लेख
मिथिलीन ब्लू आणि पेशीय जरावस्था: फायब्रोब्लास्ट प्रयोग काय मोजतात
एक सर्वसामान्य चुकीचा अर्थ असा लावला जातो. एखाद्या संशोधनपत्रात मिथिलीन ब्लूमुळे संवर्धित फायब्रोब्लास्ट पेशीसमूह दुप्पट होण्याचे 20 पेक्षा अधिक अतिरिक्त टप्पे मिळाल्याचे नोंदवले जाते. त्यावरून वाचक असा निष्कर्ष काढतो की ते जरावस्थेतील पेशी काढून टाकते किंवा माणसाचे आयुष्य त्याच प्रमाणात वाढवते. हा निष्कर्ष स्वाभाविक वाटतो. पण तो दोन वेगवेगळ्या ठिकाणी चुकीचा आहे.
मूळ समस्या आकड्यांची नसून संकल्पनेची आहे. पेशीसमूह दुप्पट होण्याचे टप्पे, जरावस्थेचे निर्देशक आणि टेलोमिअरची मापने हे प्रत्येक वेगळ्या प्रश्नाचे उत्तर देतात. मिथिलीन ब्लूवरील फायब्रोब्लास्ट संशोधनाचा योग्य अर्थ असा आहे: संवर्धन पात्रातील एका पेशीप्रकारात जरावस्थेत प्रवेश उशिरा होण्याचा अभ्यास, ज्याला मायटोकॉन्ड्रियाच्या मापनांचा आधार आहे. हे आधीच जरावस्थेत गेलेल्या पेशी निवडकपणे काढून टाकण्यापेक्षा वेगळे आहे, आणि संपूर्ण जीवाच्या वृद्धत्वापेक्षाही वेगळे आहे. या फरकाचा व्यापक संदर्भ मायटोकॉन्ड्रियातील इलेक्ट्रॉन वहन पेशींच्या ऊर्जेला कसे आकार देते आणि मिथिलीन ब्लूवरील संशोधनातील दाव्यांचा अर्थ कसा लावावा, यामध्ये येतो.
पेशीसमूह दुप्पट होण्याचे टप्पे मागील विभाजनांची गणना करतात, तारुण्याची नव्हे
बहुतेक महत्त्वाचे निष्कर्ष IMR90 पेशींमधून आले आहेत. या सामान्य मानवी गर्भाच्या फुफ्फुसातील फायब्रोब्लास्ट पेशींचा एक प्रकार असून त्यांची विभाजनक्षमता मर्यादित असते. IMR90 फायब्रोब्लास्टमध्ये मिथिलीन ब्लू आणि विभाजनक्षम आयुष्यावरील सुरुवातीच्या अभ्यासात, संवर्धित पेशी नियोजित वेळापत्रकानुसार नव्या पात्रात हस्तांतरित केल्या गेल्या आणि संवर्धनातील पेशींचे विभाजन थांबेपर्यंत पेशीसमूह दुप्पट होण्याचे एकत्रित टप्पे नोंदवले गेले. 100 nM भोवती केंद्रित नॅनोमोलर पातळीवरील उपचारामुळे विभाजन थांबण्यापूर्वी पेशीसमूह दुप्पट होण्याचे 20 पेक्षा अधिक अतिरिक्त टप्पे पूर्ण झाले.
पेशीसमूह दुप्पट होण्याचा एक टप्पा हे नोंद ठेवण्याचे एकक आहे. पेशीसमूह साधारण किती वेळा दुप्पट झाला हे ते नोंदवते. एखादी स्वतंत्र पेशी जरावस्थेत आहे, तात्पुरती निष्क्रिय आहे, विभेदित झाली आहे किंवा मृत आहे, हे ते थेट सांगत नाही. पेशी अधिक काळ विभाजनक्षम राहिल्यामुळे, ताणाखाली कमी पेशींचे विभाजन लवकर थांबल्यामुळे किंवा परिस्थितीमुळे विभाजनशील उपसमूहाची निवड झाल्यामुळे संवर्धनात दुप्पट होण्याचे अधिक टप्पे मिळू शकतात. केवळ ही गणना त्या शक्यता वेगळ्या करू शकत नाही.
म्हणूनच दुप्पट होण्याच्या गणनेसोबत निर्देशक वापरले जातात. विभाजन किती काळ चालू राहिले हे गणना सांगते. विभाजन थांबलेल्या किंवा टिकून राहिलेल्या पेशी कोणत्या अवस्थेत गेल्या हे निर्देशक सांगतात.
अंतिम मापनांचे मार्गदर्शक: प्रत्येक निर्देशक काय सांगतो
संवर्धनातील जरावस्था हा अनेक स्वतंत्र मापनांवरून ठरवला जाणारा पेशींचा गुणधर्म आहे. कोणताही एक रंजक किंवा प्रथिन ती सिद्ध करत नाही.
DNA संश्लेषण कमी होऊन वाढ थांबणे. BrdU किंवा EdU चा कमी समावेश, चपटा आकार आणि पुन्हा संवर्धनात लावल्यानंतर वाढ न होणे यांद्वारे दीर्घकाळ टिकणारे विभाजन थांबणे तपासले जाते. यामुळे जरावस्थेमुळे थांबलेले विभाजन आणि तात्पुरती निष्क्रियता यांमध्ये फरक करता येतो.
जरावस्थेशी संबंधित बीटा गॅलॅक्टोसिडेज. SA-beta-gal सुमारे pH 6.0 वर लायसोसोममधील क्रियाशीलता रंजित करते. लायसोसोमचे एकूण प्रमाण वाढत असल्याने जरावस्थेतील फायब्रोब्लास्टमध्ये अनेकदा सकारात्मक रंजन दिसते. ते विशिष्ट निर्देशक नसल्यामुळे त्याचा अर्थ विभाजन आणि आण्विक निर्देशकांसोबत लावला जातो.
p16 आणि p21 मार्ग. p16 हे CDK4 आणि CDK6 तसेच RB मार्गाद्वारे कार्य करते. p21 अनेकदा p53 द्वारे प्रेरित होते. त्यांची वाढती पातळी विभाजन थांबल्याला आधार देते, पण यांपैकी कोणतेही प्रथिन केवळ जरावस्थेशीच संबंधित नाही.
स्रावी अवस्था. जरावस्थेशी संबंधित स्रावी गुणधर्म, म्हणजे SASP, हा साइटोकाइन्स, केमोकाइन्स, वाढीचे घटक आणि प्रोटीएसेस यांच्या स्रवणातील बदल दर्शवतो. SASP घटकांसाठी केलेल्या RNA किंवा प्रथिन चाचण्या पेशी शेजारच्या पेशींना कसे संकेत देतात हे सांगतात. त्या विभाजनक्षमता थेट मोजत नाहीत.
ऑक्सिडंट्स आणि मायटोकॉन्ड्रियाची मापने. मिथिलीन ब्लूवरील संशोधनपत्रे मायटोकॉन्ड्रियाशी संबंधित मापनांची जोड देतात: कॉम्प्लेक्स IV चे प्रमाण आणि क्रियाशीलता, ऑक्सिजनचा वापर, हीम संश्लेषण, झिल्लीचे एकूण प्रमाण, झिल्ली विभव, ATP आणि ऑक्सिडंटचे संकेत. विभाजन उशिरा थांबण्यासोबत असलेली चयापचयाची अवस्था ही मापने दर्शवतात. ती स्वतःहून जरावस्था ठरवत नाहीत, पण प्रस्तावित यंत्रणा तपासतात. NAD(P)H मिथिलीन ब्लूचे अपचयन करते आणि सायटोक्रोम c त्याचे पुन्हा ऑक्सिडीकरण करते, हे रेडॉक्स चक्राचे प्रतिरूप त्याच रेडॉक्स चक्र आणि कमी ऑक्सिडंट निर्मिती यांचा संबंध दर्शवणाऱ्या IMR90 अभ्यासात मांडले आहे. मात्रा आणि वितरणाशी संबंधित तर्क मिथिलीन ब्लूचे औषधशास्त्र आणि ऊतींमधील संपर्क यांमध्ये समाविष्ट आहे.
टेलोमिअर झिजेचा दर. योग्य एकक म्हणजे अनेक आठवड्यांत प्रत्येक दुप्पट होण्यामागे कमी झालेल्या बेस जोड्या; एका वेळबिंदूवरील लांबी नव्हे. झीज मंद असणे म्हणजे प्रत्येक विभाजनामागे कमी आखूड होणे. याचा अर्थ लांबी वाढणे असा नाही, आणि टेलोमिअरमध्ये फारसा बदल न होताही ताणामुळे IMR90 पेशींचे विभाजन थांबू शकते.
फायब्रोब्लास्ट अभ्यासांच्या तीन रचनांची तुलना
या पानासाठी तयार केलेली मूळ सामग्री म्हणजे खालील तुलना. ती पेशीप्रकार, संपर्क, मापन आणि मर्यादा एकाच ठिकाणी दाखवते.
| अभ्यास | पेशी आणि संपर्क | काय मोजले गेले | यातून काय दाखवता येत नाही |
|---|---|---|---|
| Atamna आणि सहकारी, FASEB J 2008 | सामान्य IMR90 फायब्रोब्लास्ट, दीर्घकालीन नॅनोमोलर मिथिलीन ब्लू संपर्क, प्रमाणित स्थिती म्हणून 100 nM | दुप्पट होण्याचे एकत्रित टप्पे, कॉम्प्लेक्स IV चे प्रमाण, ऑक्सिजनच्या वापरात 37 ते 70 टक्के वाढ, हीम संश्लेषण, हायड्रोजन पेरॉक्साइड किंवा कॅडमियममुळे अकाली आलेल्या जरावस्थेतून सुधारणा, HepG2 पेशींमधील फेज 2 एन्झाइम्स | जरावस्थेतील पेशी काढून टाकण्याची चाचणी नाही. प्राण्यांच्या किंवा माणसांच्या दीर्घायुष्याचे अंतिम मापन नाही. येथे विभाजनक्षम आयुष्य म्हणजे संवर्धन पात्रात पेशीसमूह दुप्पट होण्याचे टप्पे. |
| Atamna आणि सहकारी, Redox Biology 2015, AMPK आणि कॉम्प्लेक्स IV च्या जैवनिर्मितीवरील यंत्रणात्मक पुढील अभ्यासात वर्णन केलेले | IMR90 फायब्रोब्लास्ट, प्रामुख्याने 100 nM मिथिलीन ब्लू, तुलनेसाठी दीर्घकालीन AMPK सक्रियकर्ता म्हणून AICAR | कालक्रमानुसार NAD ते NADH गुणोत्तर, तात्पुरते AMPK फॉस्फोरिलेशन, PGC-1alpha आणि SURF1 ची प्रेरणा, कॉम्प्लेक्स IV च्या क्रियाशीलतेत 100 टक्क्यांपेक्षा अधिक वाढ, 28 टक्के कमी ऑक्सिडंट्स, मंद टेलोमिअर झीज, AICAR सह सुमारे 2 च्या तुलनेत सुमारे 18 अतिरिक्त दुप्पट होण्याचे टप्पे, पेशीचक्रावर परिणाम नाही | AICAR तुलनेत मात्रा साधारण 1000 पटींनी वेगळी आहे आणि विशिष्टताही वेगळी आहे, त्यामुळे ती समान परिणामक्षमतेऐवजी सक्रियतेचा नमुना तपासते. टेलोमिअरचा निष्कर्ष अनेक आठवडे विभाजन होत असलेल्या संवर्धनांना लागू होतो. |
| Xiong आणि सहकारी, Aging Cell 2016, मायटोकॉन्ड्रिया आणि केंद्रकातील सुधारणेच्या प्रोजेरिया फायब्रोब्लास्ट अभ्यासात नोंदवलेले | प्राथमिक Hutchinson-Gilford प्रोजेरियातील त्वचेचे फायब्रोब्लास्ट आणि त्यांच्याशी जुळवलेले सामान्य नियंत्रण गट, बहुतेक 5 ते 12 आठवड्यांसाठी 100 nM | प्रतिदीप्ती आणि इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शनाद्वारे मायटोकॉन्ड्रियाचा आकार, सजीव पेशींच्या प्रतिमांकनाद्वारे हालचालक्षमता, सुपरऑक्साइड, झिल्ली विभव, ATP, PGC-1alpha, विभाजन आणि जरावस्थेचे निर्देशक, तसेच केंद्रकावरील फुगवटे, प्रोजेरिनचे स्थान, हेटेरोक्रोमॅटिन आणि जनुकांची अभिव्यक्ती | रोगविशिष्ट अकाली वृद्धत्वाचे प्रतिरूप, सामान्य वृद्धत्वाचे नव्हे. आकाररचना आणि निर्देशकांतील सुधारणा म्हणजे जरावस्थेतील पेशी काढून टाकणे नव्हे. प्राण्यांमधील परिणामकारकतेचे किंवा चिकित्सीय अंतिम मापन नाही. |
| Xue आणि सहकारी, Cells 2021 आढावा, वृद्धत्वविरोधी संभाव्य संयुग म्हणून मिथिलीन ब्लूच्या आढाव्यात सारांश दिलेला | मेंदूचे वृद्धत्व, मज्जापेशींचा ऱ्हास, त्वचा, जखम भरणे आणि प्रोजेरिया यांवरील साहित्यातील एकत्रित मांडणी | वृद्धत्वाच्या मुक्त-मूलक सिद्धांतांच्या संदर्भात मिथिलीन ब्लूची मांडणी उत्प्रेरक रेडॉक्स चक्र चालवणारे संयुग म्हणून करते, जे कॉम्प्लेक्स I आणि III मधील इलेक्ट्रॉन प्रवाहाचा काही भाग वगळून पर्यायी मार्ग देऊ शकते | केवळ वर्णनात्मक एकत्रित मांडणी. ती गृहीतके व्यवस्थित मांडते आणि चिकित्सीय पुरावे कुठे अनिर्णीत राहतात हे नोंदवते. |
कोणत्याही एका ओळीपेक्षा सर्व ओळींमध्ये दिसणारा नमुना अधिक महत्त्वाचा आहे. कमी मात्रेतील मिथिलीन ब्लूचा संबंध वारंवार अधिक काळ टिकणारे विभाजन, अधिक कॉम्प्लेक्स IV क्रियाशीलता, कमी ऑक्सिडंट संकेत आणि सुधारलेली आकाररचना यांच्याशी दिसतो. अभ्यासाची रचना कालानुक्रमिकच राहते: विभाजन करणाऱ्या पेशींनी सुरुवात करणे, त्यांची संख्या वाढताना उपचार करणे आणि विभाजन किती काळ चालू राहते ते नोंदवणे. ही रचना जरावस्था उशिरा येण्याच्या दाव्याला आधार देऊ शकते. वेगळ्या रचनेशिवाय ती पेशी काढून टाकण्याच्या दाव्याला आधार देऊ शकत नाही.
जरावस्था उशिरा येणे म्हणजे जरावस्थेतील पेशी काढून टाकणे नव्हे
विलंब म्हणजे विभाजन करणाऱ्या पेशींचे विभाजन थांबण्यापूर्वी ते अधिक काळ चालू राहणे. काढून टाकणे, ज्याला अनेकदा सेनोलिटिक परिणाम म्हणतात, म्हणजे आधीच जरावस्थेत गेलेल्या पेशी निवडकपणे मारल्या जाणे किंवा त्यांची संख्या कमी होणे, तर शेजारच्या विभाजन करणाऱ्या पेशी जिवंत राहणे.
मिथिलीन ब्लूवरील फायब्रोब्लास्ट साहित्य पहिली रचना तपासते. संवर्धनातील पेशी सुरुवातीला विभाजनशील असतात, सलग हस्तांतरणादरम्यान त्यांना उपचार दिले जातात आणि त्यांचे विभाजन नंतर थांबते. त्यामुळे SA-beta-gal, p16, p21 आणि SASP घटकांसारखे निर्देशक उशिरा दिसतात किंवा एखाद्या ठरावीक हस्तांतरणाच्या टप्प्यावर कमी पातळीवर आढळतात. जरावस्थेची सुरुवात पुढे ढकलली गेली की असा नमुना अपेक्षित असतो. त्यातून आधीच जरावस्थेत गेलेली कोणतीही पेशी काढून टाकली गेली हे सिद्ध होत नाही.
सेनोलिटिक दाव्यासाठी वेगळी मांडणी आवश्यक असेल: आधी संवर्धनाला पडताळलेल्या जरावस्थेत नेणे, मग संयुग वापरणे आणि त्यानंतर विभाजन करणाऱ्या नियंत्रण पेशींच्या तुलनेत त्या जरावस्थेतील पेशींची निवडक घट दाखवणे, सोबत जिवंतपणा आणि पेशीमृत्यूची थेट मापने देणे. केवळ एखाद्या निर्देशकात घट होणे पुरेसे नाही, कारण पेशींची संख्या कमी न होताही अभिव्यक्ती बदलू शकते आणि उरलेल्या विभाजनशील पेशी वाढून संवर्धन पात्र व्यापू शकतात. संदर्भ दिलेल्या चार स्रोतांपैकी कोणताही मिथिलीन ब्लूसाठी ही निवडक पेशीघटीची रचना वापरत नाही. म्हणून अचूक वर्णन हे इन विट्रो जरावस्था लांबवणारी किंवा जरावस्थाविरोधी क्रिया असेच राहते, सेनोलिटिक नव्हे. या फरकाची ऑक्सिडेटिव्ह ताणाशी संबंधित बाजू पेशी प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींवर कसे नियंत्रण ठेवतात यात अधिक स्पष्ट केली आहे.
तात्पुरत्या संकेतप्रक्रियेचा निष्कर्ष हा मुद्दा अधिक ठळक करतो. 2015 मधील IMR90 संशोधनात मिथिलीन ब्लूमुळे NAD ते NADH गुणोत्तरात अल्पकाळ वाढ आणि अल्पकाळ AMPK फॉस्फोरिलेशन झाले. त्यानंतर कॉम्प्लेक्स IV च्या जैवनिर्मितीशी संबंधित PGC-1alpha आणि SURF1 या दोन्हींची प्रेरणा झाली. AICAR द्वारे दीर्घकालीन AMPK सक्रियतेमुळे अतिरिक्त दुप्पट होण्याच्या टप्प्यांबाबत खूपच कमी परिणाम मिळाले.
विभाजनक्षम आयुष्य म्हणजे मानवी दीर्घायुष्य नव्हे
पेशींचे विभाजनक्षम आयुष्य म्हणजे ऑक्सिजन, संवर्धन माध्यम आणि हस्तांतरणाचा क्रम निश्चित ठेवलेल्या नियंत्रित संवर्धन पात्रात विभाजन थांबण्यापूर्वी पेशीसमूह दुप्पट होण्याच्या टप्प्यांची गणना. मानवी दीर्घायुष्यात अनेक दशकांचा विकास, प्रतिकारशक्ती, रक्तवाहिन्यांची व्यवस्था, मूलपेशींचे सूक्ष्मपर्यावरण, वर्तन आणि रोग यांचा एकत्रित सहभाग असतो. एखादे संयुग पहिली गोष्ट वाढवू शकते, दुसरीत बदल न करता; आणि बहुतेक संयुगांबाबत असेच होते.
प्रोजेरिया फायब्रोब्लास्टमध्ये ठरावीक LMNA उत्परिवर्तन असते, ज्यातून प्रोजेरिन तयार होते. त्यांच्यात खंडित आणि कमी हालचालक्षम मायटोकॉन्ड्रिया, कमी ATP, विकृत आकाराची केंद्रके आणि हेटेरोक्रोमॅटिनची घट आढळते. नॅनोमोलर मिथिलीन ब्लूमुळे मायटोकॉन्ड्रियाची मापने सुधारली आणि केंद्रकाशी संबंधित मापनांमध्ये लक्षणीय सुधारणा झाली, ज्यात झिल्लीपासून प्रोजेरिन वेगळे होणेही समाविष्ट होते. ही पेशीपातळीवरील लक्षणीय सुधारणा आहे. तरीही हा फायब्रोब्लास्टमधील निष्कर्षच आहे, आणि लेखकांनी प्राण्यांवरील चाचण्यांची मांडणी भविष्यातील काम म्हणून केली. या रोगप्रतिरूपाची अधिक चर्चा प्रोजेरिया आणि अकाली वृद्धत्वाच्या प्रतिरूपांमध्ये मिथिलीन ब्लू यात केली आहे.
यावरून अभ्यास वाचण्यासाठी पुढील व्यावहारिक तपासणीसूची मिळते.
- उपचार विभाजन थांबण्यापूर्वी सुरू झाले की विभाजन थांबल्याची अवस्था प्रस्थापित झाल्यानंतर, हे विचारा. आधी सुरू केलेले उपचार विलंबाला आधार देतात. काढून टाकण्याच्या दाव्यासाठी नंतरचे उपचार आणि निवडक पेशीमृत्यूची माहिती आवश्यक आहे.
- नियंत्रण गटाचा दुप्पट होण्याचा आलेख कसा होता, हे विचारा. दुप्पट होण्याची एकत्रित गणना नसल्यास निर्देशकांतील बदलांना योग्य संदर्भ राहत नाही.
- केवळ एक रंजक वापरण्याऐवजी किमान दोन प्रकारचे निर्देशक मागा; उदाहरणार्थ, विभाजनाचे लेबल, सोबत p16 किंवा p21 आणि SA-beta-gal.
- टेलोमिअरची माहिती कशी नोंदवली होती, हे विचारा. कालांतराने प्रत्येक दुप्पट होण्यामागील दर अर्थपूर्ण असतो. लांबीचे एकच क्षणचित्र तसे नसते.
- काय स्थिर ठेवले होते, हे विचारा. हस्तांतरणाच्या वेळी पेशींची घनता, ऑक्सिजन, संवर्धन माध्यमातील बदल आणि मिथिलीन ब्लूचे ताजे किंवा जुने साठवलेले द्रावण या सर्व गोष्टी फायब्रोब्लास्टचे विभाजन थांबण्यावर परिणाम करतात.
अशा प्रकारे वाचल्यास, फायब्रोब्लास्टवरील साहित्य मिथिलीन ब्लूला सुसंगत पण मर्यादित भूमिका देते: कमी मात्रेतील, रेडॉक्स-सक्रिय संयुग, जे संवर्धित मानवी फायब्रोब्लास्टमध्ये विभाजनाशी संबंधित जरावस्था उशिरा आणते आणि मायटोकॉन्ड्रियाची मापने सुधारते. तात्पुरती ऊर्जासंकेत प्रक्रिया आणि कॉम्प्लेक्स IV ची जैवनिर्मिती यांभोवती यंत्रणेचे सर्वात ठोस तपशील उपलब्ध आहेत; मात्र या संशोधनपत्रांमध्ये जरावस्थेतील पेशी काढून टाकल्याचे किंवा मानवी आयुष्य वाढवल्याचे कोणतेही प्रात्यक्षिक नाही.