Зебра загасны судалгаан дахь метилен хөх: арчилгааны нэмэлт ба туршилтын үр дүнг гажуудуулах хүчин зүйл

Зебра загасны түрсний ус ихэвчлэн бүдэг хөх өнгөтэй байдаг ч яагаад гэдгийг нь бараг хэн ч тэмдэглэдэггүй. Энэ будагч бодис нь мөөгөнцрийн эсрэг нэмдэг метилен хөх бөгөөд ихэнх протоколд түүнийг суурь нөхцөлийн нэг хэсэг гэж үздэг. Гэвч энд суурь нөхцөл гэж үзэх нь буруу. Харин бүртгэлд оруулаагүй туршилтын хүчин зүйл гэж ойлговол илүү оновчтой: өртүүлсэн бүлгийн саванд байгаа ч хяналтын бүлэгт байхгүй, хэрэглэж буй концентрацид фармакологийн идэвхтэй, туршилтаар хэмжиж буй үзүүлэлтүүдийг өөрчилж чадах бодис юм.

Энэ ялгаа нь доорх бүх тайлбарын үндэс болно. Мөөгөнцрийн эсрэг ердийн арчилгаа бол нэг асуудал. Харин уг нэмэлт таны сорилын хувьд нөлөөгүй эсэх нь өөр асуудал. Зебра загасны сүүлийн үеийн судалгаанууд эхний асуултад тайвшруулахуйц, хоёр дахь асуултад санаа зовоохуйц хариу өгч байна.

Удирдамжууд яг юу заадаг вэ

Нэгдсэн нэг стандарт байхгүй нь асуудлын нэг хэсэг юм. Канадын амьтны арчилгааны зөвлөлийн удирдамжид мөөгөнцрийн өсөлтийг бууруулахын тулд түрс, авгалдай тээвэрлэх уусмалд 0.5 mg/L буюу 0.00005% хэрэглэхийг зөвшөөрдөг. Европын лабораторийн амьтны удирдамжид үр хөврөлийг ихэвчлэн мөн 0.00005% агуулсан орчинд байлгадаг гэж тайлбарласан. Cold Spring Harbor-ын E3 жорт үүний хоёр дахин их буюу 1 mg/L, эсвэл 0.0001%-ийг найрлагадаа заасан байдаг. Харин үүнээс эрс ялгаатай нэг орхигдол бий: OECD-ийн загасны үр хөврөлийн хоруу чанарын сорилын удирдамжид давсны найрлагыг нь сэргээн бэлтгэсэн шингэрүүлэх ус болон турших химийн бодисыг заасан ч 2013 оны хувилбар болон дараагийн шинэчилсэн хувилбарын алинд нь ч метилен хөх хэрэглэх зөвлөмж байхгүй. Тиймээс нэг лаборатори зебра загасны үр хөврөлийг амьдралынх нь эхний хэдэн цагаас метилен хөхтэй хөх усанд өсгөдөг бол нөгөө нь зохицуулалтын шаардлагын үр хөврөлийн сорилыг өнгөгүй усанд хийдэг. Гэтэл хоёулаа өөрийн орчныг хэвийн гэж нэрлэдэг. Лаборатори хоорондын үр дүнг харьцуулах эсвэл өмнөх судалгааны хяналтын өгөгдлийг нэгтгэх хүн бүр энэ зөрүүг өвлөн авна.

Концентрацийн хэмжээг ойлгоход, 0.00005% нь ойролцоогоор 1.56 micromolar, 0.0001% нь ойролцоогоор 3.13 micromolar юм. Эдгээр нь бага тоо тул нөлөө үзүүлэхэд хэт бага гэж үзмээр санагдаж болно. Доорх судалгаанууд яг энэ таамаглалыг, яг эдгээр концентрацид шалгасан.

Лабораторийн бус, загас тэжээх талаас энэ сэдэвтэй танилцаж буй уншигчид ижил молекулыг өөр нөхцөлд хэрэглэдгийг аквариумд метилен хөх хэрэглэх гарын авлагаас үзэж болно. Химийн үндэс нь ижил; будагч бодис эс дотор электроныг хэрхэн дамжуулдаг тухай тайлбар нь исэлдэн ангижрах идэвхтэй нэгдэл яагаад бодисын солилцооны судалгаанд дахин дахин гарч ирдгийг ойлгуулна. Харин цаашдын тайлбар нь метилен хөхтэй зебра загасны түрсний усанд тусгайлан хамаарна.

Бодисын солилцоо: нөлөөллийн чиглэл үе шатнаас хамааран солигдоно

Хамгийн их мэдээлэл өгсөн судалгаанд хэвийн хөгжиж буй зебра загасыг амьдралын эхний өдрөөс үр тогтсоноос хойших 5 хоног хүртэл өртүүлж, үе шат бүрд исэлдэлтийн бодисын солилцоог хэмжсэн. Үүнийг үр хөврөлийн бодисын солилцооны туршилтуудын нийтлэгдсэн тайланд тайлбарласан байдаг. Нөлөөллийн чиглэл нь эсрэгээрээ өөрчлөгддөг тул энэ зүй тогтлыг нарийн тайлбарлах нь чухал.

Үр тогтсоноос хойш 1 хоногт арчилгаанд хэрэглэдэг хоёр концентрацийн аль алинд өртсөн үр хөврөлийн суурь хүчилтөрөгчийн хэрэглээ нэмэгдсэн. 2 хоногт авгалдайн гадаргуугийн давхаргын митохондрийн мембраны потенциал 0.00005%, 0.0001%, 0.0003%-ийн өртөлтийн бүх нөхцөлд ихэссэн. Харин 4–5 хоногт, түрснээс гарсны дараа нөлөөллийн чиглэл эсрэг болсон: үр тогтсоноос хойш тасралтгүй өртсөн эсэх, эсвэл зөвхөн 3 дахь хоногоос 4 дэх хоног хүртэл богино хугацаанд өртсөн эсэхээс үл хамааран исэлдэлтийн энергийн зарцуулалт буурсан. Үүний зэрэгцээ митохондрийн амьсгалын цогцолборуудын дэд нэгжийн транскриптүүд 1 болон 4 хоногт хоёуланд нь буурч, стероид үүсэлт болон глюконеогенезтэй холбоотой транскриптүүд мөн буурсан.

Өөр хоёр ажиглалт энэ дүр зургийг тодруулна. Арчилгааны өндөр концентрацид түрснээс гарах явц бага зэрэг түргэсэж, өртсөн үр хөврөл 2 хоногт хяналтын бүлгээс түрүүлсэн ч 3 дахь хоног гэхэд хяналтын бүлэг гүйцсэн. Мөн стрессийн зохицуулгын тэнхлэг хэвийн ажиллаж байгаа мэт харагдсан: 5 хоногтой авгалдайг ус эргэлдүүлэх стрессийн өдөөгчид өртүүлэхэд бүх биеийн кортизол хоёр бүлэгт хоёуланд нь хэвийн нэмэгдсэн. Тиймээс эдгээр хэмжээнд будагч бодис нь хөгжлийг ерөнхийд нь хордуулах бодис биш бөгөөд физиологийн бүх хариу урвалыг дарангуйлдаггүй. Харин энергийн солилцоог үе шатнаас хамааран өөрчилж, түрснээс гарахаас өмнө нэмэгдүүлж, гарсны дараа бууруулдаг.

Зан үйл: хоёр судалгааны үр дүн яагаад зөрдөг, бас хоёулаа яагаад зөв байж болох вэ

Өртөлтийн загваруудыг зэрэгцүүлэн авч үзэх хүртэл зан үйлийн судалгаанууд хоорондоо зөрчилтэй мэт харагдана. Нэг хөгжил ба зан үйлийн аюулгүй байдлын судалгаанд үр хөврөлийг үр тогтсоноос хойш ойролцоогоор 6 цагаас эхлэн 10 micromolar хүртэлх концентрацид өртүүлж, 4 дэх хоног хүртэл уусмалыг өдөр бүр шинэчилсэн. Дараа нь авгалдайг 5 болон 6 дахь хоногт будагч бодисгүй орчинд шилжүүлж, 6 дахь хоногт гэрэл-харанхуйн сорилоор хөдөлгөөнийг шалгасан. Үр дүн нь: үхэл, түрснээс гаралт, морфологид статистикийн ач холбогдолтой нөлөө илрээгүй бөгөөд өртүүлэлт хөдөлгөөнд нөлөөлөөгүй. Зохиогчид өөрсдийн нөхцөлд 10 micromolar-ыг дээд хязгаар болгон санал болгосон нь үндэслэлтэй байв.

Бодисын солилцооны судалгааны зарим зохиогч оролцсон хоёр дахь баг өртөлтийг бодит арчилгаанд хэрэглэдэг байдлаар явуулсан: үр тогтсоноос хойш 2–3 цагаас будагч бодисыг орчинд байлгаж, өдөр бүр хэсэгчлэн шинэчилсэн бөгөөд өртөлт үргэлжилж байх үед эсвэл өртөлтийн дараахан зан үйлийг хэмжсэн. Ердийн хэрэглээний ижил концентрацид авгалдайн хөдөлгөөн 24 цагийн сорилд буурсан нь өөр өөр омог болон лабораторид давтан ажиглагдсан. Зан үйлийн үр дүнг гажуудуулах нөлөөллийн судалгаанд энэ нөлөөг серотонинергик идэвхийн суурь түвшинтэй холбон тайлбарласан нь будагч бодисын моноамин оксидазыг дарангуйлдаг мэдэгдэж буй үйлдэлтэй нийцэж байв. Хамгийн тод жишээ нь метилен хөх агуулсан үр хөврөлийн орчин SSRI флуоксетинд үзүүлэх хүлээгдэж байсан хөдөлгөөний хариу урвалыг халхалсан явдал юм. Иймээс хөх усанд хийсэн скринингийн сорил өнгөгүй усанд илрэх байсан эмийн нөлөөг илрүүлэлгүй өнгөрөөж болно.

Энд үнэндээ зөрчил байхгүй. Нэг сорилд бодисыг зайлуулснаас хоёр хоногийн дараа хэмжигдэхүйц үлдэгдэл нөлөө илрээгүй байж болох ч өөр сорилд тухайн бодис орчинд байхдаа идэвхтэй хэвээр байж болно. Практик талаас нь дүгнэвэл, нөлөө илрээгүй үр дүн нь концентрацийн дээд хязгаарыг тогтооход үндэслэл болохоос нөлөөгүй гэсэн мэдэгдлийг батлахгүй. Харин нөлөө илэрсэн үр дүн нь чухал эрсдэлийг харуулж байна: ихэнх лабораторийн хэрэглэдэг яг тэр нөхцөлд, хэмжилтийн хугацаанд үргэлжилж буй идэвхтэй өртөлт.

Исэлдэн ангижрах сорил доторх исэлдэн ангижрах будагч бодис

Амьтанд бус, хэмжилтийн хэрэгсэлд гажуудал үүсгэдэг учраас өөр нэг эрсдэлийг тусад нь авч үзэх хэрэгтэй. Alamar Blue энергийн зарцуулалтын сорил өөрөө исэлдэн ангижрах химид тулгуурладаг: резазурин ангижирч, флуоресценцтэй резоруфин болдог. Метилен хөх ч мөн исэлдэн ангижрах химид оролцдог. Эсгүй хяналтын нөхцөлд арчилгааны хоёр концентрацийн аль аль нь 24 цагийн дараа Alamar Blue-ийн флуоресценцийг бага боловч статистикийн ач холбогдолтой хэмжээгээр бууруулсан. Амьтны туршилтуудад өртсөн үр хөврөлийг сорилын өмнө будагч бодисгүй орчинд дор хаяж гурван удаа угаасан бөгөөд түрснээс гарсан авгалдай дахь биологийн нөлөө нь эсгүй нөхцөл дэх саад нөлөөллөөс давсан. Иймээс хоёр зүйл хоёулаа үнэн: угаасан амьтдад бодисын солилцооны бодит нөлөө хадгалагддаг, харин угааж зайлуулаагүй будагч бодис үүн дээр шууд химийн артефакт нэмдэг. Хяналтын нөхцөлөөр энэ хоёрыг ялгах ёстой, эс тэгвээс аль ч тоон үзүүлэлт утгагүй болно. Будагч бодист суурилсан сорилын үр дүнг тайлбарлах ерөнхий зөвлөмж энд онцгой ач холбогдолтой.

Хөгжлийн үе шатны цагийн дараалал

Энэ нийтлэлд зориулан шинээр боловсруулсан хүснэгт. Өөрөөр заагаагүй бол концентраци нь арчилгааны стандарт хоёр утга болох 0.00005% ба 0.0001% юм.

Санах гол зүй тогтол нь бодисын солилцооны үзүүлэлтүүд эхэндээ нэмэгдэж, дараа нь буурдаг явдал юм. Зан үйлийн нөлөө өртөлтийн үед илэрдэг боловч бодисыг биеэс гадагшлуулсны дараа үүнийг шалгасан нэг сорилд илрээгүй.

Хяналтын загварын шалгах жагсаалт

Энэ нийтлэлд зориулан шинээр боловсруулсан хоёр дахь хэрэглэгдэхүүн. Метилен хөх хэрэглэдэг зебра загасны протокол туршилттай холбогдох үед үүнийг ашиглаарай.

1. Будагч бодисыг усны нэг хэсэг бус, урвалж гэж тайлагна. Концентрацийг хувиар болон micromolar-аар хоёулангаар нь, өртөлт эхэлсэн ба дууссан хугацааг үр тогтсоноос хойших цаг эсвэл хоногоор, орчин шинэчлэх хуваарь болон хэмжилт бүрийн өмнөх бодис зайлуулах хугацааг заа.
2. Хяналтын нөхцөлийг судалгааны асуултад тохируул. Турших химийн бодисын судалгаанд будагч бодисгүй хяналт хэрэгтэй; арчилгааны судалгаанд будагч бодисгүй ба будагч бодистой бүлгүүдийг харьцуулж, мөөгөнцрийн эсрэг үр дүнг бүртгэх шаардлагатай. Учир нь иш татсан хоёр судалгааны аль нь ч мөөгөнцрийн эсрэг үр нөлөөг хэмжээгүй.
3. Исэлдэн ангижрах сорилын өмнө угааж, дараа нь баталгаажуул. Будагч бодисгүй орчинд дор хаяж гурван удаа зайлж, будагч бодис болон урвалж агуулсан эсгүй хяналтыг зэрэг явуул. Учир нь будагч бодис Alamar Blue-ийн дохиог шууд бууруулдаг.
4. Зан үйл болон моноаминтай холбоотой үзүүлэлтүүдийг өндөр эрсдэлтэйд тооц. Хөдөлгөөн, цочих хариу урвал, түгшүүр төст зан үйл, антидепрессант болон MAO дарангуйлагчийн судалгаанд хэмжилтийн үед будагч бодисоос зайлсхийх эсвэл тухайн үзүүлэлтэд нөлөөгүйг нотлох хэрэгтэй. Нэгээс хоёр хоногийн зайлуулалтын дараа хөдөлгөөний нэг нөлөө арилсан боловч бусад туршилтын загварт энэ нь батлагдаагүй.
5. Бодисын солилцоо болон митохондрийн үзүүлэлтүүдийг бүх үе шатанд өндөр эрсдэлтэйд тооц. Хүчилтөрөгчийн хэрэглээ, энергийн зарцуулалт, мембраны потенциал болон амьсгалын гинжийн транскриптүүд арчилгааны концентрацид өөрчлөгддөг бөгөөд түрснээс гарахаас өмнө ба дараа эсрэг чиглэлтэй байдаг.
6. Нэг загварт тогтоосон нөлөөгүй байдлыг өөр загварт шууд бүү хамааруул. Бодисыг зайлуулсны дараа нөлөө илрээгүй үр дүн нь үргэлжилж буй өртөлтөд хамаарахгүй; морфологид нөлөө илрээгүй үр дүн нь бодисын солилцоо эсвэл эмийн харилцан үйлчлэлд хамаарахгүй; нэг омог, температур эсвэл сорилын үргэлжлэх хугацаанд гарсан үр дүн нь бусад нөхцөлд хамаарахгүй.
7. Дагаж мөрдсөн удирдамж болон өөр хувилбарыг нь дурд. CCAC, Европын эсвэл Cold Spring Harbor-ын концентрацийг тодорхой нэрлэж, OECD-ийн үр хөврөлийн сорилд будагч бодисыг оруулаагүйг тэмдэглэ. Ингэснээр уншигч таны амьтдыг ямар нөхцөлд өсгөснийг ойлгож чадна.

Эдгээрийн аль нь ч түрсийг амьд байлгахын тулд будагч бодис хэрэглэхийг эсэргүүцэж байгаа хэрэг биш. Харин арчилгааны сонголтыг шалгалгүйгээр өгөгдөлд нөлөөлөхийг зөвшөөрөхгүй байхыг хэлж байна. Сав дахь хөх өнгө бол фармакологийн үйлдэлтэй молекул бөгөөд гажуудалд хамгийн өртөмтгий туршилтууд нь залуу зебра загасыг одоо түлхүү ашигладаг, өндөр бүтээмжтэй бодисын солилцооны болон мэдрэл-зан үйлийн скринингүүд юм. Үүнийг бүртгэ, хяналтдаа тооц, хэмжихээсээ өмнө угааж зайлуул, мөн өөрөө үл анзаарагдам оролцож болох сорилыг нь шалга.