अँटिऑक्सिडंट आणि प्रो-ऑक्सिडंट म्हणून मेथिलीन ब्लू: परिणाम कशामुळे बदलतो?

समजा, दोन प्रयोगशाळा त्याच निळ्या रंगद्रव्याची चाचणी करतात आणि परस्परविरोधी निष्कर्ष नोंदवतात. पहिल्या प्रयोगशाळेत, मेंदूपासून विलग केलेल्या माइटोकॉन्ड्रियांचे श्वसन अधिक चांगले होते आणि ते अधिक ATP तयार करतात. दुसऱ्या प्रयोगशाळेत, त्याच प्रकारचा नमुना खूप अधिक हायड्रोजन पेरॉक्साइड सोडतो. दोन्ही अहवाल बरोबर आहेत. ते एकाच चक्राचे दोन टोकांकडून दिसणारे वर्णन करतात; वाचक एका टोकालाच संपूर्ण चित्र मानतात तेव्हा गोंधळ सुरू होतो.

या रेणूला कोणते लेबल लागू होते असा प्रश्न विचारणे हीच चूक आहे. मेथिलीन ब्लू इलेक्ट्रॉनच्या हस्तांतरणातील मध्यस्थ आहे; त्याच्या पेशीजीवशास्त्रीय लक्ष्यांचा नकाशा हे अधिक व्यापक संदर्भात दाखवतो. ऑक्सिडीकृत रंगद्रव्य इलेक्ट्रॉन स्वीकारते आणि रंगहीन leucoMB बनते. LeucoMB ते इलेक्ट्रॉन पुढे देते आणि पुन्हा निळे होते. इलेक्ट्रॉन कोण देते, कोण स्वीकारते आणि वाटेत तयार होणारे हायड्रोजन पेरॉक्साइड ती प्रणाली काढून टाकू शकते का, यावर तुम्हाला दिसणारा परिणाम अवलंबून असतो. रंगद्रव्य अँटिऑक्सिडंट आहे का, हा विचारण्याजोगा प्रश्नच नाही. दिलेली परिस्थिती या मध्यस्थाला काय करू देते, हा खरा प्रश्न आहे.

दोन्ही रूपे निर्माण करणारे चक्र

अंधारात मुख्य चक्र लहान असते. NADH, NADPH किंवा श्वसन साखळीतील वाहक रंगद्रव्याचे अपचयन करतात. त्यानंतर अपचयित रंगद्रव्यापुढे परस्परस्पर्धी मार्ग असतात. ते सायटोक्रोम c ला इलेक्ट्रॉन देऊ शकते आणि खराब झालेल्या कॉम्प्लेक्सला वळसा घालून इलेक्ट्रॉनचा प्रवाह चालू ठेवू शकते. म्हणूनच कॉम्प्लेक्स I किंवा III अवरोधित असताना श्वसन आणि झिल्ली विभव काही अंशी पूर्ववत होतात. किंवा ते थेट ऑक्सिजनला इलेक्ट्रॉन देऊ शकते; त्यामुळे निळे रूप पुन्हा तयार होते आणि हायड्रोजन पेरॉक्साइड निर्माण होते. रंगद्रव्य पुन्हा तयार होत असल्याने, त्याचे अगदी थोडे प्रमाणही हे चक्र अनेकदा चालवू शकते, सातत्याने अपचयन समतुल्ये खर्च करत आणि पेरॉक्साइड तयार करत राहू शकते.

आणखी दोन शाखा हे रसायनशास्त्र पूर्णपणे बदलतात. मुक्त तांबे किंवा लोह फेंटन प्रकारच्या अभिक्रियांद्वारे त्या विसरणशील पेरॉक्साइडचे अधिक विध्वंसक स्थानिक ऑक्सिडंटमध्ये रूपांतर करतात. लाल प्रकाशामुळे एक स्वतंत्र प्रकाशरासायनिक शाखा सुरू होते. त्यात उत्तेजित रंगद्रव्य ऑक्सिजनला ऊर्जा देते आणि सिंग्लेट ऑक्सिजन तयार करते. या रासायनिक प्रकाराची सविस्तर माहिती प्रकार I आणि प्रकार II प्रकाशरसायनशास्त्राच्या स्पष्टीकरणात दिली आहे. अंधारातील रेडॉक्स चक्रण, धातूंमुळे वाढलेली हानी आणि प्रकाशगतिक हानी या तीन वेगवेगळ्या यंत्रणा आहेत; त्यांचा प्रारंभिक रेणू मात्र एकच आहे.

परिस्थिती आणि परिणाम यांचा तक्ता

खालील तक्ता जपून ठेवण्यासारखा आहे. प्रत्येक ओळीत एक चल, त्याने परिणामाला मिळणारी दिशा आणि त्यामागील प्रयोग दिला आहे. सकारात्मक म्हणजे संरक्षण दर्शवणारे किंवा सुधारलेले मोजमाप. प्रतिकूल म्हणजे अधिक ऑक्सिडंट, अधिक घट किंवा अधिक हानी.

या ओळींमधून दिसणारा नमुना हाच मुख्य मुद्दा आहे. पेरॉक्साइड निर्मिती आणि जैविक संरक्षण हे स्वतंत्र अक्ष आहेत. एकाच वेळी एखाद्या उपचाराचा परिणाम पहिल्या अक्षावर प्रतिकूल आणि दुसऱ्यावर सकारात्मक असू शकतो.

एकाच मात्रेतून वेगवेगळी उत्तरे का मिळतात

सांद्रता इलेक्ट्रॉन वाहतुकीची क्षमता ठरवते, अंतिम परिणाम नाही. अखंड मेंदू माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात 50 nM पासून पुढे पेरॉक्साइडच्या उत्सर्जनात मोजता येण्याजोगी वाढ झाली, तर अंधारात स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रियल DNA हानीसाठी 100 uM आवश्यक होते. पहिला संकेत आणि जनुकविषारी हानी यांमध्ये साधारण दोन हजार पट अंतर आहे, पण ते सुरक्षिततेचे अंतर नाही. अंतिम मोजमापे, कोशिकीय कप्पे आणि संपर्काचा कालावधी वेगळे आहेत. त्यामुळे हे आकडे एकाच वक्रावरील बिंदू न दर्शवता वेगवेगळ्या घटना दर्शवतात. मात्रा-प्रतिसादावरील चर्चा कमी पातळीवरील संकेत आणि उच्च पातळीवरील हानी यांतील अशा अंतराला हॉर्मेसिसच्या व्यापक संदर्भात ठेवते.

इलेक्ट्रॉन कुठून प्रवेश करतात हे सब्स्ट्रेट ठरवते. NADH-संलग्न इंधने रंगद्रव्याला भरपूर अपचयन समतुल्ये देतात—उपयुक्त पर्यायी मार्गासाठीही आणि वाया जाणाऱ्या ऑक्सिजन अभिक्रियेसाठीही. सक्सिनेटमुळे रंगद्रव्य अँटिऑक्सिडंट होते, तर ग्लुटामेटमुळे ते प्रो-ऑक्सिडंट होते, हा वारंवार उद्धृत होणारा सारांश उपलब्ध डेटाचा अतिअर्थ लावतो. कारण हृदयावरील अभ्यासातील सक्सिनेट-पेरॉक्साइड परिस्थितीत रोटेनोनही होते, तसेच प्रत्येक सब्स्ट्रेट आणि श्वसनस्थितीत पेरॉक्साइड वाढल्याचे आढळलेल्या मेंदूवरील अभ्यासापेक्षा वेगळे ऊतक आणि वेगळी मात्रा वापरली होती.

प्रकाश केवळ परिणामाचे प्रमाण बदलत नाही, तर यंत्रणाच बदलतो. या संचातील सर्वात स्पष्ट विरोधाभास म्हणजे अंधारात 20 uM मुळे माइटोकॉन्ड्रियल DNA तुकड्यांमध्ये मोजता येण्याजोगा कोणताही बदल न होणे, आणि लाल प्रकाशात 20 uM मुळे त्या सर्वांना हानी होणे. प्रकाशात केलेल्या प्रयोगाची अंधारातील प्रयोगाशी तुलना करणारी व्यक्ती प्रत्यक्षात प्रकाशरसायनशास्त्राची रेडॉक्स चक्रणाशी तुलना करत असते.

धातू ऑक्सिडंटचे रूपांतर करतात. धातू नसताना रंगद्रव्याचे अंधारातील चक्र पेरॉक्साइड तयार करते. हा विसरणशील रेणू पेशी संकेत म्हणूनही वापरतात. उपलब्ध तांबे किंवा लोह असताना, NADH मुळे अपचयित झालेले रंगद्रव्य धातूच्या अपचयनाला चालना देते. त्यानंतर अपचयित धातू DNA जवळ पेरॉक्साइडचे हायड्रॉक्सिल प्रकारच्या किंवा तांबे-पेरॉक्साइड रासायनिक प्रकारांत सक्रिय रूपांतर करते. अशाच प्रकारे NADH आणि धातू आयनांसह केलेल्या पेशीविरहित अभ्यासात एकाच प्रारंभिक रंगद्रव्यापासून हॉटस्पॉटवर निवडक आणि व्यापक DNA हानी निर्माण झाली. ही शाखा महत्त्वाची ठरते का, हे केवळ रंगद्रव्य नव्हे, तर त्या कोशिकीय कप्प्यात धातू कसे हाताळले जातात यावर ठरते.

पेशीला हा खर्च पेलता येईल का, हे इंधनाची स्थिती ठरवते. 2 ते 20 uM रंगद्रव्याच्या संपर्कात आणलेल्या एंडोथेलियल पेशींमध्ये, ग्लुकोज काढून टाकल्यावर ऑक्सिडंटचा खर्च उघड झाला, तर ग्लुकोजचा पुरवठा केल्यावर तो नाहीसा झाला; ग्लुकोजमुळे रंगद्रव्याचे अपचयनही वेगवान झाले होते. पुरेसा आधार असलेल्या संरक्षणासह वेगवान चक्रण हे रिकाम्या संरक्षणसाठ्यांसह संथ चक्रणापेक्षा चांगले ठरते. ग्लुकोज किंवा NADPH ची स्थिती न सांगणारा कोणताही ऑक्सिडंटविषयक दावा अपूर्ण समजा.

ऊतक उपलब्ध यंत्रणा ठरवते. एंडोथेलियल पेशी ग्लुकोजच्या चयापचयातून NADPH पुन्हा तयार करतात आणि त्यांच्याकडे साइटोसोलमधील अँटिऑक्सिडंट साठे असतात. विलग माइटोकॉन्ड्रियाकडे यापैकी काहीच नसते. शुद्ध केलेल्या DNA कडे दुरुस्तीची यंत्रणाही नसते. एका प्रकारच्या नमुन्यातील परिणाम इतरांबद्दल फारसा अंदाज देत नाही. म्हणूनच ऊतकविशिष्ट प्रतिसादांवरील नियोजित लेखात या प्रणाली वेगळ्या ठेवाव्या लागतील.

थेट मोजमाप म्हणजे नंतर सक्रिय होणारे संरक्षण नव्हे

प्रयोग ज्या दोन पातळ्या वेगळ्या ठेवतात, त्या अनेक लेखनांत एकत्र केल्या जातात. एका पातळीवरील प्रश्न असतो: किती ऑक्सिडंट तयार झाले? दुसऱ्या पातळीवरील प्रश्न असतो: पेशीने त्याला कसा प्रतिसाद दिला?

Amplex प्रकारच्या पेरॉक्साइड चाचण्या पहिल्या पातळीच्या सर्वात जवळ असतात. तरीही त्या निव्वळ प्रवाह नोंदवतात, म्हणजे निर्मिती वजा विघटन वजा बाहेर जाणारे प्रमाण. मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात दोन्ही बाजूंना बदल दिसला: अधिक पेरॉक्साइड तयार झाले आणि बाहेरून एकाच वेळी घातलेले पेरॉक्साइड अधिक संथपणे काढून टाकले गेले. पुढील टप्प्यांवर ग्लुटाथायोनचे ऑक्सिडीकरण, अॅस्कॉर्बेटचा वापर, ऑक्सिडीकृत ग्वानिन आणि पॉलिमरेजला अडवणाऱ्या DNA विकृती येतात. प्रत्येक टप्पा ऑक्सिडंट आणि मोजमाप यांच्यामध्ये आणखी जैविक प्रक्रिया जोडतो.

Nrf2-प्रेरित अँटिऑक्सिडंट एन्झाइम्स आणि माइटोकॉन्ड्रियांची जैवनिर्मिती दुसऱ्या पातळीवर येतात. हे अनुकूलनात्मक कार्यक्रम आहेत, जे पेरॉक्साइडचा सौम्य झटका सुरू करू शकतो. मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियांच्या संरक्षणावरील अभ्यासाचे लेखक नेमका हाच सौम्य ताण प्रेरक असल्याचे सुचवतात. मात्र Nrf2 मार्फत होणारी कारणसाखळी त्यांच्या स्वतःच्या पूर्ण प्रात्यक्षिकाऐवजी आधीच्या संशोधनावर आधारलेली असल्याचेही ते नमूद करतात. नव्या प्रथिनांमुळे काही तासांनी मिळणारे संरक्षण याचा अर्थ प्रारंभिक रसायनशास्त्र अँटिऑक्सिडंट होते असा नाही. त्याचा अर्थ एका लहान प्रो-ऑक्सिडंट घटनेने अधिक मोठे संरक्षण मिळवून दिले. चाचण्यांच्या मर्यादा आणि नमुन्यांतील फरक यांसह अशा दाव्यांचे वाचन करताना पाळायची खबरदारी हा मेथिलीन ब्लू संशोधन वाचण्याच्या मार्गदर्शकाचा विषय आहे.

चाचण्यांचे निष्कर्ष एकमेकांशी का जुळत नाहीत

डायहायड्रोफ्लुओरेसीनसारखा सर्वसाधारण प्रोब पेरॉक्साइडची सांद्रता नोंदवत नाही, तर प्रोबचे व्यापक ऑक्सिडीकरण नोंदवतो. ते पेरॉक्सिडेज आणि हीमच्या रसायनशास्त्रावर अवलंबून असते आणि अंशांकित Amplex चाचणीला सापडणारी पेरॉक्साइडची वाढ त्याला न सापडू शकते. मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात पेरॉक्साइडमध्ये तीव्र वाढ दिसली, पण त्याला अनुरूप सुपरऑक्साइड संकेत दिसला नाही. कोणत्याही एका रंगद्रव्याधारित अँटिऑक्सिडंट दाव्याला उद्धृत करण्याबाबत ही सावधगिरीची खूण आहे. रंगद्रव्य सामान्य उत्तेजन आणि उत्सर्जन पट्ट्यांच्या जवळ दृश्यमान प्रकाश शोषते, त्यामुळे प्रकाशीय आच्छादनासाठी नियंत्रण चाचणी करणे रास्त आहे. मात्र त्या काटेकोर अभ्यासात ज्ञात पेरॉक्साइडच्या आधारे अंशांकन केले, संकेत फारसा न बदलता उत्तेजनप्रकाशाचा संपर्क कमी केला आणि स्वतंत्र इलेक्ट्रोडने पेरॉक्साइड अधिक संथपणे काढून टाकले जात असल्याची खात्री केली. हस्तक्षेप तपासण्यासाठी नियंत्रण चाचणी करायची असते; तो निष्कर्ष आपोआप फेटाळण्याचे कारण नसतो.

कॅल्शियमचा परिणामही अचूकपणाची हीच गरज दाखवतो. हृदयावरील अभ्यासात रंगद्रव्याच्या तात्काळ संपर्काने पारगम्यता संक्रमणापूर्वीचा एकूण कॅल्शियम भार बदलला नाही. तरी मधुमेहावर केंद्रित हृदयाच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात अवरोधित मेंदू माइटोकॉन्ड्रियामधील कॅल्शियम ग्रहणाचा दर सुधारला. वेगवेगळी अंतिम मोजमापे, वेगवेगळ्या प्रणाली—विरोधाभास नाही.

निष्कर्षावर विश्वास ठेवण्यापूर्वीची तपासणी यादी

प्रत्येक अँटिऑक्सिडंट किंवा प्रो-ऑक्सिडंट निष्कर्ष हा एका प्रणालीवरील अहवाल म्हणून घ्या आणि पाच प्रश्न विचारा. कोणत्या सांद्रतेवर आणि कोणत्या कोशिकीय कप्प्यात? कोणता इलेक्ट्रॉनदाता आणि कोणता स्पर्धक स्वीकारक वापरून? प्रकाशात की अंधारात, आणि कोणत्या तरंगलांबीवर व मात्रेत? कोणते धातू उपलब्ध होते, आणि इंधन व अँटिऑक्सिडंट साठ्यांना किती आधार होता? तसेच कोणत्या चाचणीने मोजले—ऑक्सिडंटचा प्रवाह, हानी की अनुकूलनात्मक प्रतिसाद? यांपैकी कोणतेही एक उत्तर बदला, आणि कोणताही विरोधाभास न होता तोच रेणू या तक्त्यात संरक्षणात्मक परिणामाकडून हानिकारक परिणामाकडे जाऊ शकतो.