan untuk menjalankan eksperimen seterusnya.

Membezakan kedua-duanya ialah tujuan utama ulasan tentang metilena biru dan Bartonella ini. Dua kajian makmal daripada satu kumpulan penyelidikan menguji metilena biru terhadap Bartonella henselae dalam keadaan tidak membiak. Kedua-duanya melaporkan aktiviti yang kuat dalam bekas kaca dan plastik. Tiada satu pun mengujinya pada manusia.

Mengapa penyelidik menguji fasa pegun

Kebanyakan ujian antibiotik menggunakan sel yang sedang membiak. Model itu tidak merangkumi keadaan yang lebih sukar: sel yang telah berhenti membahagi dan mampu bertoleransi terhadap ubat yang membunuh sel sejenis yang sedang membiak.

Bartonella boleh kekal dalam badan, termasuk di dalam eritrosit dan sel endotelium. Oleh itu, kumpulan tersebut menyiasat ubat yang diluluskan yang boleh membunuh B. henselae selepas bakteria itu memasuki fasa pegun. MIC yang rendah terhadap sel yang sedang membiak tidak meramalkan pembunuhan sel fasa pegun. Rifampin mempunyai MIC yang sangat rendah tetapi kurang berkesan membunuh sel pegun, manakala sebatian dengan nilai MIC yang lebih tinggi membunuhnya dengan baik. Pembaca yang mahukan kaedah umum untuk menilai makalah seperti ini boleh merujuk panduan membaca penyelidikan metilena biru.

Saringan pertama: Li dan rakan-rakan, 2019

Saringan fasa pegun 2019 dalam Antibiotics menggunakan satu strain, B. henselae JK53, yang dibiakkan dalam medium Schneider dengan 10 peratus serum janin lembu pada 37 C dengan 5 peratus CO2. Kultur berusia satu hari kebanyakannya terdiri daripada sel yang tersebar dan sedang membahagi. Kultur berusia lima hari, pada sekitar 10 kuasa 8 unit pembentuk koloni per mL, dianggap berada dalam fasa pegun dan mengandungi agregat yang kelihatan.

Asai tersebut menggunakan SYBR Green I dengan propidium iodida, yang ditentukur menggunakan campuran sel hidup dan sel yang dibunuh dengan isopropanol. Oleh sebab metilena biru mempunyai warna yang pekat, sebatian yang menunjukkan aktiviti disahkan melalui mikroskopi dan kemudian melalui kiraan koloni pada agar darah, iaitu ukuran hasil yang lebih ketat.

Daripada 1,581 ubat yang diluluskan pada 50 mikromolar, metilena biru meninggalkan 16 peratus sel berdaya hidup menurut pembaca plat dan 25 peratus menurut mikroskopi. Daptomycin mencatatkan 21 peratus, beberapa azol mencatatkan 22 hingga 27 peratus, gentamicin 32 peratus, erythromycin 66 peratus, dan ciprofloxacin 74 peratus. Pyrvinium pamoate kelihatan lebih kuat berdasarkan pembaca plat tetapi tidak dapat dinilai melalui mikroskopi kerana pendarfluornya sendiri.

Terhadap B. henselae yang sedang membiak, MIC metilena biru ialah 0.08 hingga 0.16 mikrogram per mL. Terhadap sel pegun berusia lima hari pada 5 mikrogram per mL, kiraan koloni menurun sehingga tiada koloni yang dapat dikesan selepas satu hari pendedahan, menyamai daptomycin dan pyrvinium pamoate pada kepekatan yang diuji. Ujian pembunuhan mengikut masa yang berasingan menggunakan 10 mikrogram per mL. Itu ialah aras pendedahan makmal, bukan dos, dan makalah tersebut menyatakannya sedemikian. Nilai puncak plasma manusia sekitar 3.9 mikrogram per mL yang dipetik dalam makalah itu hanya diberikan sebagai konteks latar belakang. Gambaran keseluruhan farmakokinetik metilena biru menerangkan sebab nilai plasma tidak boleh ditafsirkan sebagai nilai tisu.

Dua batas dinyatakan dengan jelas dalam makalah tersebut. Tiada model biofilem dan tiada ujian gabungan metilena biru. Agregat berusia lima hari itu ialah kelompok dalam kultur cecair fasa pegun, bukan eksperimen biofilem yang telah disahkan. Penulis menyeru supaya kajian haiwan, kajian gabungan, kajian biofilem dan ujian pada spesies Bartonella yang lain dijalankan.

Gabungan dan sel yang berasal daripada biofilem: Zheng dan rakan-rakan, 2020

Kajian susulan 2020 dalam BMC Microbiology mengekalkan strain dan medium yang sama tetapi beralih kepada kultur pegun berusia enam hari serta menambah dua perkara yang tiada dalam makalah pertama: gabungan dua ubat dan model sel yang berasal daripada biofilem.

Bagi ubat tunggal pada kepekatan seragam 5 mikrogram per mL selama 24 jam, metilena biru meninggalkan 3.2 darab 10 kuasa 4 unit pembentuk koloni per mL berbanding kawalan yang hampir 2.8 darab 10 kuasa 10. Ciprofloxacin, gentamicin dan nitrofurantoin meninggalkan lebih sedikit koloni pada titik masa yang sama. Ini berbeza daripada keputusan 2019, apabila aras nominal yang sama menghasilkan tiada koloni yang dapat dikesan selepas satu hari. Usia kultur, ketumpatan dan pengendalian berbeza, maka kesan pembunuhan dapat dihasilkan semula dari segi arah perubahan tetapi tidak sama dari segi magnitud. Perubahan antara ulangan ujian ini ialah salah satu sebab semakan keselamatan dan interaksi standard membezakan potensi makmal daripada kesan klinikal.

Saringan gabungan ialah bahagian yang paling kerap dipetik. Setiap komponen ditetapkan pada 5 mikrogram per mL. Kedua-dua azithromycin bersama metilena biru dan rifampin bersama metilena biru menghasilkan tiada koloni fasa pegun yang dapat dikesan pada 24 jam, begitu juga kedua-dua pasangan ciprofloxacin. Hanya empat pasangan itu menunjukkan hasil tersebut daripada 25 pasangan yang diuji. Tiada analisis sinergi formal dijalankan, maka istilah yang betul ialah gabungan yang aktif dalam keadaan ini, bukan sinergi yang terbukti.

Eksperimen biofilem menguji sel yang diperoleh daripada biofilem muda yang telah dipecahkan, bukan penembusan ke dalam biofilem matang yang masih utuh. Kultur dibiakkan selama lima hari, dicairkan ke dalam plat telaga selama lima hari lagi, disahkan melalui pewarnaan kristal ungu, kemudian dikikis sebelum pendedahan kepada ubat. Pada 5 mikrogram per mL, metilena biru sahaja menurunkan kiraan kepada 2.3 darab 10 kuasa 2 menjelang hari 6, antara yang terbaik bagi agen tunggal, tetapi bukan sifar. Kedua-dua gabungan metilena biru mencapai sifar menjelang hari 6, begitu juga kedua-dua gabungan ciprofloxacin.

Penulis menekankan batas yang sama yang akan dikenal pasti oleh pembaca yang teliti: biofilem muda yang dikikis dan bukannya biofilem lama yang utuh, satu kepekatan yang mudah digunakan untuk semua ubat dan bukannya setiap ubat pada aras puncaknya yang realistik, hanya pasangan terpilih yang berpusat pada azithromycin atau rifampin, satu strain, tiada haiwan, dan tiada pesakit. Kajian tiga ubat pada masa hadapan dicadangkan, bukan dilaporkan.

Perbandingan reka bentuk kajian

Jadual ini merumuskan inti pati artikel ini. Semua yang berada di sebelah kiri lajur terakhir ialah kajian kultur. Tiada apa-apa dalam kedua-dua makalah itu yang mengisi lajur terakhir.

Bartonella bukan Borrelia

Kedua-dua makalah menyebut Borrelia burgdorferi, spiroket penyebab penyakit Lyme, kerana asai pewarna itu berasal daripada kajian terdahulu tentang fasa pegun Borrelia di makmal yang sama, apabila metilena biru dan daptomycin juga dikenal pasti sebagai sebatian yang aktif. Latar belakang ini memberikan konteks yang berguna dan juga menjadi punca kekeliruan yang lazim.

Tiada eksperimen dalam kedua-dua makalah Bartonella itu menguji Borrelia secara bersebelahan dengan Bartonella. Organisma berbeza, medium berbeza, kepekatan berbeza, dan kesan metilena biru terhadap membran Bartonella yang dihipotesiskan dinyatakan sebagai spekulasi yang memerlukan kajian lanjut. Keputusan tidak sepatutnya diterapkan merentas spesies, dan tiada satu pun makalah itu menyokong dakwaan umum tentang parasit. Perbandingan sel persister Borrelia dan Bartonella memisahkan kedua-dua bidang penulisan penyelidikan atas sebab ini.

Mengapa kultur tidak boleh dijadikan protokol

Minat carian terhadap protokol metilena biru untuk bartonella boleh difahami. Makalah-makalah ini menunjukkan sebab frasa tersebut patut dianggap sebagai tanda amaran dan bukannya senarai membeli-belah.

Pertama, 5 mikrogram per mL dalam telaga bukan preskripsi. Nilai itu tidak merangkumi penyerapan, pengagihan, pengikatan protein, penembusan ke dalam sel atau kebolehtoleransian. Penulis memilihnya sebagai purata kasar aras puncak antibiotik dan menyatakan bahawa kajian akan datang harus menggunakan setiap ubat pada arasnya sendiri yang realistik.

Kedua, sifar koloni bermaksud tiada koloni dalam keadaan pengkulturan pada plat tersebut, bukan tisu steril. Sel persister, bakteria di dalam sel dan batas pensampelan semuanya berada di luar skop plat agar.

Ketiga, gabungan yang mensterilkan telaga boleh gagal atau mendatangkan mudarat dalam badan. Azithromycin bersama metilena biru dan rifampin bersama metilena biru ialah pasangan makmal pada aras pendedahan makmal. Tanpa data farmakokinetik haiwan dan data manusia yang terkawal, tiada dos, tiada tempoh, dan tiada nisbah manfaat kepada risiko yang dapat ditentukan. Sesiapa yang sedang mempertimbangkan pilihan patut membincangkannya dengan pengamal klinikal dan menyemak keadaan penggunaan metilena biru yang memerlukan pengawasan perubatan sebelum membuat apa-apa kesimpulan daripada data piring kultur.

Kesimpulan terhad yang disokong oleh makalah-makalah ini ialah: metilena biru mempunyai aktiviti yang boleh dihasilkan semula terhadap B. henselae JK53 yang tidak membiak secara in vitro, termasuk dalam gabungan dua ubat di makmal, dengan keputusan gabungan dan sel yang berasal daripada biofilem yang paling kuat datang daripada kajian 2020. Segala yang lain, termasuk sama ada aktiviti itu bermakna bagi bartonelosis manusia, masih belum diuji.