मेथिलीन ब्लू मायटोकॉन्ड्रियातील कॉम्प्लेक्स III ला वळसा घालू शकते का? अभ्यासांचे निष्कर्ष का जुळत नाहीत

दोन प्रयोगशाळांनी मेथिलीन ब्लू अवरोधित मायटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स III ला वळसा घालू शकते का, हा प्रश्न विचारला. एकीने नाही असे उत्तर दिले. दुसरीने हो असे उत्तर दिले. दोन्हींकडे आकडेवारी होती.

उंदरांच्या मेंदूतील मायटोकॉन्ड्रियावर केलेल्या पहिल्या अभ्यासात, हा रंगद्रव्य वळसा घालू शकत नसल्याचे आढळले. कृंतकांच्या तीन प्रजातींच्या मेंदूतील मायटोकॉन्ड्रियावर केलेल्या दुसऱ्या अभ्यासात, ते अंशतः शक्य असल्याचे आढळले. उंदरांच्या यकृतावरील तिसऱ्या अभ्यासाचा अनेकदा याच संदर्भात उल्लेख केला जातो, पण त्याने वेगळाच प्रश्न तपासला होता. त्याला योग्य संदर्भात ठेवल्यास निम्मा गोंधळ दूर होतो.

इथे जाहीर करता येईल अशी कोणतीही सार्वत्रिक यंत्रणा नाही. वेगवेगळे अवरोधक, मात्रा आणि मोजमापे असलेले तीन प्रयोग आहेत. आधी प्रयोगांची परिस्थिती वाचा. निष्कर्ष त्यातून समजतील.

इथे वळसा घालणे म्हणजे काय

इलेक्ट्रॉन कॉम्प्लेक्स I मधून (NADH कडून) किंवा कॉम्प्लेक्स II मधून (सक्सिनेटकडून) साखळीत प्रवेश करतात, कॉम्प्लेक्स III मधून सायटोक्रोम c पर्यंत जातात आणि नंतर कॉम्प्लेक्स IV मधून ऑक्सिजनपर्यंत पोहोचतात. या मार्गावर निर्माण होणारा प्रवणता फरक पेशी ATP तयार करण्यासाठी वापरते.

वळसा घालण्याच्या दाव्याचा अर्थ असा की मेथिलीन ब्लू अवरोधाच्या आधीच्या भागातून इलेक्ट्रॉन घेते आणि ते अवरोधाच्या पुढच्या भागात देते. ऑक्सिडित रंगद्रव्य NADH किंवा साखळीच्या सुरुवातीच्या घटकांकडून इलेक्ट्रॉन घेऊन ल्युकोमेथिलीन ब्लू बनते, आणि हे अपचयित रूप ते इलेक्ट्रॉन सायटोक्रोम c कडे किंवा पुन्हा साखळीत देते. हे हस्तांतरण अवरोधाच्या पुढे झाल्यास श्वसन आणि झिल्ली विभव अंशतः पूर्ववत होतात. ते अवरोधाच्या ठिकाणी किंवा त्याच्या आधी झाल्यास काहीही पूर्ववत होत नाही.

कॉम्प्लेक्स III चा एक तपशील या वादातील बराच भाग ठरवतो. या कॉम्प्लेक्समध्ये दोन अवरोधक स्थळे असलेले Q चक्र चालते. अँटिमायसिन Qi स्थळाला बांधते. मिक्सोथायाझोल Qo स्थळाला बांधते. यांपैकी फक्त एक वापरणाऱ्या अभ्यासाने कॉम्प्लेक्सचा केवळ अर्धा भाग तपासलेला असतो.

पहिला अभ्यास: उंदरांच्या मेंदूतील मायटोकॉन्ड्रियात वळसा आढळला नाही

Gureev आणि सहकाऱ्यांनी C57BL/6 उंदरांच्या मेंदूच्या बाह्यकातील मायटोकॉन्ड्रिया वापरले. ते डिजिटोनिनच्या मदतीने विलग केले होते आणि 0.1 mg protein per ml या सांद्रतेवर तपासले होते. सब्स्ट्रेटच्या तीन परिस्थिती होत्या: पायरुवेट आणि मॅलेट प्रत्येकी 5 mM, सक्सिनेट 10 mM सोबत ग्लुटामेट 2 mM, आणि L-प्रोलिन 10 mM. अवरोधक म्हणून रोटेनोन 1 micromolar (कॉम्प्लेक्स I) आणि अँटिमायसिन 1 microgram per ml (कॉम्प्लेक्स III) वापरले. रंगद्रव्याच्या मात्रा 0.5, 1 आणि 2 micromolar होत्या; मुख्य सांद्रता 1 micromolar होती. पद्धती आणि नोंदवलेले आलेख FEBS Letters मधील संक्षिप्त संशोधन लेखात दिले आहेत.

कॉम्प्लेक्स I ला वळसा घालणे यशस्वी झाले. रोटेनोनने ADP-उत्तेजित श्वसन सुमारे 121 वरून सुमारे 2 nmol per minute per mg पर्यंत कमी केले, आणि 1 micromolar रंगद्रव्याने ते सुमारे 21 पर्यंत पूर्ववत केले. पायरुवेट आणि मॅलेट तसेच L-प्रोलिन वापरल्यावर झिल्ली विभव पूर्ववत झाला.

कॉम्प्लेक्स III ला वळसा घालणे यशस्वी झाले नाही. अँटिमायसिनने श्वसन सुमारे 16 पर्यंत कमी केले, आणि रंगद्रव्याने ते फक्त सुमारे 20 पर्यंत वाढवले. रंगद्रव्याची मात्रा 5 micromolar पर्यंत वाढवूनही कोणत्याही सब्स्ट्रेटवर झिल्ली विभव पूर्ववत झाला नाही. पेरॉक्साइडची आकडेवारीही याच दिशेने होती: केवळ रंगद्रव्यामुळे पेरॉक्साइड उत्सर्जनाचा दर सुमारे 76 pmol per minute per mg या मूलभूत दरावरून तीन मात्रांवर अनुक्रमे सुमारे 1170, 1460 आणि 1945 पर्यंत वाढला; मात्र अँटिमायसिनने रंगद्रव्यामुळे निर्माण झालेला हा संकेत अनुक्रमे सुमारे 25, 88 आणि 96 percent ने कमी केला. अपचयित रंगद्रव्य थेट ऑक्सिजनशी अभिक्रिया करत असते, तर कॉम्प्लेक्स III अवरोधित केल्याने हा संकेत कमी व्हायला नको होता. लेखकांनी असा निष्कर्ष काढला की अपचयित रंगद्रव्याचे ऑक्सिडीकरण कॉम्प्लेक्स III च्या Qo स्थळावर, अँटिमायसिनच्या अवरोधाच्या आधी होते. हा छोटा फेरा शब्दांत असा: इलेक्ट्रॉनदात्यांकडून रंगद्रव्याकडे, रंगद्रव्याकडून Qo कडे, आणि पुढे नेहमीच्या मार्गाने. रोटेनोनला वळसा घातला जातो. अँटिमायसिनला नाही.

दुसरा अभ्यास: तीन प्रजातींमध्ये, दोन्ही अवरोधक स्थळांवर अंशतः वळसा

Svab आणि सहकाऱ्यांनी प्रयोगाची व्याप्ती वाढवली. उंदीर, घूस आणि गिनी पिग यांच्या मेंदूतील मायटोकॉन्ड्रिया Percoll च्या मदतीने विलग केले आणि त्याच 0.1 mg per ml सांद्रतेवर तपासले. पायरुवेट आणि मॅलेट किंवा ग्लुटामेट आणि मॅलेट प्रत्येकी 5 mM वापरले. त्यांनी कॉम्प्लेक्स III चे दोन अवरोधक वापरले: अँटिमायसिन A 0.3 micromolar आणि मिक्सोथायाझोल 1 micromolar. बहुतांश चाचण्यांमध्ये रंगद्रव्य 2 micromolar होते, तर सायटोक्रोम c च्या चाचण्यांमध्ये 0.5 होते. एकसारख्या प्रयोगपद्धतींनी तपासलेल्या तिन्ही प्रजातींची माहिती मुक्त प्रवेश असलेल्या संशोधन लेखात दिली आहे.

तिन्ही प्रजातींमध्ये दोन्ही अवरोधांना अंशतः वळसा घातला गेला. उंदरांच्या मायटोकॉन्ड्रियात अँटिमायसिनने श्वसन कमी केले आणि रंगद्रव्याने ते सुमारे 60 percent ने वाढवले, म्हणजे जवळपास 37 वरून 59 nmol per minute per mg पर्यंत. मिक्सोथायाझोलने ते 88 percent ने कमी करून सुमारे 4.5 पर्यंत आणले, आणि रंगद्रव्याने ते पाचपट वाढवून सुमारे 23 पर्यंत नेले. दोन्हीपैकी कोणताही अवरोधक असताना झिल्ली विभव अंशतः पुन्हा प्रस्थापित झाला. प्रकाशीय मापनातील कृत्रिम परिणाम वगळण्यासाठी तो दोन रंगद्रव्यांनी (सॅफ्रॅनिन O आणि गुणोत्तरमापक TMRM) मोजला गेला.

या लेखात इलेक्ट्रॉन हस्तांतरणाची थेट चाचणीही केली गेली, जी पहिल्या अभ्यासात केलीच नव्हती. बाहेरून दिलेल्या 25 micromolar अॅसिटिलित सायटोक्रोम c चे अपचयन ऊर्जित मायटोकॉन्ड्रियामुळे झाले नाही, मग अवरोधक असोत वा नसोत; पण रंगद्रव्य घातल्यावर दोन्ही परिस्थितींमध्ये अपचयन झाले. पेशीविरहित बफरमध्ये NADH आणि रंगद्रव्य यांनी NADH च्या प्रमाणाशी समप्रमाणात असलेल्या दराने सायटोक्रोम c चे अपचयन केले. ही मोठी उडी शब्दांत अशी: अपचायक समतुल्य रंगद्रव्याकडे, रंगद्रव्याकडून थेट सायटोक्रोम c कडे, आणि कॉम्प्लेक्स IV मधून ऑक्सिजनकडे. हा मार्ग कॉम्प्लेक्स III पूर्णपणे टाळतो, त्यामुळे दोन्ही अवरोधकांना वळसा घालता येतो.

दोन अतिरिक्त मोजमापे या अर्थाला आधार देतात. मिक्सोथायाझोलने प्रक्रिया केलेल्या मायटोकॉन्ड्रियात रंगद्रव्य घातल्यावर NAD(P)H प्रतिदीप्ती कमी झाली, म्हणजे अपचायक समतुल्य नव्या मार्गातून पुढे जात होते. तसेच 660 nm वरील रंगद्रव्याच्या प्रकाशशोषणात प्रत्येक पदार्थ घातल्यानंतर त्यानुसार बदल दिसले. अपकेंद्रीकरणानंतरच्या वरच्या द्रवस्तरांच्या तपासणीत असे दिसले की ऊर्जित मायटोकॉन्ड्रियाच्या आत ऑक्सिडित रंगद्रव्याचे प्रमाण शंभरपटीहून अधिक वाढले आणि विभव कोसळल्यावर ते बाहेर पडले. प्रोटॉनचा हिशेबही जुळतो: प्रोटॉन पंप करणाऱ्या पायऱ्या टाळल्याने प्रत्येक इलेक्ट्रॉन जोडीमागे 10 ऐवजी सुमारे 2 प्रोटॉन उरतात. त्यामुळे ऑक्सिजनचा वापर वेगाने होणे, पण पुनर्ध्रुवीकरण फक्त अंशतः होणे, हे खऱ्या वळशाचे स्वरूप आहे; त्याच्या विरोधातील पुरावा नव्हे.

याच तयारीत असे प्रतिसादही दिसले की वरवर वाचल्यास चुकीचा अर्थ निघू शकतो. अवरोधक आणि रंगद्रव्य एकत्र असताना ADP ने श्वसन वाढवण्याऐवजी कमी केले, आणि वाहतूक अवरोधित केल्याने ते मंदावण्याऐवजी वाढले; तरीही झिल्ली विभव नेहमीच्या दिशांनी बदलत राहिला. या प्रणालीत केवळ ऑक्सिजन वापराचे मोजमाप दिशाभूल करते.

तिसरा अभ्यास: कॉम्प्लेक्स III नव्हे, तर I आणि II तपासणारा यकृतावरील अभ्यास

Lee आणि Boelsterli यांनी उंदरांच्या यकृतातील मायटोकॉन्ड्रिया आणि संवर्धित यकृतपेशी वापरल्या. त्यांना एफाविरेन्झने (कॉम्प्लेक्स I, IC50 सुमारे 30 micromolar) आणि आयसोनियाझिडच्या चयापचयातून तयार होणाऱ्या हायड्राझिनने (कॉम्प्लेक्स II, IC50 सुमारे 30 micromolar) इजा झाली होती. सुमारे 30 micromolar रंगद्रव्याने NADH ऑक्सिडीकरण, झिल्ली विभव आणि ATP पूर्ववत केले, तसेच ऑक्सिडंट्स आणि नेक्रोसिसमुळे होणारा पेशीमृत्यू कमी केला. Redox Biology मधील संशोधन लेखात याचे प्रारूप असे मांडले आहे की रंगद्रव्य बाधित कॉम्प्लेक्स I आणि II ला वळसा घालून इलेक्ट्रॉन वाहून नेते.

हा निष्कर्ष साखळीच्या आधीच्या भागाबाबत सहमती असलेला संदर्भ आहे. तो कॉम्प्लेक्स III विषयी काहीही सांगत नाही, कारण या प्रयोगात तिथे काहीही अवरोधित केले नव्हते. त्यामुळे तो मेंदूवरील दोन्हीपैकी कोणत्याही अभ्यासाला पुष्टी देऊ शकत नाही किंवा खोडूनही काढू शकत नाही.

प्रयोगांच्या परिस्थितींची तुलना

कॉम्प्लेक्स III वरील दोन्ही अभ्यास आपापल्या प्रयोगरचनेबाबत बरोबर असण्याची चार कारणे

1. अवरोधकाचा हस्तक्षेप एकसारखा नव्हता. एका बाजूला केवळ अँटिमायसिन 1 microgram per ml, तर दुसऱ्या बाजूला अँटिमायसिन 0.3 micromolar आणि स्वतंत्र Qo स्थळ अवरोधक. Qo स्थळात इलेक्ट्रॉन देणारा रंगद्रव्याचा मार्ग नेमका तिथेच अयशस्वी होतो जिथे थेट सायटोक्रोम c कडे जाणारा मार्ग यशस्वी होतो. एक स्थळ दोन्हींचे प्रतिनिधित्व करू शकत नाही.

2. रंगद्रव्याची मात्रा आणि वेळ वेगळी होती. मुख्य सांद्रता एका अभ्यासात 1 तर दुसऱ्यात 2 micromolar होती. हे असे रेडॉक्स चक्रात भाग घेणारे रंगद्रव्य आहे, ज्याचे आत घेतले जाणे आणि सायटोक्रोम c चे थेट अपचयन करणे सांद्रता व वेळेवर अवलंबून असते. मात्रेतील लहान फरक आणि मोजमापाच्या वेळेतील फरक एकाच जाळ्यातील वेगवेगळे मार्ग समोर आणू शकतात.

3. नमुना तयार करण्याच्या पद्धती वेगळ्या होत्या. डिजिटोनिनने विलगीकरण आणि Percoll प्रवणतेद्वारे विलगीकरण यांतून निवडले जाणारे मायटोकॉन्ड्रियाचे समूह काही प्रमाणात समान असतात, पण पूर्णपणे सारखे नसतात. प्रथिनांची सांद्रता दोन्हीकडे 0.1 mg per ml होती, त्यामुळे हा चल बाजूला पडतो; मात्र मायटोकॉन्ड्रियाचे उपसमूह आणि त्यांची अखंडता हे फरक उरतात. प्रजातीतील फरकाची शंकाही दूर झाली: दुसऱ्या गटाला उंदरांमध्येही तसाच प्रतिसाद मिळाला.

4. सब्स्ट्रेटची स्थिती रंगद्रव्य काय करू शकते हे ठरवते. एका बाजूला सब्स्ट्रेटच्या तीन परिस्थिती, तर दुसऱ्या बाजूला NADH-संबंधित जोड्या होत्या. NADH चा पुरवठा आणि झिल्ली विभव मिळून रंगद्रव्याचे अपचयन किती वेगाने होते आणि ते कुठे वितरित होते हे ठरवतात. ऑक्सिडित सायटोक्रोम c च्या शेजारी अपचयित रंगद्रव्य लागणारा मार्ग या निवडीवर अवलंबून असतो.

वळसा घालण्याचा पुढचा दावा कसा वाचावा

कोणता कॉम्प्लेक्स अवरोधित केला होता, कोणत्या अवरोधकाने, कोणत्या स्थळावर आणि किती मात्रेत, हे विचारा. रंगद्रव्याची सांद्रता आणि मोजमाप कधी घेतले होते ते विचारा. ऊतक, प्रजाती, विलगीकरणाची पद्धत, प्रथिनांची सांद्रता आणि सब्स्ट्रेट यांविषयी विचारा. तसेच विभव, श्वसन, रेडॉक्स अवस्था आणि थेट हस्तांतरणाची चाचणी एकमेकांशी जुळतात का हे विचारा, कारण इथे केवळ ऑक्सिजन वापराने एकापेक्षा अधिक वेळा चुकीची दिशा दाखवली.

मर्यादित सारांश हाच आहे. रंगद्रव्य कॉम्प्लेक्स I ला वळसा घालते यावर सहमती आहे. कॉम्प्लेक्स III बाबत, अँटिमायसिन 1 microgram per ml आणि रंगद्रव्य 1 micromolar असलेल्या उंदरांच्या मायटोकॉन्ड्रियात कार्यात्मक वळसा दिसत नाही. तर अँटिमायसिन 0.3 micromolar किंवा मिक्सोथायाझोल 1 micromolar आणि रंगद्रव्य 2 micromolar असलेल्या तीन प्रजातींमध्ये, रंगद्रव्याकडून सायटोक्रोम c कडे थेट हस्तांतरणासह अंशतः वळसा दिसतो. ही दोन्ही विधाने एकाच वेळी खरी असू शकतात. यापेक्षा व्यापक काहीही म्हणणे म्हणजे निष्कर्ष उपलब्ध पुराव्याच्या पलीकडे नेणे.

संबंधित वाचन या विवादित दाव्याला निर्विवाद रसायनशास्त्राच्या चौकटीत ठेवते: इलेक्ट्रॉनच्या टप्प्याटप्प्याने हस्तांतरणासाठी मेथिलीन ब्लू इलेक्ट्रॉन कसे वाहून नेते, साखळीच्या आधीच्या भागातील सहमती असलेल्या प्रकरणासाठी कॉम्प्लेक्स I ला वळसा घालण्याचे प्रयोग, दोन रंगद्रव्यांची गरज का होती हे समजण्यासाठी झिल्ली विभवाची मोजमापे आणि त्यांतील कृत्रिम परिणाम, आणि मात्रा व वेळेतील अडचणी समजण्यासाठी रेडॉक्स चक्रात भाग घेणाऱ्या पदार्थांची प्रयोगशाळेतील हाताळणी.