मेथिलीन ब्लू आणि फेरोप्टोसिस: लोह, लिपिड पेरॉक्सिडेशन आणि पेशीमृत्यू

फेरोप्टोसिस म्हणजे पटलाच्या हानीमुळे होणारा पेशीमृत्यू. पटलांमधील बहुअसंतृप्त मेदांचे साखळी अभिक्रियेत ऑक्सिडीकरण होते, पटल निकामी होते आणि पेशी मरते. या रासायनिक प्रक्रियेसाठी लोह आवश्यक असते. एवढ्यातच संपूर्ण संकल्पना सामावलेली आहे आणि या लेखातील प्रत्येक गोष्ट तिच्या एका भागाची चाचणी आहे.

येथील प्रश्न अधिक नेमका आहे: पेशींवरील प्रयोगांत मेथिलीन ब्लू या साखळीत काय करते आणि त्या निष्कर्षातून प्रत्यक्षात काय दिसते? थोडक्यात उत्तर असे की, दोन प्रयोगशाळीय अभ्यासांमध्ये nanomolar सांद्रतेतील मेथिलीन ब्लूने माइटोकॉन्ड्रियातील लिपिड पेरॉक्सिडेशन कमी केले आणि एरवी फेरोप्टोसिस घडवणाऱ्या घटकांच्या संपर्कानंतरही पेशी जिवंत ठेवल्या. सविस्तर उत्तर अधिक महत्त्वाचे आहे, कारण साखळीतील प्रत्येक दुवा वेगळ्या हस्तक्षेपाने तपासण्यात आला होता आणि प्रत्येक हस्तक्षेपाला मर्यादा आहेत.

एका परिच्छेदात फेरोप्टोसिस

बहुअसंतृप्त मेदाम्लाची शेपटी असलेल्या पटलातील फॉस्फोलिपिडमध्ये एक कमकुवत जागा असते: सहज हिरावून घेता येणारे हायड्रोजन अणू. एखाद्या मुक्त मूलकाने त्यापैकी एक अणू हिरावून घेतला की ऑक्सिजन त्या लिपिडला जोडला जातो, लिपिड पेरॉक्सिल मूलक तयार होते आणि ते मूलक पुढील लिपिडकडून हायड्रोजन हिरावून घेते. काहीतरी ही अभिक्रिया थांबवत नाही तोपर्यंत ती पटलावर पुढे पसरत राहते.

या प्रक्रियेला थांबवणारा मुख्य घटक म्हणजे GPX4 नावाचे एन्झाइम. ते ग्लुटाथायोनचा वापर करून लिपिड पेरॉक्साइड्सचे अपचयन करते आणि त्यांचे निरुपद्रवी लिपिड अल्कोहोलमध्ये रूपांतर करते. प्रयोगशाळेत वापरले जाणारे प्रेरक घटक या संरक्षणव्यवस्थेवर ठरावीक टप्प्यांवर आघात करतात. एरास्टिन प्रणाली xc-मायनसद्वारे होणारा सिस्टीनचा प्रवेश रोखते, त्यामुळे ग्लुटाथायोन संश्लेषणासाठी पेशीला सिस्टेईनची कमतरता भासते. ब्यूथिओनिन सल्फोक्सिमिन थेट ग्लुटाथायोन संश्लेषण रोखते. RSL3 हे GPX4 लाच प्रतिबंधित करते. या तिन्हीमुळे पेरॉक्साइड्स दूर केले जात नाहीत; मात्र हे वेगवेगळ्या टप्प्यांवर घडते. म्हणून एका प्रेरक घटकासोबत मिळालेला निष्कर्ष आपोआप इतरांनाही लागू होत नाही.

फेरोप्टोसिसची व्याख्या करणाऱ्या गुणधर्मांमुळे तो अपॉप्टोसिसपेक्षा वेगळा ठरतो. यात कॅस्पेस अभिक्रियांची साखळी नसते आणि अपॉप्टोटिक पिंडही नसतात. डिफेरॉक्सामिनसारखे लोह चिलेटर्स आणि फेरोस्टॅटिन-1 सारखे मुक्त मूलक अडकवणारे घटक तो दडपतात. पेशीमृत्यू केवळ नेक्रोटिक नसून फेरोप्टोटिक आहे असे ठरवण्यासाठी संशोधक ही कार्याधारित चाचणी वापरतात. नियमनबद्ध पेशीमृत्यूच्या विविध मार्गांचा व्यापक संदर्भ हा फरक समजून घेण्यास मदत करतो. पेशी सहज अभिक्रियेत भाग घेऊ शकणारे लोह कसे हाताळतात, यावरून चिलेशन ही इतकी निर्णायक नियंत्रण चाचणी का आहे ते स्पष्ट होते.

माइटोकॉन्ड्रियाची भूमिका कुठे आहे आणि त्यावर वाद का होता

सुरुवातीच्या संशोधनात माइटोकॉन्ड्रियल DNA नसलेल्या पेशींमध्येही फेरोप्टोसिस होतो असे नोंदवण्यात आले. त्यामुळे माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक नसावेत असे सुचले. नंतरच्या संशोधनात असे आढळले की माइटोकॉन्ड्रियाचे प्रमाण कमी केल्याने किंवा पेशीय श्वसन रोखल्याने सिस्टेईनच्या अभावामुळे होणारा फेरोप्टोसिस दडपला जाऊ शकतो, पण थेट GPX4 प्रतिबंधामुळे होणारा फेरोप्टोसिस नाही. माइटोकॉन्ड्रियाचे योगदान प्रेरक घटक, पेशीचा प्रकार आणि निर्णायक पेरॉक्सिडेशन कुठे घडते यांवर अवलंबून असेल, तर दोन्ही निष्कर्ष खरे असू शकतात.

या लेखाचा आधार असलेल्या अभ्यासाने पेशीतील विशिष्ट कप्प्यासाठी तयार केलेल्या प्रोबचा वापर करून हा वाद तपासला. MitoCLox हा लिपिड पेरॉक्सिडेशन दर्शवणाऱ्या निर्देशकाचा माइटोकॉन्ड्रियाला लक्ष्य करणारा प्रकार आहे: माइटोकॉन्ड्रियाच्या आत लिपिड पेरॉक्सिल मूलकांशी संपर्क आल्यावर त्याचे प्रतिदीप्ती गुणधर्म बदलतात. एरास्टिन दिलेल्या फायब्रोब्लास्ट्समध्ये पेशी मरायच्या आधी, अजून जिवंत असतानाच माइटोकॉन्ड्रियल प्रोबचे ऑक्सिडीकरण दिसले आणि पेशींच्या समूहात त्याचे प्रमाण असमान होते. हा घटनाक्रम महत्त्वाचा आहे. मृत्यूच्या आधी होणारे पेरॉक्सिडेशन हे संभाव्य कारण असू शकते. केवळ मृत पेशींमध्ये मोजलेले पेरॉक्सिडेशन म्हणजे उरलेले अवशेष. लिपिड पेरॉक्सिडेशनच्या चाचण्या आणि प्रत्येक प्रोब काय दर्शवतो या पूरक मार्गदर्शकात प्रोबचे स्थान संकेताचा अर्थ का ठरवते हे स्पष्ट केले आहे.

दुसऱ्या मॉडेलमध्येही हाच क्रम दिसला. लेबर आनुवंशिक ऑप्टिक न्युरोपॅथी असलेल्या रुग्णाच्या फायब्रोब्लास्ट्समध्ये कॉम्प्लेक्स I चे उत्परिवर्तन आणि सुरुवातीपासूनच अधिक ऑक्सिडेटिव्ह ताण होता. ग्लुटाथायोन कमी केल्यावर या पेशी फेरोप्टोसिसमुळे मरण पावल्या, तर नियंत्रण गटातील फायब्रोब्लास्ट्सने प्रतिकार केला. माइटोकॉन्ड्रियल प्रोबचे ऑक्सिडीकरण पुन्हा आधी झाले. तपशील फेरोप्टोसिसमधील माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरॉक्सिडेशनचा फायब्रोब्लास्ट अभ्यास येथे दिले आहेत.

या प्रयोगांमध्ये मेथिलीन ब्लूने काय बदलले

मेथिलीन ब्लू हा रेडॉक्स वाहक आहे. त्याचे ऑक्सिडीकृत रूप कॉम्प्लेक्स I मधील NADH-संबंधित रासायनिक प्रक्रियेतून इलेक्ट्रॉन स्वीकारते आणि त्याचे अपचयित रूप ते सायटोक्रोम c ला देते, जे पुढे कॉम्प्लेक्स IV ला इलेक्ट्रॉन पुरवते. यामुळे साखळीतील त्या भागाला अंशतः पर्यायी मार्ग मिळतो, जिथे सामान्यतः इलेक्ट्रॉन ऑक्सिजनकडे गळती होऊन सुपरऑक्साइड तयार करतात. इलेक्ट्रॉन हस्तांतरणाचे संपूर्ण चित्र जाणून घेऊ इच्छिणाऱ्या वाचकांनी मेथिलीन ब्लू माइटोकॉन्ड्रियातून इलेक्ट्रॉन कसे वाहून नेते येथून सुरुवात करावी.

एरास्टिन दिलेल्या फुफ्फुसातील फायब्रोब्लास्ट्समध्ये, पेशींचे जिवंत राहणे मोजणाऱ्या चाचणीत 250 nanomolar मेथिलीन ब्लूने पेशींची जीवनक्षमता टिकवली. माइटोकॉन्ड्रियाला लक्ष्य करणाऱ्या SkQ1 आणि MitoTEMPO या अँटिऑक्सिडंट्ससोबतही हे दिसले. नियंत्रण चाचण्यांमुळे दाव्याची व्याप्ती स्पष्ट होते. फेरोस्टॅटिन-1, अल्फा-टोकोफेरॉल आणि डिफेरॉक्सामिन यांनीही संरक्षण दिले, ज्यामुळे हा पेशीमृत्यू फेरोप्टोटिक असल्याची पुष्टी होते. अँटिऑक्सिडंट गट नसलेल्या SkQ1 च्या संरचनात्मक समरूप पदार्थाने संरक्षण दिले नाही. त्यामुळे परिणाम केवळ अविशिष्ट साठ्यामुळे नसून रेडॉक्स रासायनिक प्रक्रियेमुळे असल्याचे सूचित होते. SkQ1 ची सांद्रता साधारण 200 nanomolar पेक्षा जास्त झाल्यावर संरक्षण कमी झाले. जास्त प्रमाणात क्विनोन अँटिऑक्सिडंट्स ऑक्सिडीकरणाला चालना देतात या ज्ञात वर्तनाशी हे सुसंगत आहे. मेथिलीन ब्लूचेही सांद्रतेनुसार असेच दुहेरी वर्तन दिसते: या पेशी-संवर्धन पात्रांमध्ये कमी nanomolar पातळीवर ते संरक्षण देते, पण सांद्रता अधिक वाढवल्यावर किंवा तीव्र प्रकाश पडल्यावर रेडॉक्स चक्रणाद्वारे हायड्रोजन पेरॉक्साइड निर्माण करू शकते. अशा प्रकारचा सांद्रतेचा संदर्भ माइटोकॉन्ड्रियातील प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रकार येथे दिला आहे.

त्यानंतर विलग केलेल्या माइटोकॉन्ड्रियावरील प्रयोगांनी ROS चे स्रोत वेगळे करून तपासले. फेरस लोह उपस्थित असताना, कॉम्प्लेक्स I ला पुरवठा करणाऱ्या सबस्ट्रेट्ससोबत रोटेनोन दिल्याने प्रोबच्या ऑक्सिडीकरणाला चालना मिळाली. रोटेनोन फ्लेविन स्थळानंतरचा मार्ग अडवते, त्यामुळे त्याआधीचे वाहक अपचयित अवस्थेत राहतात आणि मॅट्रिक्सकडे तोंड असलेल्या फ्लेविनमधून इलेक्ट्रॉन ऑक्सिजनकडे गळतात. कॉम्प्लेक्स III ला पुरवठा करणाऱ्या सबस्ट्रेट्ससोबत अँटिमायसिन A दिल्याने भरपूर हायड्रोजन पेरॉक्साइड तयार झाले, पण लिपिड पेरॉक्सिडेशनला चालना मिळाली नाही. एकूण ROS चा संकेत तसाच, पण स्थान वेगळे आणि परिणामही वेगळा. SkQ1 आणि मेथिलीन ब्लू या दोन्हींनी हायड्रोजन पेरॉक्साइडचे उत्पादन न दडपता कॉम्प्लेक्स I मुळे होणारे पेरॉक्सिडेशन दडपले. त्यामुळे त्यांची क्रिया ROS तयार झाल्यानंतर, लिपिड पेरॉक्सिडेशनच्या टप्प्यावर होते असे दिसते.

अतिरिक्त लोहाचा प्रयोग आणि लिपोफुसिनचा धागा

दुसऱ्या अभ्यासाने लोहाच्या बाजूने हा प्रश्न तपासला. submillimolar सांद्रतेतील फेरिक अमोनियम सिट्रेटच्या संपर्कात आलेल्या H9c2 हृदयस्नायू पेशींमध्ये प्रथम माइटोकॉन्ड्रियल ROS, नंतर माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरॉक्सिडेशन आणि मग फेरोप्टोसिस झाला. त्यानंतर 24 hours च्या आत लिपोफुसिनसारखे रंगद्रव्य साचले. लिपोफुसिन हा ऑक्सिडीकृत लिपिड्स आणि प्रथिनांचा, लोह असलेला व स्वयंप्रतिदीप्ती दर्शवणारा अवशेष आहे, जो वयानुसार साचत जातो. येथे तो वेगाने दिसल्यामुळे लोहामुळे होणाऱ्या तीव्र पेरॉक्सिडेशनचा संबंध वृद्धत्वाच्या एका पारंपरिक निदर्शकाशी जोडला जातो. nanomolar सांद्रतेतील मेथिलीन ब्लू आणि SkQ1 या दोन्हींनी पेरॉक्सिडेशन, पेशीमृत्यू आणि रंगद्रव्याचा साठा रोखला. विलग केलेल्या हृदयातील माइटोकॉन्ड्रियानेही या क्रमाची पुष्टी केली: रोटेनोनसोबत फेरस लोह दिल्याने पेरॉक्सिडेशन आणि रंगद्रव्यासारखा संकेत निर्माण झाला आणि दोन्ही घटकांनी तो रोखला. संपूर्ण क्रम H9c2 हृदयस्नायू पेशींमधील अतिरिक्त लोहाचा अभ्यास येथे नोंदवला आहे. या प्रक्रियेतील रंगद्रव्याचा भाग लिपोफुसिन आणि पेशीय वृद्धत्वाचे निदर्शक या विषयाशी संबंधित आहे.

पेशींच्या जिवंत राहण्याच्या चाचण्या काय दाखवत नाहीत

CellTiterBlue सारखी जीवनक्षमता मोजणारी चाचणी, प्रेरक घटक आणि संभाव्य संरक्षक घटक दिल्यानंतर पात्रातील किती पेशी चयापचयाच्या दृष्टीने सक्रिय राहतात हे दर्शवते. ही निश्चित केलेल्या प्रणालीतील एका यंत्रणेची चाचणी आहे. हा उपचाराचा परिणाम नाही. यांपैकी कोणत्याही प्रयोगात रुग्णाला मात्रा दिली गेली नाही, रोगाशी संबंधित अंतिम परिणाम मोजला गेला नाही किंवा शरीरात सुरक्षित व उपचारक्षम मात्रांची मर्यादा निश्चित केली गेली नाही.

चार मर्यादा स्पष्टपणे नमूद करणे आवश्यक आहे. पहिली, पेशींचे प्रकार मर्यादित आहेत: रूपांतरित फुफ्फुसातील फायब्रोब्लास्ट्स, माइटोकॉन्ड्रियल रोगाशी संबंधित एका पेशी-वंशासह प्राथमिक त्वचेतील फायब्रोब्लास्ट्स आणि उंदराच्या हृदयस्नायू पेशींचा एक वंश, तसेच विलग केलेले उंदराच्या हृदयातील माइटोकॉन्ड्रिया. संवेदनशीलता पेशी-वंशानुसार बदलली आणि LHON पेशी-वंश अभ्यासाच्या निवडीमुळेच असामान्यपणे असुरक्षित होता. दुसरी, प्रेरक घटक प्रयोगशाळेतील टोकाच्या परिस्थिती निर्माण करतात: वाहतूक किंवा संश्लेषण पूर्णपणे रोखणे आणि कोणत्याही ऊतीला अचानक सहन करावे लागणार नाही इतके लोह देणे. तिसरी, केवळ गुणाकार करून सांद्रतेचे मात्रेत रूपांतर करता येत नाही. संवर्धन माध्यमातील nanomolar सांद्रता म्हणजे मानवासाठीची मात्रा नव्हे. मेथिलीन ब्लूचे वितरण, रक्त आणि ऊतींमध्ये त्याचे रंगहीन रूपात होणारे अपचयन, प्रकाशाचा संपर्क आणि पटल विभव हे सर्व घटक प्रयोगातील पात्र आणि व्यक्ती यांमधील फरकावर परिणाम करतात. चौथी, प्रोब त्यांच्या स्वतःच्या कप्प्यातील स्थिती दर्शवतात. MitoCLox चे ऑक्सिडीकरण माइटोकॉन्ड्रियामध्ये लिपिड मूलक तयार झाले हे दाखवते; पण बहुधा अंतिम घटना असलेले प्लाझ्मा पटल फुटणे थेट रोखले गेले, की त्याआधीच्या टप्प्यावर हस्तक्षेप झाल्याने टळले, हे दाखवत नाही.

म्हणून प्रामाणिकपणे करता येणारा दावा असा आहे: या मॉडेल्समध्ये कॉम्प्लेक्स I मधून निर्माण झालेले ROS आणि लोह मिळून माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरॉक्सिडेशन घडवतात, जे फेरोप्टोसिसच्या आधी होते, आणि कमी सांद्रतेतील मेथिलीन ब्लू हा टप्पा थांबवते. या टप्प्यापलीकडील कोणत्याही निष्कर्षासाठी आधी प्राण्यांमध्ये आणि नंतर मानवांमध्ये वेगळे प्रयोग आवश्यक आहेत.