लेख
मायक्रोस्कोपीसाठी methylene blue चे पर्याय: कार्यानुसार निवडा
साध्या bacterial smear मध्ये पेशींचा आकार पाहणे हा उद्देश असल्यास methylene blue ऐवजी crystal violet वापरता येतो. जिवंत पेशींसाठी कोणताही रंग न वापरता phase contrast हा अधिक योग्य पर्याय असू शकतो. कोणते निरीक्षण करायचे आहे यावर निवड अवलंबून असते.
समजा दोन लोक एकाच bacterial culture चे परीक्षण करत आहेत. एकाला दंडगोलाकार पेशी आणि गोल पेशी यांतील फरक ओळखायचा आहे. दुसऱ्याला एखाद्या treatment मुळे bacteria मृत झाले आहेत का हे जाणून घ्यायचे आहे. पहिल्या व्यक्तीला स्पष्ट प्रतिमा देणारा stain दुसऱ्या व्यक्तीला उपयोगी उत्तर देईलच असे नाही.
पर्याय निवडण्यापूर्वी हे वाक्य पूर्ण करा: “मला ___ मध्ये ___ चे निरीक्षण करायचे आहे, आणि पेशी जिवंत राहणे आवश्यक आहे / आवश्यक नाही.” हे वाक्य stain ने नेमके कोणते कार्य करायचे आहे ते निश्चित करते.
नमुना आणि प्रश्नापासून सुरुवात करा
प्रथम पेशी जिवंत राहणे आवश्यक आहे की नाही ते ठरवा, त्यानंतर कोणते वैशिष्ट्य पाहायचे आहे ते ओळखा:
- पेशी जिवंत राहणे आवश्यक आहे: हालचाल किंवा आकारासाठी रंग न लावलेला phase contrast किंवा DIC विचारात घ्या; nuclear DNA साठी fluorescence सह Hoechst 33342 विचारात घ्या; membrane integrity साठी SYTO 9 आणि propidium iodide यांसारखी validated assay निवडा.
- पेशी जिवंत राहणे आवश्यक नाही: bacterial morphology साठी crystal-violet simple stain किंवा nigrosin negative stain विचारात घ्या; Gram reaction साठी संपूर्ण Gram-stain method वापरा; fixed cells मधील nuclear DNA साठी DAPI fluorescence विचारात घ्या. प्रत्येक पर्यायाच्या मर्यादा तुलना करण्यासाठी हा तक्ता वापरा. या पद्धतींच्या निवडी आहेत; विद्यमान protocol मध्ये एका बाटलीऐवजी दुसरी बाटली वापरण्याच्या सूचना नाहीत.
| तुम्हाला काय पाहायचे आहे | नमुना आणि उपकरणे | संभाव्य पर्याय | मुख्य मर्यादा |
|---|---|---|---|
| Bacterial आकार आणि मांडणी | तयार केलेला bacterial smear; brightfield | Crystal violet simple stain | Morphology दाखवतो; Gram reaction किंवा viability सिद्ध करत नाही. |
| गडद पार्श्वभूमीवर पेशींच्या बाह्यरेषा | Bacteriological preparation; brightfield | Nigrosin negative stain | Preparation आणि formulation महत्त्वाचे असतात; रंग न लागलेली पेशी जिवंत असेलच असे नाही. |
| Gram reaction | तयार केलेला bacterial smear; brightfield | संपूर्ण Gram-stain method | संपूर्ण reagent sequence आणि controls आवश्यक असतात. |
| जिवंत पेशींतील हालचाल किंवा बदल | सुसंगत wet preparation; phase contrast किंवा DIC | रंग नाही | योग्य optics आवश्यक असतात; contrast एखादा molecule ओळखत नाही. |
| Nuclear DNA | Fixed cells; fluorescence | DAPI | सुसंगत excitation आणि emission filters आवश्यक असतात. |
| जिवंत पेशींतील nuclear DNA | Live cells; fluorescence | Hoechst 33342 | पेशींमध्ये प्रवेश होतो यावरून imaging conditions निरुपद्रवी आहेत असे सिद्ध होत नाही. |
| Bacterial membrane integrity | Unfixed bacteria; fluorescence | SYTO 9 with propidium iodide | Membrane staining हे viability चे अप्रत्यक्ष मापन आहे. |
साध्या smear साठी पद्धत काळजीपूर्वक बदला
कार्य bacterial morphology चे एकाच रंगातील दृश्य मिळवणे असेल तर crystal violet हा व्यावहारिक पर्याय आहे. FDA च्या Bacteriological Analytical Manual मध्ये simple staining साठी योग्य अशा crystal-violet च्या दोन formulations दिल्या आहेत. दस्तऐवजीकरण केलेले formulation आणि त्याची preparation method वापरा; केवळ dye चे नाव working reagent निश्चित करत नाही.
Crystal violet चा Gram staining मध्येही वापर होतो, पण त्यामुळे crystal-violet simple stain हा Gram stain होत नाही. ASM Gram-stain protocol मध्ये differential result हा crystal violet, iodine, decolorization आणि counterstaining यांच्या क्रमवार क्रियेवर अवलंबून असतो. हे टप्पे वगळल्यास प्रतिमेतून काय सिद्ध करता येते ते बदलते. हा फरक समजण्यासाठी simple staining आणि Gram staining यांची तुलना पहा.
Nigrosin बाह्यरेषा स्पष्ट करण्याची वेगळी पद्धत देते: ते पार्श्वभूमी गडद करते, तर bacterial cells तुलनेने फिकट राहतात. Merck च्या nigrosin instructions मध्ये असा एक महत्त्वाचा तपशील आहे जो पर्यायांच्या सर्वसाधारण यादीत दुर्लक्षित होऊ शकतो. त्याच्या निर्दिष्ट working formulation मध्ये formaldehyde समाविष्ट आहे. त्यामुळे पेशी स्वतः रंग न लागल्यासारख्या दिसत असल्या तरी “negative stain” या शब्दांवरून live-cell compatibility गृहित धरता येत नाही. संपूर्ण formulation आणि specimen preparation तपासा.
जिवंत नमुन्यांसाठी optics बदलण्याचा विचार करा
पेशींची हालचाल किंवा विभाजन पाहायचे असल्यास आणखी एक dye वापरल्याने निरीक्षण अधिक गुंतागुंतीचे होऊ शकते. Nikon ने पारदर्शक नमुन्यांतील contrast या मार्गदर्शकात स्पष्ट केल्याप्रमाणे, phase contrast आणि differential interference contrast, म्हणजे DIC, नमुन्यांच्या optical properties मधील फरक वापरून त्यांना दृश्यमान करतात. Microscope मध्ये आवश्यक घटक असल्यास या पद्धती जिवंत, रंग न लावलेल्या पेशी दाखवू शकतात.
या निवडीमुळे preparation वर रंग लावावा लागत नाही, पण उपलब्ध माहितीचे स्वरूप बदलते. Contrast कोणत्या molecule मुळे निर्माण झाला हे न समजता boundary किंवा movement पाहता येते. प्रश्न molecular localization चा असेल तर त्याऐवजी योग्य labeling method निवडा.
Nuclear DNA साठी Invitrogen ची DAPI आणि Hoechst stains ची तुलना DAPI चा fixed cells मध्ये सामान्य वापर आणि अधिक cell-permeant असलेल्या Hoechst 33342 मधील फरक स्पष्ट करते; live-cell labeling साठी Hoechst 33342 ला प्राधान्य दिले जाते. दोन्हींसाठी fluorescence equipment आवश्यक असते. यापैकी कोणताही रंगीत brightfield stain चा थेट पर्याय नाही.
Dye exposure आणि illumination यांना experimental conditions म्हणून हाताळा. पेशींचे वर्तन हे तुमचे measurement असेल तर रंग लावलेल्या आणि रंग न लावलेल्या preparations ची तुलना करा.
लाल पेशी म्हणजे आपोआप मृत पेशी नाही
Bacterial membrane integrity चे मूल्यमापन करण्यासाठी SYTO 9 आणि propidium iodide यांचा अनेकदा एकत्र वापर केला जातो. BacLight manual मध्ये intact membranes चा संबंध हिरव्या staining शी आणि damaged membranes चा संबंध लाल staining शी जोडला आहे. नमुन्यासाठी या interpretation ची validation आवश्यक असते.
Rosenberg आणि सहकाऱ्यांचा 2019 चा अभ्यास ही समस्या स्पष्ट करतो. Phosphate-buffered saline मधील काचेवर वाढवलेल्या 24-hour E. coli biofilms मध्ये सुमारे 96% पेशी in situ propidium-iodide-positive दिसल्या. तरी harvesting नंतर लेखकांनी त्यापैकी 82% cultivable असल्याचा अंदाज लावला. Confocal images मध्ये लाल रंगलेल्या material खाली हिरवे interiors असलेल्या पेशी दिसल्या, ज्यामुळे दिशाभूल करणाऱ्या signal मध्ये extracellular nucleic acids चा सहभाग असल्याचे सूचित झाले.
ही टक्केवारी अभ्यासातील preparations वर केलेल्या वेगवेगळ्या measurements चे वर्णन करते; ती सार्वत्रिक correction factor नाही. उपयुक्त निष्कर्ष म्हणजे signal कशामुळे निर्माण झाला ते तपासणे. Biofilm मध्ये nucleic-acid dye damaged cells च्या आतील material बरोबरच पेशींबाहेरील material देखील शोधू शकतो. Viability बद्दल निष्कर्ष काढण्यासाठी संशोधक cultivation किंवा metabolic activity यांसारखी complementary measurements वापरण्याची शिफारस करतात, तसेच प्रत्येक पद्धतीच्या मर्यादा मान्य करतात.
पर्यायात प्रत्यक्षात काय आहे ते तपासा
पर्यायी staining method मध्येही methylene blue असू शकतो. Giemsa हे त्याचे उदाहरण आहे: Merck त्याच्या उत्पादनाचे वर्णन azure-eosin-methylene-blue solution असे करते, ज्याचा वापर blood आणि bone-marrow smears सहित विविध applications साठी केला जातो. वेगळ्या specimen साठी ती वेगळी method असू शकते, पण methylene blue वगळण्याची अट ती पूर्ण करत नाही.
एखादे compound वगळणे हा experiment चा भाग असल्यास प्रतिमांची तुलना करण्यापूर्वी reagent identity आणि formulation तपासा. methyl blue, methylene blue आणि समान नावांच्या dyes यावरील मार्गदर्शक नावांतील फरक स्पष्ट करतो.
परिणाम वापरण्यापूर्वी substitution पडताळा
नवीन method साठी representative specimens आणि योग्य control वापरून लहान तुलना करा. शक्य असल्यास microscope settings तुलनात्मक ठेवा. Reagent formulation, specimen preparation, exposure आणि imaging conditions नोंदवा, जेणेकरून अधिक चांगली दिसणारी प्रतिमा केवळ पसंत करण्याऐवजी तिची तपासणी करता येईल.
यशाचे मूल्यांकन मूळ प्रश्नाच्या संदर्भात करा. Morphology साठी cell boundaries आणि arrangement समजण्याजोगे राहतात का ते तपासा. Nuclear labeling साठी signal location आणि background तपासा. Viability साठी आकर्षक color separation पलीकडील पुरावे आवश्यक ठेवा. methylene blue staining आणि laboratory applications यावरील व्यापक मार्गदर्शक निरीक्षण आणि preparation यांचा परस्पर संबंध स्पष्ट करतो.
तुम्हाला आवश्यक असलेले measurement जतन करणारा पर्याय निवडा. परिणामी प्रतिमेचा रंग हा फक्त एक गुणधर्म आहे.