Метилений хөхөөр DNA будах: агарозын гель ба мембран дээрх RNA будалт

Оюутан агарозын гельд электрофорез явуулж, метилений хөхөөр будахад тод зурвас харагдах ёстой газарт юу ч харагдсангүй. Хажуугийн ажлын хэсэгт докторын дараах судлаач мөнөөх хөх будагтай савнаас авч Northern мембраныг будаад гурван минутын дотор рибосомын тод зурвасууд гаргаж авав. Оюутан гельд хийсэн туршилтаа бүтэлгүйтсэн гэж дүгнэв. Гэвч гельд хийсэн туршилт бүтэлгүйтээгүй. Энэ хоёр ажлын зорилго өөр байсан бөгөөд нэг будаг тэдгээрт өөр өөр мэдрэмж, өөр өөр дэвсгэр будалт, дараагийн ажиллагааны өөр өөр дүрмээр хариу өгдөг.

Метилений хөхөөр DNA болон RNA будах нь ижил химийн үндэстэй ч зорилго нь адилгүй. Гель дотор будаг нь сүвэрхэг матрицад хэр их нуклейн хүчил байгааг харуулдаг. Мембран дээр шилжүүлэлт амжилттай болсон эсэх, замуудад дээжийг жигд ачаалсан эсэхийг харуулдаг. Энэ ялгааг ойлгосноор протокол, илрүүлэх хязгаар, нийцтэй байдлын хязгаар тодорхой болно.

Товч хариулт

Метилений хөх нь хавтгай бүтэцтэй катион будаг бөгөөд фосфаттай электростатик таталцах, суурийн хосуудын завсар шурган орох, жижиг ховилтой холбогдох үйлчлэлийн хослолоор нуклейн хүчилтэй ковалент бус, буцах боломжтой байдлаар холбогддог. Чухал нь энэ холбоо буцах боломжтойд оршино. Зурвасуудыг будаж, үзэгдэх гэрлээр харж, баримтжуулсны дараа клонжуулалт, гибридизаци эсвэл дахин зондлохын өмнө будгийг арилгах буюу цэвэрлэж болно.

Хоёр гинжит DNA-г агарозын гельд метилений хөхөөр будах стандарт хурдан найрлага нь усан дахь 0.02 хувь w/v буюу mL тутамд 200 микрограмм будаг юм. Ойролцоогоор 15 минут будаж, дараа нь усанд ойролцоогоор 15 минут будгийг арилгаад цагаан гэрлийн хайрцаг дээр харна. Мембраны хувьд Northern блотын сонгодог найрлага нь pH 5.2 орчим натрийн ацетат дахь 0.02–0.04 хувь будаг юм. Шилжүүлж, хөдөлгөөнгүй болгосны дараа хэдэн минут будаж, усаар зайлж, гибридизацийн өмнө будгийг бүрэн арилгана. Мэдрэмж нь хязгаарлагдмал: сайн нөхцөлд гелийн нэг зурваст хэдэн арваас хэдэн зуун нанограмм, харин болгоомжтой үнэлсэн гарын авлагуудад 0.5–1 микрограмм гэж заадаг. Энэ нь этидийн бромид болон SYBR будгийн илрүүлэх хэмжээнээс хэдэн эрэмбээр их юм. Мембран дээр будаг нь голчлон их хэмжээгээр агуулагдах рибосомын RNA болон нийт ачаалсан материалыг харуулдаг тул нэг тодорхой транскриптийн хувьд хэрэгтэй илрүүлэх хязгаар гэж байхгүй. Аль ч найрлагад жижиглэн худалдаалдаг нэмэлт бүтээгдэхүүний уусмалыг орлуулан хэрэглэж болохгүй. Баталгаажсан аргууд нь аналитик зэрэглэлийн будаг, тодорхой найрлагатай буфер, RNA-тай ажиллах үед RNase-гүй нөхцөлд ажиллахыг шаарддаг.

Холбогдох механизм ба төөрөгдүүлж болох зүйлс

Хэрэгтэй загвар нь гурван хэсэгтэй. Нэгдүгээрт, эерэг цэнэгтэй цагирагт бүтэц нь сөрөг цэнэгтэй фосфатын үндсэн хэлхээнд татагддаг. Метилений хөхийн DNA-тай холбогдохыг судалсан спектроскопийн судалгаанд нэгтгэн тайлбарласнаар давсны агууламж бага үед электростатик үйлчлэл давамгайлдаг болохыг спектроскопийн судалгаа харуулдаг бол загварчлал болон молекулын динамикийн судалгаанд хоёр гинжит DNA-д завсар шурган орох, жижиг ховилтой холбогдох нь тогтвортой хэлбэрүүд хэвээр байдаг. Хоёрдугаарт, GC-д тодорхой хэмжээгээр илүү холбогдох хандлага бий. Загварчлалд CpG ба GpC дараалсан хосуудыг илүүд үздэг бол метилений хөхийн завсар шурган орох сонгомол байдлын судалгаанд GC-ээр баялаг хоёр гинжит бүтэцтэй илүү холбогдохыг туршилтаар мэдээлсэн. Гэхдээ AT-тай хоёр гинжит бүтэцтэй ч холбогдоно. Ердийн будалт нь тодорхой дараалалд сонгомол биш. Гуравдугаарт, нэг гинжит DNA болон RNA нь голчлон электростатик үйлчлэлээр, мөн хүртээмжтэй сууриуд болон хоёр гинжит хэсгүүдтэй давхарлан харилцан үйлчлэх замаар холбогддог. Иймээс будалтын эрчим нь урт, дараалал, хоёрдогч бүтцээс хамаарч өөрчлөгдөнө.

Үүнээс хоёр үр дагавар гарна. Холбоо нь ковалент бус учир будаг угаагдаж арилдаг. Зориудаар бэхжүүлээгүй бол полиакриламидын зурвасууд хурдан бүдгэрнэ. Ердийн будалт түр зуурынх байдаг учраас байнгын бэхжүүлэлтэд зориулсан тусгай хувилбар бий. Үүнийг Soto ба Draper-ийн PAGE гелийн тухай өгүүлэлд тайлбарласан. Будаг нь фотосенсибилизатор учраас хүчилтөрөгчийн орчинд будсан DNA-г тод гэрлээр удаан照луулах нь гуаниныг исэлдүүлж, улмаар гинжид тасралт үүсгэж болно. Энэ механизмыг метилений хөхөөр мэдрэгжүүлсэн гуанины исэлдэлтийн судалгаанд дэлгэрэнгүй тайлбарласан. Цагаан гэрлээр богино хугацаанд харах нь этидийн бромидын сонгодог аргачлалын сайн мэддэг UV гэмтлээс зайлсхийдэг бөгөөд бэлтгэл зорилгоор DNA ялган авахад энэ нь бодит давуу тал юм. Үзэгдэх гэрэл илүү зөөлөн ч хоргүй гэсэн үг биш. DNA-г клонжуулах бол гэрэлтүүлэх хугацааг богино байлга. Энэ анхааруулгын цаадах фотохимийн өргөн хүрээний тайлбарыг метилений хөхийн фотохимийн хоёр замаас үзнэ үү. Исэлдсэн хэлбэр нь яагаад холбогдож, ангижирсан хэлбэр нь яагаад холбогддоггүйг тайлбарлах исэлдэн ангижрах хос болон цэнэгийн төлөвүүдийн талаар метилений хөхийн бүтэц, шинж чанарын химийн тайлбараас үзнэ үү.

Нэгдүгээр ажил: гель дотор будах

Гелийн будалт нэг асуултад хариулна: энэ зурваст нүдээр харахад хүрэлцэх хэмжээний нуклейн хүчил байна уу? Агароз дахь хоёр гинжит DNA нь хамгийн сайн судлагдсан тохиолдол юм. Flores болон хамтран ажиллагчдын метилений хөхөөр гель будах анхны арга нь 1 хувь агароз дээр 0.02 хувийн хурдан протоколыг баталгаажуулж, дараа нь DNA-г амжилттай ялган авч клонжуулсныг харуулсан. Нийлүүлэгчийн мөн адил протоколыг IBI Scientific-ийн метилений хөхийн бүтээгдэхүүний хуудсанд нийтэлсэн бөгөөд тэнд мембраны 0.04 хувийн найрлага болон гелийн хурдан хувилбарыг зэрэгцүүлэн өгсөн.

Практик ажлын дараалал:

Гельд электрофорезийг ердийн байдлаар явуул. Өөрчилсөн аргын шилжүүлэлт эсвэл ялгах чадварыг баталгаажуулаагүй бол электрофорезийн үеэр биш, дараа нь буд.
Нэрмэл усан дахь 0.02 хувь w/v метилений хөхөд дүрж, зөөлөн хөдөлгөж ойролцоогоор 15 минут буд.
Усыг хэд хэдэн удаа сольж, нийт ойролцоогоор 15 минут будгийг арилга. Матрицын дэвсгэр өнгө буурч, зурвасууд ялгарах хүртэл үргэлжлүүл.
Цагаан гэрлийн гэрэлтүүлэгч дээр даруй зураг ав.

Агароз ба полиакриламид өөр өөр шинжтэй. Агарозын матриц будаг барьдаг тул будгийг арилгах нь удаан үе шат болдог. Нимгэн полиакриламидын гель хурдан будагддаг ч будгаа мөн хурдан алддаг. Энэ нь бэлтгэл зорилгоор зурвасыг огтлон авахад тустай боловч архивын баримтжуулалтад сул талтай. Тогтсон Current Protocols төрлийн PAGE аргуудын дагуу полиакриламид дахь нийлэг олигонуклеотидыг мөн адил 0.02 хувийн найрлагаар, усаар давтан угааж, 20–30 минутын дотор байрлалыг нь тогтоож болно. Шингэрүүлсэн TBE дэх ойролцоогоор 0.0002 хувийн маш сул хувилбарыг бэлтгэл зорилгоор олигонуклеотид ялгахад хэдэн цагийн турш хэрэглэсэн тухай мэдээлэл бий. Гэхдээ нотолгооны суурь нь сул.

DNA ба RNA-ийн ялгаа чухал. Хоёр гинжит DNA нь хамгийн хүчтэй, бүтэцтэй холбоог үүсгэдэг. RNA болон нэг гинжит DNA будагддаг ч сул, урьдчилан таамаглахад хүндрэлтэй байдаг. Формальдегид агуулсан агарозын RNA гелийн хувьд ихэнх лаборатори гель дотор хөхөөр будахаас зайлсхийж, RNA-г эхлээд мембран руу шилжүүлээд тэнд нь буддаг. Ингэснээр гелийн сул дохиог илүү тод мембраны дохио болон ачаалалтын баримтаар сольж байна.

Хоёрдугаар ажил: мембран дээр будах

Мембраны будалт өөр асуултад хариулна: шилжүүлэлт амжилттай болсон уу, замуудыг хооронд нь харьцуулж болох уу? Сонгодог хэрэглээ нь Herrin ба Schmidt-ийн будгийг нь арилгаж болдог Northern блотын будалт юм. Анх pH 5.0 бүхий 50 mM натрийн ацетат дахь 0.04 хувийн будгаар 2–3 минут будаж, усаар зайлдаг байсан. Гибридизацийн өмнө SSPE дэх шингэрүүлсэн SDS-ээр будгийг арилгаж болдог.

Өнөө үед өргөн хэрэглэдэг хувилбарын дараалал:

RNA эсвэл денатурацид оруулсан DNA-г нейлон буюу нитроцеллюлоз руу шилжүүл. Дараа нь будалтын үеэр дээж алдагдахгүй байхаар UV-ээр хөндлөн холбоос үүсгэх эсвэл халаах аргаар хөдөлгөөнгүй болго.
Заавал биш боловч түгээмэл алхам: мембраныг 5 хувийн цууны хүчилд ойролцоогоор 15 минут норго.
pH 5.2 орчим, 0.3–0.5 M натрийн ацетат дахь 0.02–0.04 хувийн метилений хөхөөр 5–10 минут буд.
Усаар зайлж, 5–15 минут будгийг арилгаад баримтжуул. Дараа нь гибридизацийн өмнө үлдэгдэл будгийг арилга.

Northern ажилд эерэг цэнэгтэй нейлон давамгай хэрэглэгддэг. Нитроцеллюлоз ч мөн цууны хүчил, ацетат ашигласан ижил дарааллаар тохиромжтой. Зургийг шилжүүлэлтийг батлах, 28S ба 18S зурвасуудыг харьцуулах (эсвэл бактерийн RNA-д 23S ба 16S), шаталсан маркер болон стандартуудыг тэмдэглэх, нийт RNA-ийн нормчиллын ойролцоох баримт хадгалахад ашигладаг. Нийтлэгдсэн Northern аргууд ачаалалтыг шалгахын тулд будсан рибосомын зурвасуудыг тоон аргаар үнэлдэг. Үүнд метилений хөхөөр будсан рибосомын зурвасуудыг нормчилолд ашигласан сүүний шинжлэх ухааны судалгаа багтана. Southern мембраныг мөн адил аргаар харагдуулж болно. Гэхдээ энэ будаг Northern-ийн ачаалалт, шилжүүлэлтийг шалгахад хавьгүй илүү тогтсон хэрэглээтэй. Мөн Southern-ийн DNA-г шилжүүлэхээс өмнө денатурацид оруулдаг тул гелийн мэдрэмжийн тоон үзүүлэлтүүдийг шууд хамааруулж болохгүй.

Гелийн будалт ба мембраны будалтыг зэрэгцүүлэн харьцуулсан ажлын дарааллын бүдүүвч. Гелийн замд электрофорез явуулах, будах, будгийг арилгах, цагаан гэрлээр зураг авахыг харуулсан. Мембраны замд шилжүүлэх, хөдөлгөөнгүй болгох, будах, баримтжуулах, будгийг арилгах, дараа нь гибридизаци хийхийг харуулсан. Зам бүрд илрүүлэх хязгаар болон буцах боломжтой байдлын тайлбар бий.

Илрүүлэх хязгаар ба дэвсгэр будалт: хөх будаг хаана дутдаг вэ?

Доорх харьцуулалтыг зориуд ойролцоогоор өгсөн. Будгийн үзүүлэлт нь гелийн хувь, зурвасын өргөн, оптик төхөөрөмж, будгийг арилгах ажиллагааны нягт нямбай байдлаас хамаардаг. Тоо бүрийг техникийн баталгаат үзүүлэлт бус, хэмжээсийн эрэмбийн баримжаа гэж үз.

Будаг ба хэрэглээний хэлбэр	Нэг зурвас дахь ойролцоо илрүүлэх хэмжээ	Тайлбар
Метилений хөх, агароз дахь dsDNA	Оновчтой нөхцөлд 40–250 ng; болгоомжтой үнэлгээгээр 0.5–1 микрограмм	Бэлтгэл зорилгын ачаалалт болон сургалтын гельд хангалттай. Маш бага хэмжээтэй зурваст сул.
Метилений хөх, PAGE дахь богино ssDNA, RNA эсвэл олигонуклеотид	Ойролцоогоор 0.1–0.5 микрограмм	Урт, бүтцээс хамаарна. Бүх тохиолдолд тохирох хязгаар байхгүй.
Этидийн бромид, dsDNA агароз	Ойролцоогоор 1–10 ng	Flores-ийн харьцуулалтад оновчтой хөх будалтаас ойролцоогоор дөрөв дахин мэдрэмтгий. UV шаардлагатай.
SYBR Green I, dsDNA	Ойролцоогоор 60 pg	Флуоресценцийн дүрслэл шаардлагатай.
SYBR Gold, DNA ба RNA	Ойролцоогоор 25 pg	Хэд хэдэн хэлбэрт этидийн бромидоос арав гаруй дахин мэдрэмтгий.
Мөнгөн будалт, PAGE дахь нуклейн хүчил	Ойролцоогоор 0.3–0.9 ng; оновчтой хөх будалтын дараах мөнгөн будалтын дараалалд 100 pg RNA илрүүлсэн гэж мэдээлсэн	Маш мэдрэмтгий боловч химийн ажиллагаа төвөгтэй, ялган авахад тохиромж муутай.
Толуидины хөх, PAGE дахь RNA ба олигонуклеотид	Хэдэн зуун ng хэмжээтэй дээжид хэрэглэдэг, ойролцоогоор 250 ng-ыг баримтжуулсан	Метилений хөхтэй адил үзэгдэх гэрлээр хардаг ч SYBR-ийн үзүүлэлттэй харьцуулах стандартчилсан хязгаар байхгүй.

Хязгаарлагдмал дохиог ашиглаж болох эсэхийг дэвсгэр будалтын хяналт шийднэ. Чөлөөт будаг хүчтэй өнгөтэй тул холбогдсон будгийг салгахгүйгээр холбогдоогүй будгийг арилгахад ялгарал бий болдог. Илүү өтгөн будаг мэдрэмжийг нэмэгдүүлэх нь ховор. Голчлон будгийг арилгах хугацааг л уртасгадаг. Яг ашиглах гель, мембран, камераараа шингэрүүлэлтийн цуврал туршиж, нийлбэр оптик нягт нь оруулсан дээжийн хэмжээнд пропорциональ хэвээр байх мужийг л ашигла. Метилений хөх нь ачаалалтын хагас тоон нормчилолд тохирдог. Мембраны багтаамж, шилжүүлэлтийн үр ашиг, ханалт, будгийг арилгах байдал зам бүрд өөрчлөгддөг учраас энэ нь өргөн динамик мужтай тоон шинжилгээ биш.

Нийцтэй байдлын хязгаар: будсаны дараа юуг үргэлжлүүлж болох вэ?

Хөхөөр будсаны дараа клонжуулж болохыг харуулсан. Flores болон хамтран ажиллагчид будсан агарозын зурвасыг огтлон авч, DNA-г ялган, лигазын урвалд оруулж, трансформаци хийсэн. Тэд этидийн бромид болон UV ашигласны дараахтай харьцуулахад илүү сайн клонжуулалт гарсан гэж мэдээлсэн. Үүний магадлалтай шалтгаан нь будгийн өөрийн ашиг тус бус, гэрлийн гэмтэл бага байсанд оршино. Цагаан гэрэлд байлгах хугацааг богино байлгаж, ялган авсан DNA-г ердийн гелээс ялган авах цэвэршүүлэлтээр дамжуул.

PCR болон дараалал тогтоохтой холбоотой нотолгоо арай хомс. Үлдэгдэл будаг нуклейн хүчилтэй холбогддог тул ферментийн шатны өмнө будгийг арилгаж, цэвэршүүл. Хөхөөр будсан гелиэс зохих ёсоор цэвэршүүлсэн DNA ажиллах төлөвтэй боловч полимеразууд болон дараалал тогтоох янз бүрийн химийн системүүдэд шууд дамжсан будгийг хэр тэсвэрлэхийг сайн тоон үнэлгээгээр тогтоогоогүй. Таамгаар бүү үз.

Дарааллыг хатуу мөрдвөл блотын гибридизацитай нийцнэ: шилжүүлэх, хөдөлгөөнгүй болгох, будах, баримтжуулах, будгийг арилгах, гибридизаци хийх. Энэ нь Herrin ба Schmidt-ийн зохиосон дараалал юм. Шилжүүлэхээс өмнө будах эсвэл будгийг арилгахыг алгасах нь өөр арга бөгөөд тусдаа баталгаажуулалт шаарддаг. Будгийг арилгасны дараа зонд салгах болон дахин зондлох стандарт ажиллагааг ердийн байдлаар үргэлжлүүлнэ. Ижил бүлгийн будгаар эсийн түвшинд будах болон бэхжүүлсэн түрхцийн зарчмыг амьд эстэй ажиллах аргад яагаад шууд хэрэглэж болохгүй талаар микроскопийн будалтын атласаас үзнэ үү.

Байнгын бэхжүүлэлтийн хувилбарыг хэрэглээгүй бол бэлтгэл зорилгоор ашиглах агарозын зурвас болон хөхөөр байрлалыг нь тогтоосон PAGE олигонуклеотидын зурвасыг огтлон авч болно. Буцах боломжтой холбогчийн хувьд будгийг арилгасны дараа электроэлюци хийх нь химийн хувьд боломжтой боловч метилений хөхөд тусгайлан хамаарах, хяналттай гарцын өгөгдөл хомс. Элюцийн дараа давсыг арилгах эсвэл тунадасжуул.

Давтагддаг алдаанууд

Бүдэг гелийн зурвас нь ихэвчлэн өнгөөр илрүүлэх будалтад хангалтгүй масстай байгааг илтгэнэ. Ялангуяа богино нэг гинжит эсвэл RNA бай молекулын хувьд ийм байдаг. Илүү их дээж ачаалж, шинэ будаг хэрэглэж, концентрацийг нэмэхээс өмнө будалтын хугацааг уртасгаж, будгийг арилгахыг арай эрт зогсоо. Ялгаралгүй, бүхэлдээ хөх гель нь ихэвчлэн хэт будалт эсвэл усыг хангалттай олон солиогүйг илтгэнэ. PAGE зурвас бүдгэрэх нь будалт бүтэлгүйтсэн хэрэг биш, хүлээгдэж буй химийн үзэгдэл юм. Зургийг хурдан ав. Мембраны жигд бус дэвсгэр будалт нь нугалаа, бөмбөлөг, хурууны мөр, жигд бус хөдөлгөх эсвэл хэсэгчилсэн шилжүүлэлттэй холбоотой байж болно. Гибридизацийн хяналтгүйгээр үүнийг ачаалалт тэнцүү биш гэж бүү тайлбарла. Рибосомын бүдэг, сарнисан дүрс нь задралыг илтгэж болох ч дутуу шилжүүлэлт, нийт RNA хэт бага байх (ердийн замд хэдэн микрограммаас хэдэн арван микрограмм ачаалдаг), эсвэл будгийг хэт их арилгаснаас ч үүсэж болно. Будаг нь их хэмжээгээр агуулагдах рибосомын RNA-г харуулдаг. Тодорхой нэг транскриптийг харуулдаггүй. Тэр ажлыг зонд гүйцэтгэнэ.

Хэтрүүлэлгүйгээр аюулгүй байдал ба зөв харьцах нь

Метилений хөхтэй ажиллах нь этидийн бромидтой ажиллахаас хялбар боловч хоргүй биш. MilliporeSigma-ийн одоогийн аюулгүй байдлын мэдээллийн хуудас уг будгийг амаар орох үеийн хурц хордлогын 4-р ангилалд оруулж, залгивал хортой гэж үзсэн. Мөн Sigma-Aldrich-ийн метилений хөхийн SDS-д зааснаар зөвшөөрөгдсөн хаягдлын журмаар зайлуулах шаардлагатай. Этидийн бромидын генотоксик чанарын анхааруулга илүү хүчтэй бөгөөд Sigma-Aldrich-ийн этидийн бромидын SDS-д үржлийн эсэд нөлөөлж болзошгүй гэж дурдсан. Мөн Thermo Fisher-ийн нуклейн хүчил будах гарын авлагад тэмдэглэснээр түүний гель, уусмалыг ихэвчлэн аюултай химийн хаягдал болгон тусад нь ангилдаг. Аль алинд нь SDS болон байгууллагын дүрмийг мөрд. Хуурай будгийг сайтар таглаж, хуурай байлга. Ажлын будгийн уусмалыг зөвхөн протокол зөвшөөрсөн хэмжээнд дахин ашигла. Будсан мембраныг шүүлтүүрийн цааснуудын хооронд хуурай хадгалж, зурвасууд диффузээр сарнихаас өмнө гелийн зургийг ав.

Лабораторийн ажлын ширээний гол санааг санаарай. Гель нь их хэмжээний ачаалалтыг цагаан гэрлээр харж болох эсэхийг шалгана. Мембран нь зонд мэдрэмж өндөртэй ажлаа хийхээс өмнө шилжүүлэлт, ачаалалтыг шалгана. Нэг будаг хоёуланд нь үйлчилдэг ч мэдрэмж нь хязгаарлагдмал, холбоо нь буцах боломжтой, ажиллагааны дараалал нь хатуу байдаг.