Метилен хөхөөр хөрөнгийн мөөгөнцрийг шинжлэх: амьд эсийг тоолох ба амьсгалын хугацааг хэмжих

Лабораторийн ширээн дээр хоёр хуруу шил байна. Хоёулаа хөх өнгөтэй. Нэгд нь микроскопоор харагдах хөх эсүүд үхсэн хөрөнгийн мөөгөнцрийг илэрхийлнэ. Нөгөөд нь хөхөөс өнгөгүй болж буй хуруу шил хөрөнгийн мөөгөнцөр амьд, амьсгалж байгааг илтгэнэ. Ижил будаг боловч эсрэг утгатай үр дүн. Энэ хоёр сорилыг андуурвал бүх дүгнэлт эсрэгээрээ эргэнэ.

Энэ ялгаа бол нийтлэлийн гол сэдэв юм. Метилен хөх нь исэлдэн ангижрах будаг: исэлдсэн үедээ хөх, ангижирсан үедээ өнгөгүй лейкометилен хөх болдог. Амьдрах чадварын тооллого энэ химийн шинжийг микроскопоор богино хугацаанд ажиглахад ашигладаг. Амьсгалын туршилт үүнийг нийт уусмалд явагдах урвалын хугацааг хэмжихэд ашигладаг. Тус бүр өөрийн аргачлал, хяналт болон үр дүнд нь шүүмжлэлтэй хандах хандлага шаарддаг.

Амьдрах чадварын тооллого: богино хугацаанд будаж, даруй унших

Шар айраг үйлдвэрлэлд хэрэглэдэг аргачлал нь хамгийн сайн стандартчилагдсан хувилбар юм. 2% натрийн цитратад 0.01% w/v метилен хөх бэлтгээд, хөрөнгийн мөөгөнцрийн суспензтэй 1:1 харьцаагаар хольж, тогтоосон богино хугацааны дараа холимгийг шинжилнэ. Нийтлэгдсэн аргачлалуудын хугацаа нь Brewing Science Institute-ийн гарын авлагад 1–2 минут, судалгааны аргачлалуудад ойролцоогоор 5 минут байдаг бол OIV-ийн дарсны микробиологийн арга 10 минутын дотор шинжлэхийг шаарддаг. Тоолох холимог дахь будгийн эцсийн концентраци ойролцоогоор 0.005% болно. Сайжруулсан Neubauer тооллогын камерыг дүүргээд, ойролцоогоор 400x өсгөлтөөр бараан хөх эсүүдийг амьдрах чадваргүй, будагдаагүй эсүүдийг амьдрах чадвартай гэж ангилна. OIV-ийн аргаар цайвар хөх эсүүдийг амьд гэж тооцдог нь доор хэлэлцэх субъектив үнэлгээний асуудлыг аль хэдийн илтгэнэ.

Эсийн концентрацийг камерын геометрээс тооцоолно. Төвийн 1 mm талтай квадратыг бүхэлд нь тоолсон үед нэг mL дэх эсийн тоо нь N-ийг шингэрүүлэлтийн коэффициент болон 10^4-өөр үржүүлсэнтэй тэнцэнэ. Энд N нь тухайн талбайд тоолсон эсийн тоо бөгөөд үүнийг ASBC-ийн хөрөнгийн мөөгөнцрийн аргуудад тайлбарласан. Амьдрах чадварыг тооцоолох нь илүү энгийн: будагдаагүй эсийн тоог нийт эсийн тоонд хувааж, 100-аар үржүүлнэ. FEMS-ийн шар айраг үйлдвэрлэлийн харьцуулсан судалгаа болон OIV-ийн практикийн дагуу амьдрах чадварыг үнэлэхдээ ойролцоогоор 400 эс тоолно. Хилийн нэг дүрмийг тууштай мөрдөнө. Жишээлбэл, торны доод болон зүүн шугам дээрх эсүүдийг оруулж, дээд болон баруун шугам дээрхийг хасаж болно.

Тооллого эхлэхээс өмнө нахиаг хэрхэн тооцох дүрэмтэй байх шаардлагатай. Түгээмэл хэрэглэдэг дүрмээр нахиа эх эсийнхээ хэмжээний ойролцоогоор хагаст хүрсэн бол тусдаа эс гэж, түүнээс жижиг бол эх эстэй нь хамт нэг эс гэж тооцдог. Ямар ч дүрэм сонгосон, бүх квадратад адилхан хэрэглэж, дараагийн хүн мөн давтаж болохоор тооллогын хуудсанд бичнэ.

Тооллогын хуудас (үүнийг хэвлээрэй)

Энэ тооллогын хуудсыг уг нийтлэлд зориулан тусгайлан боловсруулав. Дэвтэртээ хуулж эсвэл дээж бүрд нэгийг хэвлэж ашиглана.

Амьдрах чадвар (%) = 100 x будагдаагүй / (будагдаагүй + бараан хөх). Нэг mL дэх нийт эс = N x шингэрүүлэлтийн коэффициент x 10^4, энд N нь камерын тодорхойлсон талбайд тоолсон эсийн тоо. Үр дүнгийн хажууд будах хугацааг тэмдэглэнэ. Учир нь хугацаагүй амьдрах чадварын үзүүлэлтийг давтан гаргах боломжгүй.

Амьдрах чадварын үзүүлэлт яагаад хэлбэлздэг вэ

Хугацаа бол эхний нөлөөлөх хүчин зүйл бөгөөд хоёр чиглэлээр нөлөөлдөг. Бодисын солилцооны идэвхтэй эсүүд будгийг ангижруулдаг тул хэт эрт уншвал амьд эсүүд ангижруулж дуусаагүй байхад нь ажиглаж, үхсэн гэж буруу ангилж болно. Гэвч удаан хугацаанд будганд байлгах нь өөрөө хортой бөгөөд үнэхээр гэмтсэн хөх эсүүд үүсгэж, үхсэн эсийн будалтыг хуурамчаар нэмэгдүүлдэг. Иймээс лабораторийн сургалтын аргачлал 5 минутын дотор үнэлэхийг заадаг бөгөөд үүнийг Висконсины хөрөнгийн мөөгөнцрийн сургалтын аргачлалд баримтжуулсан. Найдвартай тайлбар нь метилен хөхөөр үнэлэх үр дүн хугацаанаас хамаардаг гэсэн үг. Тиймээс нэг богино хугацааг тогтоож, цувралын бүх дээжид тогтмол мөрдөнө.

Амьдрах чадвар багатай дээжүүдэд хоёр дахь хазайлт үүсдэг. Стандартчилсан арга нь амьдрах чадвар ойролцоогоор 80%-аас доош үед метилен хөх бодит амьдрах чадварыг хэт өндөр үнэлж болзошгүйг анхааруулдаг. Учир нь будгийг ангижруулж чадаж байгаа эсүүд үржих чадвараа заавал хадгалсан байдаггүй. Шар айраг үйлдвэрлэлийн ном зохиолд амьдрах чадвар ихээхэн буурсан үед мөн ийм найдваргүй байдал ажиглагддагийг дурдсан. Метилен хөхийг хурдан, ойролцоолсон үнэлгээ гэж үзэж, өсгөврийг дахин исгэлтэд ашиглах зэрэг амьдрах чадвар багатай дээжтэй холбоотой чухал шийдвэрийг агар хавтан дээр колони тоолох эсвэл нэмэлт будалтаар баталгаажуулна.

Дээжийн орчны нөлөө гуравдугаарт орно. OIV-ийн арга ойролцоогоор pH 4.6-д явагддаг бөгөөд буферийн багтаамж өндөртэй, pH багатай дээжүүд будгийн зөв үйлчлэлд саад болдгийг анхааруулдаг. Мөн сахарын агууламж 100 g/L-ээс дээш үед эсүүд төөрөгдүүлэм цайвар хөх харагддаг тул сорилыг хэрэглэхгүй байхыг зөвлөдөг. Будалтын pH-ийг туршилтаар харьцуулахад шалгасан мужийн хүрээнд мэдрэг чанар ихээхэн өөрчлөгдсөн нь pH-аас хамаарах метилен хөхийн аргын судалгаатай нийцдэг. Хог хаягдал бас тусдаа төөрөгдүүлэх хүчин зүйл болдог: бохир нухаш дахь будагдсан жижиг хэсгүүд үхсэн эс шиг харагдаж, шинжлэгчид хоорондын үр дүнгийн хэлбэлзлийг нэмэгдүүлдэг.

Энэ хэлбэлзлийг зөвхөн ажигласан төдий биш, тоогоор хэмжсэн. FEMS-ийн хөрөнгийн мөөгөнцрийн харьцуулсан судалгаанд мэдээлсэн зургаан сарын шар айраг үйлдвэрлэлийн туршилтад метилен хөхөөр хийсэн давтан хос хэмжилтийн стандарт хазайлт дунджаар 6.1% байсан бол оксонол ашигласан урсгал цитометрийнх 0.2% байжээ. Нэг дээжийг шинжилсэн хоёр шинжлэгчийн үр дүн 13 хүртэл хувийн пунктээр зөрсөн байна. Амьдрах чадварыг үнэлэх аргуудын 2023 оны тоон харьцуулалт флюоресценцийн микроскопи болон урсгал цитометрийн нарийвчлал мэдэгдэхүйц өндөр болохыг тогтоосон бөгөөд аргын гүйцэтгэл зүйл болон дээжийн орчноос хамаардгийг мөн харуулсан. Painting ба Kirsop нарын аргын сонгодог тайлбар (PMID 24430080) суурь лавлагаа хэвээр байгаа бол хөрөнгийн мөөгөнцрийн амьдрах чадвар ба физиологийн идэвхийн сорилуудын өргөн хүрээний тойм (PMID 25154541) метилен хөхийг эцсийн дүгнэлт өгөх бус, харилцан нөхөх сорилуудын нэг гэж үздэг. Трипан хөх энд шууд илүү сайн хувилбар болохгүй: энэ нь мембраны бүрэн бүтэн байдал алдагдсаныг илэрхийлдэг бол метилен хөх нь эсэд нэвтрэх болон ангижруулах идэвхийг хамтад нь илэрхийлдэг. Тиймээс стрессэд өртсөн эсүүд хоёр будгаар өөрөөр ангилагдаж болно.

Амьсгалын туршилт: хөх өнгө арилах хугацааг хэмжих

Хоёр дахь сорилд микроскоп огт ашиглахгүй. Хөрөнгийн мөөгөнцөр, глюкоз, шингэрүүлсэн метилен хөхийг битүү хуруу шилэнд хийж, хөх өнгө арилах хүртэлх хугацааг хэмжинэ. Эсүүд бодисын солилцоо явуулахдаа хөх будгийг өнгөгүй хэлбэрт хувиргах ангижруулах эквивалент үүсгэдэг бол ууссан хүчилтөрөгч үүнийг буцаан исэлдүүлдэг. Эсүүд хүчилтөрөгчийг бууруулсны дараа ангижрах үйл явц давамгайлж, хуруу шилний өнгө арилна. Иймээс эцсийн цэг нь амьсгал, будгийн концентраци, хүчилтөрөгчийн хүртээмжийн тэнцвэрийг илэрхийлдэг бөгөөд үүнийг молекул хүчилтөрөгчийн хэрэглээний шууд хурд гэж бус, метилен хөхийн ангижрах эсвэл өнгө арилах хугацаа гэж мэдээлэх ёстой.

Хэмжих хугацааг тохиромжтой хүрээнд байлгахын тулд амьдрах чадварын шинжилгээнд хэрэглэдгээс хавьгүй шингэн будаг ашиглана. AQA-ийн A түвшний заавал хийх дадлагын гарын авлага үүнийг сайн стандартчилсан: ойролцоогоор 30 C хүртэл халаасан 100 mL усанд 1 g глюкоз хийж, хэрэглэхийн өмнөхөн 5 g хатаасан хөрөнгийн мөөгөнцөр нэмнэ. Мөн 1% эх уусмалын 0.1 mL-ийг 100 mL хүртэл шингэрүүлж, ойролцоогоор 0.001% ажлын будаг бэлтгэнэ. Хөрөнгийн мөөгөнцөр-глюкозын суспензийн 2 mL-ийг ажлын будгийн 2 mL-тэй хольж, туршилтын температурт тэнцвэржүүлээд, нэг удаа 10 секунд сэгсэрч, хугацаа хэмжигчийг асаана. Дахин сэгсэрч болохгүй. Сэгсрэх нь хүчилтөрөгчийг дахин оруулж, хуруу шилийг буцаан хөх болгодог бөгөөд энэ нь арга ажиллагаанаас үүдэх хамгийн том гажуудал юм. AQA-ийн тэмдэглэснээр бэлдмэлийн өнгө ердийн нөхцөлд 35 C-д ойролцоогоор 5 минутын дотор арилах ёстой. Туршилтын дундаж хугацаа 20 C-д 275 s, 35 C-д 128 s, 45 C-д 145 s байжээ. Эдгээр нь нэг туршилтын зохион байгуулалтын жишээ болохоос нийтлэг жишиг биш. Хяналттай нөхцөлд ангижрах хурд ба бодисын солилцооны идэвхтэй хөрөнгийн мөөгөнцрийн хоорондох тоон хамаарлыг ангижралын тусгай судалгаанууд дэмждэг. Үүнд PMID 25773544 дугаараар бүртгэгдсэн ажил болон Yeast (2014)-д нийтлэгдсэн механизмын судалгаа багтана.

Хугацааны явцын жишээ (нийтлэлд зориулан боловсруулсан материал)

Доорх хүснэгт нь дээр тайлбарласан AQA загварын туршилтын зохион байгуулалтыг ашиглан энэ нийтлэлд зориулж боловсруулсан жишээ юм: хөрөнгийн мөөгөнцөр-глюкозын холимгийн 2 mL дээр ойролцоогоор 0.001% ажлын будгийн 2 mL нэмж, нэг удаа 10 секунд сэгсрээд, хөдөлгөхгүйгээр инкубацлана. Хүснэгтийн утгууд нь оюутны багийн бүртгэх ёстой хэлбэрээр өгсөн жишээ хэмжилтүүд бөгөөд хурдны индексийг 1-ийг секундээр илэрхийлсэн өнгө арилах хугацаанд хуваасан утга гэж тодорхойлсон. Ижил хуруу шилнүүдээр туршилт хийж, эдгээр утгыг өөрийн хэмжсэн утгаар солино.

A, B, C хуруу шилний хурдны индексийг температураас хамааруулан графикт дүрслэнэ. Муруй өсөөд дараа нь тэгширч эсвэл буурна. Энэ нь шулуун шугам бус, ферментийн үйл ажиллагаанаас хүлээгддэг хэлбэр юм. D, E, F хуруу шилнүүд нь тухайн муруйн өгөгдлийн цэгүүд биш. Тэдгээр нь муруйг тайлбарлах боломж олгодог хяналтууд юм.

Сорил бүрийг утгатай болгох хяналтууд

Амьсгалын туршилт бүрд гурван дагалдах хяналт хэрэгтэй. Буцалгасан эсвэл үхүүлсэн хөрөнгийн мөөгөнцөр, глюкоз, будаг агуулсан хольц хөх хэвээр байх ёстой. Энэ нь хурдан ангижрал амьд эсийн бодисын солилцооноос хамаардгийг нотолно. Нэмэлт глюкозгүй, амьд хөрөнгийн мөөгөнцөр ба будаг агуулсан хольц нь субстратын хяналт болно. Гэхдээ хөрөнгийн мөөгөнцөр дотоод нөөцөө ашигладаг тул өнгө нь аажмаар арилахыг хүлээж болно. Хөрөнгийн мөөгөнцөргүй, глюкоз ба будаг агуулсан хольц нь химийн хоосон сорьц бөгөөд зайлшгүй шаардлагатай. Учир нь шүлтлэг орчин дахь глюкоз эс байхгүй үед ч метилен хөхийг ангижруулж чадна.

Амьдрах чадварын тооллогод өөр төрлийн хяналт хэрэгтэй: арга ажиллагааны тогтмол байдал. Ижил будгийн эх уусмал, ижил холих харьцаа, ижил будах хугацаа, камерын ижил талбай, ижил нахиа болон хилийн дүрэм хэрэглэж, боломжтой бол дээжийн мэдээллийг мэдэхгүйгээр тоолно. Хоёр шинжлэгчийн үр дүн арван хувийн пунктээр зөрөхөд тооллогын хуудас ихэвчлэн шалтгааныг илрүүлдэг: өөр хугацаа, хөх гэж тооцох өөр босго, эсвэл нахиа тоолох өөр дүрэм. Будагдсан эсийг бэлтгэж, харах техникүүд нь бактерийн энгийн будалтын аргуудтай холбоотой бөгөөд төрөл бүрийн сорьцод будаг юуг тэмдэглэдгийг илүү өргөн хүрээнд микроскопийн будалтын атласт авч үзсэн. Хөх өнгөний эрчмийг тоон утгаар унших физик үндэслэлийн хувьд нөхцөлийг нь зааж өгсөн шингээлтийн лавлагаа нь коэффициент бүрийг яагаад уусгагч, pH, концентраци зэрэг нөхцөлтэй нь хамт хэрэглэх ёстойг тайлбарладаг.

Сорилыг асуултаасаа хамааруулан сонгоно. Яг одоо хэдэн эс амьд байна вэ гэдэг нь тоолох асуулт бөгөөд микроскоп, тооллогын хуудсаар хариулна. Энэ өсгөвөр хэр идэвхтэй амьсгалж байна вэ гэдэг нь кинетикийн асуулт бөгөөд секундомер болон хяналттай хуруу шилнүүдээр хариулна. Метилен хөх хоёуланд нь ашиглагддаг ч нэг хуруу шилэнд нэгэн зэрэг хэзээ ч ашиглагдахгүй.