सांद्रतेनुसार मेथिलीन ब्लूचे शोषण का बदलते

मेथिलीन ब्लूच्या मूळ साठवणीच्या द्रावणाची एक बाटली घ्या आणि दोन ग्लास भरा. पहिला ग्लास मूळ द्रावणाने आणि दुसरा त्याच्या दहापट विरल केलेल्या द्रावणाने भरा. अपेक्षेप्रमाणे दुसऱ्या ग्लासातील रंग फिकट दिसतो. नीट पाहिल्यावर आणखी एक बदल दिसतो. रंगाची छटा बदललेली असते. एक द्रावण स्वच्छ आकाशी निळ्या रंगाकडे झुकते, तर दुसरे जांभळट निळ्या रंगाकडे. विरलीकरणाने केवळ रंगाची तीव्रता कमी झालेली नसते. सर्वाधिक शोषण करणारा रासायनिक प्रकारही बदललेला असतो.

या बदलामागील संकल्पना सोपी आहे. विरघळलेले मेथिलीन ब्लू केवळ एकाच रासायनिक प्रकारात नसते. रंगद्रव्याचा एकटा धनायन, ज्याला मोनोमर म्हणतात, दुसऱ्या धनायनासोबत सपाट पृष्ठभाग एकमेकांसमोर ठेवून रचला जाऊ शकतो आणि डायमर तयार करू शकतो. डायमरपासून आणखी मोठे समुच्चय तयार होऊ शकतात. प्रत्येक रूपाचा स्वतःचा शोषण वर्णपट असतो. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर दाखवत असलेला परिणाम म्हणजे त्या क्युवेटमध्ये, त्या परिस्थितीत उपस्थित असलेल्या मिश्रणातील सर्व प्रकारांच्या शोषणाची बेरीज असते. मिश्रण बदलले की वर्णपट बदलतो, जरी रंगद्रव्याचे एकूण प्रमाण सरळ विरलीकरण गुणोत्तरानुसार बदलत असले तरीही.

मोनोमर आणि डायमर वेगवेगळ्या प्रकारे शोषण करतात

मोनोमरची कल्पना एका सपाट पत्त्यासारखी करा, ज्याच्या वलय प्रणालीवर धनभार पसरलेला आहे. असे दोन पत्ते आपापले सपाट पृष्ठभाग एकमेकांसमोर ठेवून रचले जाऊ शकतात. धनभारांमध्ये प्रतिकर्षण होते, पण सपाट अरोमॅटिक पृष्ठभाग स्तरीय रचनेतील आंतरक्रियांमुळे एकमेकांना आकर्षित करतात. सभोवतालचे पाणी आणि प्रतिआयन प्रतिकर्षणाचा प्रभाव कमी करतात. परिणामी सामायिक इलेक्ट्रॉनिक अवस्था असलेली एक बद्ध जोडी तयार होते. तिच्या अनुमत संक्रमणांची ऊर्जा मोनोमरच्या संक्रमणापेक्षा जास्त असते. त्यामुळे डायमरचा पट्टा मोनोमरच्या पट्ट्यापेक्षा कमी तरंगलांबीवर दिसतो, आणि मोठे समुच्चय निळ्या बाजूकडे आणखी पुढे खांद्यासारख्या उभाराच्या रूपात योगदान देतात.

स्वच्छ पाण्यात अतिशय कमी सांद्रतेला मोनोमरचे प्राबल्य असते आणि अधिक तरंगलांबीचा पट्टा प्रमुख असतो. एकूण सांद्रता वाढत गेल्यावर जोडीरूपाचा वाटा वाढतो आणि पहिल्या पट्ट्याच्या तुलनेत कमी तरंगलांबीचा पट्टा अधिक मोठा होतो. त्यामुळे या दोन पट्ट्यांचे गुणोत्तर मिश्रणाची रचना दर्शवते, थेट एकूण सांद्रता नाही. कोणते रूप उपस्थित आहे याबद्दल गृहीतक केल्याशिवाय एकाच तरंगलांबीवरील मापन या दोघांना वेगळे ओळखू शकत नाही.

म्हणूनच संदर्भ वर्णपटासोबत परिस्थितीची माहिती नेहमी असली पाहिजे. मेथिलीन ब्लूचा वर्णपट संदर्भ पट्ट्यांची स्थाने तक्त्यात देतो आणि त्यांच्यासोबत ते मिळवण्यासाठी वापरलेला विद्रावक, पार्श्वभूमीतील मीठ, pH, तापमान आणि सांद्रतेची श्रेणीही नोंदवतो. ही परिस्थिती न सांगता शिखराचे मूल्य दिल्यास त्या संख्येचा संदर्भ अपुरा राहतो. एकाच रंगद्रव्यापासून मिळालेल्या वेगवेगळ्या वर्णपटांबाबत दोन प्रयोगशाळा योग्य असू शकतात, कारण त्यांनी वेगवेगळी मिश्रणे मोजलेली असतात.

समतोल कशामुळे बदलतो

सांद्रता हा मुख्य नियंत्रक घटक आहे. डायमर तयार होण्यासाठी दोन मोनोमर एकत्र यावे लागतात, त्यामुळे एकूण रंगद्रव्य वाढल्यावर त्याचा वाटा रेषीय वाढीपेक्षा वेगाने वाढतो. खोलीच्या तापमानाजवळ नोंदवलेली जलीय डायमरीकरण स्थिरांकांची मूल्ये हजारो per molar इतकी असतात. त्यामुळे micromolar श्रेणीत डायमरचा वाटा झपाट्याने वाढतो. रंगद्रव्याच्या micromolar ते millimolar सांद्रतेपर्यंतच्या विस्तृत डेटाला एकत्र बसवलेल्या मॉडेलमध्ये 34 micromolar पेक्षाही कमी सांद्रतेला टेट्रामरचे योगदान शून्याहून अधिक आढळले. त्यामुळे काही दहा micromolar सांद्रतेला फक्त दोनच रासायनिक प्रकार गृहीत धरणाऱ्या मॉडेलवर विश्वास ठेवताना सावध राहावे लागते. अचूक प्रमाणे माध्यमावर अवलंबून असतात. म्हणूनच हा लेख सर्व परिस्थितींना लागू होणाऱ्या रूपांतरण तक्त्याऐवजी बदलाची दिशा सांगतो.

मीठ हा दुसरा नियंत्रक घटक आहे. विरघळलेले आयन दोन धनायनांमधील प्रतिकर्षणाचा प्रभाव कमी करतात. त्यामुळे सोडियम क्लोराइड आणि तत्सम इलेक्ट्रोलाइट घातल्यावर, रंगद्रव्याची सांद्रता तीच असतानाही मिश्रण डायमर आणि समुच्चयांकडे झुकते. हा परिणाम क्षारयुक्त आणि जलीय माध्यमांतील मेथिलीन ब्लूच्या एकत्रीकरणावरील अभ्यासांमध्ये दिसतो. त्यात सुमारे 1 micromolar ते 3.4 millimolar रंगद्रव्याचे मापन 0 ते 0.15 molar सोडियम क्लोराइडच्या श्रेणीत केले होते. त्या मॉडेलमध्ये रंगद्रव्य आणि मीठ दोन्ही अधिक असलेल्या टोकाला टेट्रामरचा वाटा सुमारे 0.93 पर्यंत पोहोचला. त्यामुळे पाण्यात नोंदवलेला वर्णपट आणि शारीरिक क्षारद्रावणात नोंदवलेला वर्णपट हे एकमेकांच्या जागी वापरता येणारे मानक नाहीत.

तापमान उलट दिशेने परिणाम करते. स्तरीय रचनेमुळे बद्ध पाणी मुक्त होते, आणि उष्णतेमुळे होणारी हालचाल या रचनेला विरोध करते. त्यामुळे द्रावण गरम केल्यावर सामान्यतः काही डायमर पुन्हा मोनोमरमध्ये विघटित होतात, तर थंड केल्यावर संयोगाला चालना मिळते. मॉडेलमधून मिळालेली विघटन एन्थाल्पी ऋण आहे, 282 ते 333 kelvin या श्रेणीत सुमारे उणे 30 kilojoules per mole. यावरून संयोग उष्मोत्सर्गी असल्याची पुष्टी होते. प्रशीतनातून काढल्यानंतर लगेच मोजलेला थंड नमुना, खोलीच्या तापमानाशी समतोल साधल्यानंतर मोजलेल्या त्याच नमुन्यापेक्षा अधिक एकत्रित दिसू शकतो.

विद्रावक मूलभूत परिस्थिती ठरवतो. पाण्याचा प्रबळ जलविरोधी परिणाम सपाट रंगद्रव्य धनायनांना एकमेकांवर रचले जाण्यास प्रोत्साहन देतो. इथेनॉल आणि मेथेनॉल यांसारखी अल्कोहोल वलयांचे अधिक चांगले विद्रावकीकरण करतात आणि समुच्चय तोडतात. त्यामुळे रंगद्रव्याची सांद्रता तीच असली तरी पाण्यापेक्षा इथेनॉलमध्ये अधिक मोनोमर असल्यासारखे दिसते. अप्रोटिक सहविद्रावकही असेच करतात: 293 kelvin तापमानावरील पाणी आणि DMSO यांच्या मिश्रणात DMSO वाढवल्यावर डायमरीकरण कमी झाले. यावरून पाण्याची संरचना स्तरीय रचनेला चालना देणारा घटक असल्याचे सूचित होते. पृष्ठसक्रिय पदार्थांबाबत दोन्ही दिशांनी काळजी घ्यावी लागते. त्यांच्या निर्णायक मिसेल सांद्रतेपेक्षा अधिक सांद्रतेला मिसेल स्वतंत्र मोनोमर विरघळवू शकतात आणि मोनोमरसारखा वर्णपट पुन्हा मिळवू शकतात. त्या बिंदूच्या खाली मात्र विरुद्ध विद्युतभार असलेला पृष्ठसक्रिय पदार्थ स्तरीय रचनेला चालना देऊ शकतो: 100 micromolar रंगद्रव्य असताना SDS मुळे होणारे बहुवारिकीकरण सुमारे 4 millimolar SDS जवळ सर्वाधिक झाले. हे मिसेल तयार होण्याच्या सांद्रतेच्या साधारण निम्मे होते. त्यानंतर पृष्ठसक्रिय पदार्थाच्या अधिक प्रमाणाला पुनर्वितरण झाले. मेथिलीन ब्लूच्या वर्णपटांवर रंगद्रव्य-विद्रावक आणि संघटित माध्यमांच्या परिणामांवरील संशोधन दाखवते की निरीक्षित पट्टे केवळ एकूण सांद्रतेवर नाही, तर रेणूच्या अगदी जवळच्या परिसरावर किती ठामपणे अवलंबून असतात.

pH चा प्रभाव मुख्यतः टोकाच्या मूल्यांवर महत्त्वाचा ठरतो. बहुतांश प्रयोगशाळांतील कामात वापरल्या जाणाऱ्या उदासीनतेजवळच्या श्रेणीत मेथिलीन ब्लू त्याच्या परिचित धनायनिक निळ्या रूपात राहते, आणि वर्णपटातील बदलांमध्ये एकत्रीकरणाचा प्रभाव प्रमुख असतो. प्रबळ आम्ल किंवा क्षार, रंगहीन ल्युको रूप निर्माण करणारी रेडॉक्स रसायनक्रिया, किंवा प्रथिने आणि कणांशी बंधन, यांपैकी प्रत्येकामुळे मोनोमर-डायमर जोडीपलीकडील अवस्था निर्माण होतात. बफर घातल्यानंतर वर्णपट बदलल्यास, सर्व बदल केवळ pH मुळे झाले असे मानण्याआधी बफरमधील मीठ आणि बंधन करणारे घटक तपासा. रसायनशास्त्र आणि प्रोटोनीकरणाचा संदर्भ रासायनिक रूपाच्या ओळखीचे हे प्रश्न, येथे चर्चिलेल्या एकत्रीकरणाच्या प्रश्नापासून वेगळे ठेवतो.

Beer-Lambert ची सरळ रेषा का वाकते

Beer-Lambert संबंधानुसार प्रकाशशोषणांक हा शोषणक्षमता, सांद्रता आणि प्रकाशमार्गाची लांबी यांच्या गुणाकाराइतका असतो. हा गणनेचा नियम आहे. त्यात असे गृहीत धरले जाते की मोजल्या जाणाऱ्या घटकांची संख्या बदलली तरी त्यांचे स्वरूप तेच राहते: एकच शोषक रासायनिक प्रकार, स्थिर वर्णपट, सांद्रतेनुसार रसायनक्रियेत बदल नाही, तपासणीसाठी एकवर्णी प्रकाश, प्रकीर्णन किंवा पुनरुत्सर्जन नाही, आणि प्रकाश प्रत्यक्षात सांगितलेल्या मार्गातूनच जातो.

एकत्रीकरण पहिले गृहीतक मोडते. गणिती स्वरूपात एकूण प्रकाशशोषणांक तरीही सर्व रासायनिक प्रकारांच्या योगदानांची बेरीज राहतो: प्रकाशमार्गाची लांबी गुणिले प्रत्येक प्रकाराची शोषणक्षमता गुणिले त्या प्रकाराची स्वतःची सांद्रता. प्रत्येक प्रकार नियम पाळतो. मिश्रण मात्र पाळत नाही, कारण त्या प्रकारांच्या सांद्रता या एकूण रंगद्रव्याच्या अरेषीय फलने असतात. त्यामुळे एकूण रंगद्रव्याच्या तुलनेत मोनोमर पट्ट्यावरील प्रकाशशोषणांकाचा अंशांकन वक्र विरल मर्यादेत सरळ सुरू होतो आणि सांद्रता वाढल्यावर खाली वाकतो. कारण प्रत्येक वाढीव मात्रेसोबत प्रमाणानुसार कमी मोनोमर वाढतात. डायमर पट्ट्यावर मोजलेला वक्र उलट दिशेने वाकतो. एकत्रीकरणावरील संशोधन निरीक्षित Lambert-Beer विचलनांचे कारण म्हणून नेमकी हीच यंत्रणा अधोरेखित करते. वाकलेल्या भागातून सरळ रेषा बसवणे आणि तिचे बहिर्वेशन करणे ही नेहमीची चूक आहे. ती रेषा ज्या श्रेणीत आणि नमुना-माध्यमात तयार केली आहे, फक्त त्यातच वैध असते.

विरलीकरणामुळे याच्याशी संबंधित आणखी एक सापळा निर्माण होतो. उपकरणाच्या मापन श्रेणीत आणण्यासाठी सांद्र मूळ द्रावण विरल केल्याने रासायनिक प्रकारांचे गुणोत्तर कायम राहत नाही. विरल केलेल्या क्युवेटमधील द्रावणाचा समतोल पुन्हा मोनोमरकडे सरकतो. त्यामुळे त्याचा वर्णपट विरल नमुन्याचे योग्य वर्णन करतो, पण मूळ द्रावणाचे चुकीचे वर्णन करतो. प्रकाशशोषणांक योग्य प्रमाणात वाढवून मूळ द्रावणाचा वर्णपट उलट गणनेने काढल्यास, अंशांकनात या बदलाचा आधीच विचार केलेला असेल तरच एकूण प्रमाणाचा अंदाज परत मिळतो. मूळ पट्ट्याचा आकार मात्र कधीच परत मिळत नाही. सांद्र द्रावणाच्या वर्णपटाची विरल संदर्भाशी तुलना करणारी व्यक्ती प्रत्यक्षात दोन वेगवेगळ्या मिश्रणांची तुलना करत असते.

प्रकाशमार्गाची लांबी हा निकालाचा भाग आहे

प्रकाशशोषणांक नमुन्यातून प्रकाशाने प्रवास केलेल्या अंतरानुसार बदलतो. त्याच द्रावणासाठी 10 mm क्युवेटमध्ये मिळणारा प्रकाशशोषणांक 1 mm क्युवेटमधील प्रकाशशोषणांकाच्या दहापट असतो. हे प्रमाण फक्त द्रावण तेच असेल तरच अचूक असते, आणि एकत्रीकरणामुळे ही अट अत्यंत महत्त्वाची ठरते.

प्रत्यक्ष कामात वैध मापन श्रेणीत राहण्यासाठी प्रकाशमार्गाची लांबी हे एक साधन असते. लांब मार्गामुळे विरल आणि मुख्यतः मोनोमर असलेल्या द्रावणांसाठी संवेदनशीलता मिळते. लहान मार्गामुळे समतोल पुन्हा बदलून टाकणारे मोठे विरलीकरण न करता सांद्र नमुना मापन श्रेणीत ठेवता येतो. वर दिलेल्या संख्यांमागील एकत्रीकरणाच्या अभ्यासात नेमके हेच केले होते: 1.1 ते 34 micromolar रंगद्रव्यासाठी 1 centimeter मापन कोशिका, आणि 94 micromolar ते 3.4 millimolar साठी 0.01 centimeter मापन कोशिका. सूक्ष्म-आयतन मापनासाठीचे पेडेस्टल आणि प्लेट रीडर यांची स्वतःची भूमिती असते. त्यांचे प्रकाशमार्ग लहान आणि कधीकधी बदलणारे असतात; शिवाय त्यांच्या पृष्ठभागांवर धनायनिक रंगद्रव्य अधिशोषित होऊ शकते. वर्णपट संदर्भात विद्रावक आणि मीठ नोंदवले जाते, त्याचप्रमाणे संख्येसोबत प्रकाशमार्गाची लांबीही नोंदवा. प्रकाशमार्गाची लांबी नसलेला प्रकाशशोषणांक हा निकाल नाही. ती एक अफवा आहे.

या यंत्रणेतून मापनाची शिस्त ठरते. मापनापूर्वी सर्व नमुने एकाच तापमानाशी समतोलात आणा. क्युवेटचा प्रकार आणि तिची दिशा एकसारखी ठेवा, त्याच मीठ आणि बफरची पार्श्वभूमी असलेले अनुरूप ब्लँक वापरा, आणि काचेची भांडी स्वच्छ ठेवा. कारण मेथिलीन ब्लू काच आणि प्लास्टिकवर अधिशोषित होते, आणि डाग पडलेली क्युवेट आधीच्या सांद्र नमुन्याची आठवण बाळगते. एकत्रीकरणाची गतिकी महत्त्वाची असेल तेव्हा नमुना तयार केल्यानंतर लगेच मापन करा. प्रत्येक अंशांकन वक्र अज्ञात नमुन्यांच्या त्याच माध्यमात आणि त्याच प्रकाशमार्गाच्या लांबीवर तयार करा. दृश्य तपासणी करताना डोळा हा अचूक वर्णपटमापक नाही, हे लक्षात ठेवा. द्रावणाच्या रंगावरून शुद्धता निश्चित करता येते का हा वेगळा प्रश्न आहे, आणि त्याचे उत्तर नकारार्थी आहे. एकत्रीकरणामुळे होणारे छटेतील बदल हे त्यामागचे एक कारण आहे.

उपकरणाजवळ ठेवण्यासाठी एक आकृती

खालील आकृती हा लेख प्रयोगशाळेच्या टेबलावर ठेवण्याजोग्या एका संदर्भात संक्षिप्त करते. तीन द्रावणांत रंगद्रव्य तेच आहे, पण एकूण सांद्रता आणि मीठाची पार्श्वभूमी वेगळी आहे. त्यांच्या संकल्पनात्मक वर्णपटांत स्तरीय रचना वाढत गेल्यावर अधिक तरंगलांबीच्या मोनोमर पट्ट्याचा वाटा कमी तरंगलांबीच्या डायमर पट्ट्याकडे जाताना दिसतो. आकृतीवर परिस्थिती छापलेली आहे, कारण तिच्याशिवाय हे वक्र पुन्हा वापरता येत नाहीत. दिलेल्या परिस्थितीत मोजलेल्या पट्ट्यांच्या स्थानांसाठी वर्णपट संदर्भ वापरा. रंगद्रव्य द्रावणात आल्यानंतर पेशींमध्ये कसे प्रवेश करते यासाठी अपचयन आणि विभाजनाद्वारे पेशींमध्ये प्रवेश पहा. प्रकाशाची मात्रा आणि भूमिती प्रकाशरासायनिक मापन परिणामांवर आणखी कसा प्रभाव पाडतात यासाठी प्रकाश संपर्क आणि मापनाची भूमिती पहा.

लक्षात ठेवण्याच्या नियमाचे दोन भाग आहेत. दिलेल्या परिस्थितीत क्युवेटमध्ये उपस्थित असलेले मिश्रण वर्णपट ओळखतो. केवळ त्याच परिस्थितीत तयार केलेले अंशांकनच प्रकाशशोषणांकाचे एकूण सांद्रतेत रूपांतर करते.