Метилен хөхийн калибровкийн муруй байгуулах нь: хоосон сорьц, муж ба шугаман чанар

Хоёр шинжээч метилен хөхийн нэг сав нөөц уусмалыг хуваалцан хэрэглэж, тус бүр калибровкийн муруй байгуулжээ. Эхнийх нь координатын эхийг дайрсан шулуун гаргаж, үл мэдэгдэх сорьцуудыг итгэлтэй хэмжив. Хоёр дахь шинжээчийн муруй дээд хэсэгтээ нугарч, огтлолцлын утга нь тэгт ойртохгүй, сорьцын үр дүн шингэрүүлэлтээс хамаарч өөрчлөгджээ. Будагч бодис, багаж, долгионы урт нь ижил. Ялгаа нь ур чадварт биш, туршилтын загварт байв: хоосон сорьцод юу хийсэн, ямар концентрацууд сонгосон, шалгасан муж нь нэг энгийн загвар хүчинтэй хэвээр байх бүсэд багтсан эсэх.

Калибровкийн муруй бол багажийн хариу дохио ба концентрацын хоорондын тохирол бөгөөд зөвхөн түүнийг байгуулсан нөхцөлд хүчинтэй. Метилен хөхийн хувьд энэ тохирлын сул тал нь тодорхой. Будагч бодис усанд өөр хоорондоо ассоциац үүсгэдэг тул гэрэл шингээгч хэлбэр нь концентрацаас хамаарч өөрчлөгдөнө. Энэ өөрчлөлтийг дамнуулан байгуулсан муруй шулуун байхгүй бөгөөд хэчнээн статистик арга хэрэглэсэн ч үүнийг засахгүй. Энэ өгүүлэлд шулуун хамаарал нь утгатай байхаар муруйг хэрхэн төлөвлөхийг харуулна: зөв хоосон сорьц сонгох, мужийг мономер давамгайлах бүсэд барих, давталтыг бодитой хийх, муруйлтыг шуугиан бус мэдээлэл гэж үзэх.

Стандарт уусмалаас биш, хоосон сорьцоос эхэл

Хоосон сорьц тэг утгыг тогтоодог бөгөөд метилен хөхийн хувьд будагч бодисоос бусад бүх бүрэлдэхүүнийг агуулсан байх ёстой. Усны зэрэглэл, буфер ба pH, давс, хам уусгагчийн хувь, температур бүгд ижил байна. Калибровкийн стандарт уусмалуудыг яг тэр матрицад бэлтгэ. Үүний шалтгаан нь захиргааны шаардлага биш, химийн мөн чанар юм. Давс болон уусгагч нь мономер, димер, түүнээс том агрегатуудын хоорондын тэнцвэрийг шилжүүлж, хэмжилтийн долгионы урт дахь спектрийг өөрчилдөг. Зөвхөн ус агуулсан хоосон сорьц нь матрицаас үүдэлтэй химийн хэлбэрийн тархалтын өөрчлөлтийг засварлаж чадахгүй. Метилен хөхийн усан дахь спектрийн иж бүрэн шинжилгээ-г нээлттэй хандалтын бүртгэлээр нь үзэх боломжтой. Уг судалгаанд ионы хүч тэнцвэрийг шилжүүлдэг учраас натрийн хлоридын концентрацыг 0-оос 0.15 M хүртэл өөрчилсөн бөгөөд давсны хэмжээ өсөхөд агрегац нэмэгдсэн.

Үүнээс гарах нэг практик дүгнэлт: ионгүйжүүлсэн усанд калибровк хийчихээд сорьцуудыг фосфатын буфер эсвэл бохир усны шүүгдэст хэзээ ч бүү хэмж. Шинжлэх бодисгүй матриц байхгүй бол сорьцод өөрт нь стандарт нэмэх арга нь матриц нь тохироогүй гадаад калибровкийн муруйгаас илүү найдвартай. Усан орчны шинжилгээг найдвартай байлгах холбогдох зөвлөмжийг матриц ба хөндлөнгийн нөлөөний тухай хэсэгт, будагч бодисын тоон шинжилгээний ерөнхий зарчмыг шинжилгээний загварын тоймд авч үзсэн.

Нэг хэлбэр давамгайлах мужийг сонго

664 nm орчмын урт долгионы зурваст тоон хэмжилт хийхдээ будагч бодисын ихэнх нь мономер хэлбэртэй гэж үздэг. Энгийн усанд энэ таамаг зөвхөн уусмал шингэн, ойролцоогоор бага микромоляр мужид байх үед хүчинтэй. Нийтлэгдсэн туршилтын налалтууд энэ хязгаарыг харуулдаг: 1 cm кюветэд ойролцоогоор 7 микромоляраас доош барьсан калибровкийн налалт 82,000 M-1 cm-1 орчим байдаг бол ойролцоогоор 37 микромоляр хүртэл сунгасан калибровкийн налалт 67,100 орчим болж буурдаг. Учир нь өндөр концентрацтай стандарт уусмалууд аль хэдийн мэдэгдэхүйц хэмжээний димер агуулдаг. Энд дурдсан коэффициент бүрийг нөхцөлийнх нь хамт метилен хөхийн спектрийн лавлахад тэмдэглэсэн тул тоонуудыг харьцуулахдаа тэр эх сурвалжийг ашиглах нь зөв. Энэ өгүүлэлд тэдгээрийг зөвхөн муж тогтооход ашиглав.

Төлөвлөлтийн дүрмүүд үүнээс шууд гарна:

1. Хамгийн өндөр концентрацтай стандарт уусмалыг спектрийн хэлбэр тогтвортой байхаар хангалттай шингэн байлга. Арга боловсруулахдаа түвшин бүрд ганц долгионы уртаар хэмжихийн оронд үзэгдэх гэрлийн бүх мужийг буюу ойролцоогоор 550-аас 750 nm хүртэл скан хий. Нормчилсон спектрийн хэлбэр концентрацаас хамаарч өөрчлөгдвөл химийн төлөв өөрчлөгдөж байна гэсэн үг бөгөөд сонгосон муж хэт өргөн байна.
2. Түвшин бүрд 610 nm орчмын шингээлтийг 665 nm орчмын шингээлтэд харьцуулсан харьцааг хяна. Концентрац өсөхөд энэ харьцаа нэмэгдвэл димерийн мөрөн хэсэг томорч, мономерийн загвар хүчинтэй байхаа больж байна гэсэн үг. Энэ оношлох үзүүлэлтийг агрегац ба концентрацын нөлөөний гарын авлагад дэлгэрүүлэн тайлбарласан.
3. Бага микромоляр концентрацтай ажиллахдаа 1 cm кювет ашигла. Налалт 82,000 орчим үед 5 микромоляр нь 0.41 орчим, 10 микромоляр нь 0.82 орчим шингээлт өгнө. Аль аль нь ихэнх багажид тохиромжтой.
4. Өтгөн нөөц уусмалын хувьд 1-ээс хавьгүй өндөр шингээлтийг зөвшөөрөхийн оронд оптик замыг богиносго. Гэхдээ богино зам нь фотометрийн асуудлыг засахаас биш химийн асуудлыг засахгүйг сана. Агрегац нь оптик замын уртаас бус, концентрацаас хамаардаг. Тиймээс өтгөн нөөц уусмалд шингэн мономерийн муруй ашиглахын оронд химийн хэлбэрийн тархалтыг нь тооцсон тусдаа арга хэрэгтэй хэвээр.

Энэ дүр зургийн ихэнхийг үндэслэсэн иж бүрэн тохируулгад 1.1 микромоляраас 3.4 миллимоляр хүртэлх 224 спектрийг хамруулж, 34 микромоляраас доош концентрацад ч тетрамерийн дохио илэрч болохыг тогтоосон. Энэ үр дүн гол санааг тодорхойлно: шугаман муж нь зөнгөөр төсөөлснөөс нарийн тул таамаглахын оронд шалга.

Түвшин, давталт ба дараалал

Гурван цэгтэй муруй юу ч нотлохгүй. ICH Q2(R2)-ийн баталгаажуулалтын удирдамжид шугаман чанарыг үнэлэхийн тулд дор хаяж таван концентрацыг ашиглахыг шаарддаг. Харин тэгээс ялгаатай зургаагаас найман түвшин нь, ялангуяа агрегац эхлэх дээд хэсэгт, илүү үнэмшилтэй ажлын муруй өгдөг. Түвшнүүдийг зөвхөн тохиромжтой гэсэн шалтгаанаар геометр прогрессоор сонгох биш, сорьцын төлөвлөсөн мужийг хамруулж, муруйлт үүсэх магадлал хамгийн өндөр хэсэгт илүү нягт байрлуул.

Түвшин бүрийг хоёр эсвэл гурван давталтаар хэмж. Нэг колбоноос гурван удаа уншихын оронд давталт бүрийг тусад нь бэлтгэ. Бие даасан давталтууд бэлтгэлийн алдааг илрүүлдэг; нэг колбоноос давтан унших нь зөвхөн багажийн шуугианыг илрүүлнэ. 2020 оны иж бүрэн судалгаанд уусмал бүрийг гурван удаа хэмжсэн бөгөөд энэ нь үндсэн сонголт болгон хэрэглэхэд зохистой хэвээр. Дохионы шилжилт, шилэнд адсорбцлогдох эсвэл температурын өөрчлөлт муруйлт мэт харагдахаас сэргийлж унших дарааллыг санамсаргүй болго. Кварц кюветийн нэг судалгаанд 34 микромоляр уусмалаас будагч бодисын ойролцоогоор 3 хувь нь 10 минутын дотор адсорбцлогдсон тул хэмжилтийн цувралын турш хүрэлцэх хугацаа, кювет, цэвэрлэгээ болон дарааллыг жигд байлга.

Аргыг харуулах бодолттой жишээ (хэмжилтийн өгөгдөл биш)

Доорх тоонуудыг тооцооллыг харуулахын тулд зохиосон. Эдгээр нь лабораторийн хэмжилт биш бөгөөд метилен хөхийн өгөгдөл гэж ишилж болохгүй. Чухал зүйл нь эдгээр тоог тойрсон шалгалтын тогтолцоо юм.

Матрицад тохирсон буферт бэлтгэсэн зургаан стандарт уусмалыг 1 cm оптик замтайгаар, тохирсон хоосон сорьцын эсрэг 665 nm-т уншсан гэж үзье:

Дундаж шингээлтийг концентрацаас хамааруулан шулуунаар тохируулахад налалт нь нэг микромоляр тутамд 0.0805 орчим шингээлтийн нэгж, огтлолцлын утга нь тэгээс хэдхэн миллишингээлтийн нэгжийн зайд гарна. Налалтыг оптик замын уртад хуваавал илэрхий шингээлтийн коэффициент гарна: нэг микромоляр тутамд 0.0805 гэдэг нь ойролцоогоор 80,500 M-1 cm-1-тэй тэнцүү бөгөөд усанд мономер давамгайлсан мужтай нийцнэ. Гол шалгуур нь R квадрат биш; тэр нь аль ч тохиолдолд маш сайн харагдана. Харин огтлолцлын утга тэгт ойр байх, S2-оос S5 хүртэл A610/A665 харьцаа тогтвортой байх, үлдэгдлүүд тодорхой чиг хандлагагүй тархах нь чухал. S6 дахь харьцааны өсөлт нь уг түвшнийг хасах эсвэл 7 микромолярыг энэ матриц ба багажийн хослолын түр дээд хязгаар гэж тэмдэглэх бодит дохио юм.

Ижил нөхцөлд 0.245 гэж уншигдсан үл мэдэгдэх сорьцын утгыг шууд хөрвүүлнэ: 0.245-ыг нэг микромоляр тутмын 0.0805-д хуваахад ойролцоогоор 3.0 микромоляр гарна. Энэ нь сорьцын шингэрүүлэлтийн коэффициентийг тооцохоос өмнөх утга. Үр дүнг долгионы урт, оптик зам, хоосон сорьцын матриц, калибровкийн муж, огноо зэрэг нөхцөлийн хамт тайлагна.

Бөглөх калибровкийн ажлын хуудас

Шинэ матриц бүрд энэ загварыг лабораторийн бүртгэлдээ хуулж ашигла. Нэг матриц, нэг хуудас, нэг муруй.

Урвалжийн хэлбэрийг тэмдэглэх мөр зайлшгүй хэрэгтэй. Худалдааны метилен хөх нь усгүй давс эсвэл тригидрат зэрэг гидрат байж болох бөгөөд молийн массыг буруу сонговол бүх нэрлэсэн концентрацад анзаарагдахгүй систематик алдаа орно. Эх материалын цэвэршилт болон техникийн үзүүлэлтийг шалгах асуудлыг чанар ба зэрэглэлийн гарын авлагад авч үзсэн.

Бие даасан хяналтын стандарт уусмалаар баталгаажуул

Калибровкийн муруй өөрийнхөө ажлыг өөрөө үнэлж болохгүй. Тохируулга хийсний дараа тусад нь жинлэж бэлтгэсэн нөөц уусмалаас зөвшөөрсөн мужийн дунд орчим концентрацтай нэг хяналтын стандарт уусмал бэлтгээд, үл мэдэгдэх сорьц мэт хэмж. Хэдхэн хувийн зөрүүтэй тохирч байвал бэлтгэлийн дараалал зөв байсныг батална; тохирохгүй бол багаж гэхээсээ илүү нөөц уусмал эсвэл шингэрүүлэлтийг сэжиглэнэ. Сорьцын багц бүрд хяналтын стандарт уусмалыг дахин хэмж. Муруй өөрчлөгдөөгүй байхад хяналтын утга шилжвэл сорьцыг сэжиглэхээсээ өмнө ажлын уусмал эсвэл кюветийг шалга. Энэ ганц дадал нь усгүй бодисын саванд гидратын молийн масс хэрэглэсэн, микропипеткийн тохируулга алдагдсан, буферийг буруу ионы хүчтэй бэлтгэсэн зэрэг анзаарагддаггүй алдааны ихэнхийг илрүүлдэг. Хяналтын стандартын нөхөн олдолтыг ажлын хуудсанд налалтын хажууд тэмдэглэ. Ингэснээр дараа нь унших хүн шулууныг зүгээр зураагүй, үнэхээр шалгасныг харна.

Шугаман бус байдлыг оношлох мэдээлэл болгон ашиглах

Муруй нугарахад гажилтын хэлбэр нь шалтгааныг заадаг. Спектрийн хэлбэр өөрчлөгдөөгүй байхад өндөр шингээлтийн хэсэгт доош муруйх нь багажийн асуудлыг илтгэнэ. Ихэвчлэн сарнисан гэрэл өндөр шингээлтийн утгыг бодитоос бага болгож гажуудуулдаг. Муруйлттай зэрэгцэн 610 nm дахь мөрөн хэсэг өсвөл химийн шалтгааныг заана: димер болон том агрегатууд мономероос өөрөөр гэрэл шингээж байна. Хоосон сорьц тэг утга өгөхгүй байх, эсвэл стандарт уусмалын утга хугацааны явцад буурах нь савтай холбоотой асуудлыг илтгэнэ: шил эсвэл кюветэд адсорбцлогдох, ялангуяа хэмжилтийн цувралд хүрэлцэх хугацаа өөр өөр байсан бол. Харин цэгүүдийг сайн дайрсан цэвэр шулуун гарсан ч сорьцын үр дүн буруу байвал матрицын асуудлыг заана: сорьцууд калибровкийн стандарт уусмалаас ялгаатай байна. Иймд сорьцын матрицад муруйг дахин байгуул эсвэл стандарт нэмэх аргад шилж. Бүх тохиолдолд үлдэгдлийг концентрацаас хамааруулан графикаар дүрсэл. Санамсаргүй тархалт нь шулуун загварыг дэмжинэ; инээмсэглэл эсвэл хөмсөг зангидсан мэт нумарсан хэлбэр нь ямар ч R квадратын босгоос илүү найдвартайгаар уг загварыг няцаана. Баталгаажуулалтын удирдамжид энэ санааг тодорхой дэмжсэн байдаг.

Метилен хөхтэй ажиллахад ийм сахилга бат үр өгөөжөө өгдөг. Мономерийн зурвас нь хүчтэй, химийн шинж чанар нь сайн судлагдсан бөгөөд доголдлын хэлбэрүүд нь тоон үр дүнг гажуудуулахаасаа өмнө спектрт илэрдэг. Муруйг нарийн мужид байгуулж, хоосон сорьцыг зөв тохируулан, давталтуудыг бие даан бэлтгэж, мужийг сонгохдоо спектрийн хэлбэрийг шийдвэрлэх үндэслэл болго. Гарсан шулуун богино ч түүн дээрх цэг бүр үнэн зөв байна.

Энэ өгүүллийн жишээ тооцоололд аргыг харуулахын тулд зохиосон тоонуудыг ашигласан. Бүрэн нөхцөлтэй хэмжилтийн лавлах коэффициентууд холбоос бүхий спектрийн лавлахад байгаа бөгөөд үндэслэл болсон агрегацын судалгаа PMID 33251415 дугаараар бүртгэгдсэн.