സീബ്രാഫിഷ് ഗവേഷണത്തിലെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ: പരിപാലനത്തിനുള്ള ചേർക്കലും പരീക്ഷണഫലങ്ങളെ ആശയക്കുഴപ്പത്തിലാക്കുന്ന ഘടകവും

സീബ്രാഫിഷ് മുട്ടകൾ സൂക്ഷിക്കുന്ന വെള്ളത്തിന് പലപ്പോഴും നേരിയ നീലനിറമുണ്ടാകും; അതിന്റെ കാരണം രേഖപ്പെടുത്തുന്നത് വളരെ അപൂർവമാണ്. ഫംഗസിനെ ചെറുക്കാൻ ചേർക്കുന്ന മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ എന്ന ചായമാണ് ആ നിറത്തിന് കാരണം. മിക്ക പ്രോട്ടോക്കോളുകളും അതിനെ പശ്ചാത്തലത്തിന്റെ ഭാഗമായി കാണുന്നു. ഇവിടെ പശ്ചാത്തലം എന്ന സങ്കൽപ്പം തെറ്റാണ്. രേഖപ്പെടുത്താത്ത ഒരു പരീക്ഷണഘടകം എന്നു പറയുന്നതാണ് കൂടുതൽ ഉചിതം: പരീക്ഷണ ഇടപെടൽ നടത്തിയ പാത്രങ്ങളിൽ ഉള്ളതും കൺട്രോളുകളിൽ ഇല്ലാത്തതും, ഉപയോഗിക്കുന്ന സാന്ദ്രതകളിൽ ഔഷധശാസ്ത്രപരമായി സജീവമായതും, പരീക്ഷണം അളക്കുന്ന ഫലസൂചകങ്ങളിൽത്തന്നെ മാറ്റം വരുത്താൻ കഴിയുന്നതുമായ ഒന്ന്.

ഈ വ്യത്യാസമാണ് താഴെയുള്ള ചർച്ചയുടെ അടിസ്ഥാനം. പതിവ് ഫംഗസ് നിയന്ത്രണ പരിപാലനം ഒരു വിഷയമാണ്. ചേർക്കുന്ന പദാർഥം നിങ്ങളുടെ അസേയെ ബാധിക്കാതെ നിഷ്പക്ഷമായി നിലനിൽക്കുമോ എന്നത് മറ്റൊരു വിഷയമാണ്. സമീപകാല സീബ്രാഫിഷ് പഠനങ്ങൾ ആദ്യത്തേതിന് ആശ്വാസകരവും രണ്ടാമത്തേതിന് ആശങ്കാജനകവുമായ മറുപടികളാണ് നൽകുന്നത്.

മാർഗനിർദേശങ്ങൾ യഥാർഥത്തിൽ നിർദേശിക്കുന്നത്

ഒരൊറ്റ മാനദണ്ഡമില്ല എന്നതും പ്രശ്നത്തിന്റെ ഭാഗമാണ്. ഫംഗസ് വളർച്ച കുറയ്ക്കാൻ മുട്ടകളും ലാർവകളും കൊണ്ടുപോകുന്ന ലായനിയിൽ 0.5 mg/L, അഥവാ 0.00005%, ഉപയോഗിക്കാൻ Canadian Council on Animal Care മാർഗനിർദേശങ്ങൾ അനുവദിക്കുന്നു. യൂറോപ്യൻ ലബോറട്ടറി മൃഗപരിപാലന മാർഗനിർദേശങ്ങളിൽ, പലപ്പോഴും ഇതേ 0.00005% അടങ്ങിയ മാധ്യമത്തിൽ ഭ്രൂണങ്ങളെ സൂക്ഷിക്കുന്നതായി വിവരിക്കുന്നു. Cold Spring Harbor E3 തയ്യാറാക്കൽ നിർദേശം അതിന്റെ ഇരട്ടി, 1 mg/L അഥവാ 0.0001%, ഒരു ചേരുവയായി നിർദേശിക്കുന്നു. ഇതിനു വിപരീതമായി ശ്രദ്ധേയമായ ഒരു ഒഴിവാക്കലുണ്ട്: OECD മത്സ്യഭ്രൂണ വിഷാംശ പരിശോധനാ മാർഗനിർദേശം പുനഃസംയോജിപ്പിച്ച നേർപ്പിക്കൽ വെള്ളവും പരിശോധനാ രാസവസ്തുവുമാണ് നിർദേശിക്കുന്നത്; അതിന്റെ 2013 പതിപ്പിലോ പിന്നീടുള്ള പരിഷ്കരണത്തിലോ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശയില്ല. അതിനാൽ ഒരു ലബോറട്ടറി ജീവിതത്തിന്റെ ആദ്യ മണിക്കൂറുകൾ മുതൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അടങ്ങിയ നീലവെള്ളത്തിൽ സീബ്രാഫിഷ് ഭ്രൂണങ്ങളെ വളർത്തുന്നു; മറ്റൊന്ന് നിയന്ത്രണ മാനദണ്ഡങ്ങൾക്കായുള്ള ഭ്രൂണ അസേ നിറമില്ലാത്ത വെള്ളത്തിൽ നടത്തുന്നു. രണ്ടും തങ്ങളുടെ മാധ്യമത്തെ സാധാരണമായതായി വിശേഷിപ്പിക്കുന്നു. ലബോറട്ടറികൾക്കിടയിലെ ഫലങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നവരോ മുൻകാല കൺട്രോൾ ഡാറ്റ ഒരുമിപ്പിക്കുന്നവരോ ഈ പൊരുത്തക്കേടും ഏറ്റെടുക്കുന്നു.

സാന്ദ്രതകളുടെ പശ്ചാത്തലം വ്യക്തമാക്കാൻ, 0.00005% ഏകദേശം 1.56 micromolar ആണ്; 0.0001% ഏകദേശം 3.13 micromolar ആണ്. ഇവ ചെറിയ സംഖ്യകളാണ്; പ്രസക്തമായ ഫലമുണ്ടാക്കാൻ കഴിയാത്തത്ര കുറവാണെന്നു കരുതാൻ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നവയും. താഴെയുള്ള പഠനങ്ങൾ കൃത്യമായി ഈ അനുമാനമാണ്, കൃത്യമായി ഈ സാന്ദ്രതകളിൽ, പരിശോധിക്കുന്നത്.

ലബോറട്ടറിയിൽ നിന്നല്ലാതെ മത്സ്യപരിപാലനത്തിൽ നിന്ന് ഈ വിഷയത്തിലേക്കെത്തുന്ന വായനക്കാർ ഇതേ തന്മാത്രയെ മറ്റൊരു സാഹചര്യത്തിലാണ് കാണുന്നത്. അത് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെക്കുറിച്ചുള്ള അക്വേറിയം മാർഗദർശിയിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. രസതന്ത്രം ഒന്നുതന്നെയാണ്; കോശങ്ങളിലൂടെ ഈ ചായം ഇലക്ട്രോണുകളെ എങ്ങനെ കൈമാറ്റം ചെയ്യുന്നു എന്ന ചർച്ച, ഒരു റെഡോക്സ്-സജീവ സംയുക്തം ഉപാപചയ പഠനങ്ങളിൽ ആവർത്തിച്ച് പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നതെന്തുകൊണ്ടെന്ന് വിശദീകരിക്കുന്നു. ഇനി പറയുന്നത് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ചേർത്ത സീബ്രാഫിഷ് മുട്ടകൾ സൂക്ഷിക്കുന്ന വെള്ളത്തെക്കുറിച്ചാണ്.

ഉപാപചയം: ഘട്ടത്തിനനുസരിച്ച് ഫലത്തിന്റെ ദിശ മാറുന്നു

ഏറ്റവും വിവരപ്രദമായ പഠനത്തിൽ, സാധാരണ വളർച്ചയിലുള്ള സീബ്രാഫിഷിനെ ജീവിതത്തിന്റെ ആദ്യ ദിവസം മുതൽ ബീജസങ്കലനത്തിനു ശേഷമുള്ള 5 ദിവസം വരെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് വിധേയമാക്കുകയും ഓരോ ഘട്ടത്തിലും ഓക്സിഡേറ്റീവ് ഉപാപചയം അളക്കുകയും ചെയ്തു. ഭ്രൂണ ഉപാപചയ പരീക്ഷണങ്ങളുടെ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച റിപ്പോർട്ട് ഇത് വിവരിക്കുന്നു. ഫലത്തിന്റെ ദിശ മാറുന്നതിനാൽ ഈ മാതൃക ശ്രദ്ധാപൂർവം വ്യക്തമാക്കേണ്ടതുണ്ട്.

ബീജസങ്കലനത്തിനു ശേഷമുള്ള 1-ാം ദിവസം, പരിപാലനത്തിനുപയോഗിക്കുന്ന രണ്ടു സാന്ദ്രതകളിലും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് വിധേയമായ ഭ്രൂണങ്ങളിൽ അടിസ്ഥാന ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം വർധിച്ചു. 2-ാം ദിവസം, 0.00005%, 0.0001%, 0.0003% എന്നീ സാന്ദ്രതകളിലെ സമ്പർക്കത്തിലും ലാർവയുടെ ഉപരിതല പാളിയിലെ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ മെംബ്രേൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ ഉയർന്നു. 4 മുതൽ 5 ദിവസം വരെയായപ്പോൾ, വിരിയലിനു ശേഷം, ഫലത്തിന്റെ ദിശ മറിഞ്ഞു: ഓക്സിഡേറ്റീവ് ഊർജച്ചെലവ് കുറഞ്ഞു. ബീജസങ്കലനം മുതൽ തുടർച്ചയായ സമ്പർക്കമായിരുന്നാലും, 3-ാം ദിവസം മുതൽ 4-ാം ദിവസം വരെ മാത്രമുള്ള ഹ്രസ്വകാല സമ്പർക്കമായിരുന്നാലും ഇതേ ഫലമായിരുന്നു. അതോടൊപ്പം, മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ശ്വസന കോംപ്ലക്സുകളുടെ ഉപഘടകങ്ങൾക്കുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ 1-ാം ദിവസവും 4-ാം ദിവസവും കുറഞ്ഞു; സ്റ്റിറോയ്ഡ് സംശ്ലേഷണത്തോടും ഗ്ലൂക്കോനിയോജനസിസിനോടും ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളും കുറഞ്ഞു.

രണ്ട് അധിക നിരീക്ഷണങ്ങൾ ഈ ചിത്രം കൂടുതൽ വ്യക്തമാക്കുന്നു. ഉയർന്ന പരിപാലന സാന്ദ്രതയിൽ വിരിയൽ അല്പം നേരത്തെയായിരുന്നു: സമ്പർക്കത്തിന് വിധേയമായ ഭ്രൂണങ്ങൾ 2-ാം ദിവസം മുന്നിലായിരുന്നു; 3-ാം ദിവസത്തോടെ കൺട്രോളുകളും അതേ നിലയിലെത്തി. സമ്മർദ പ്രതികരണ സംവിധാനം തന്നെ മാറ്റമില്ലാതെ നിലനിൽക്കുന്നതായും തോന്നി: 5 ദിവസം പ്രായമുള്ള ലാർവകളെ ചുഴറ്റലിലൂടെ സമ്മർദത്തിന് വിധേയമാക്കിയപ്പോൾ, ഇരുകൂട്ടത്തിലും ശരീരം മുഴുവനായുള്ള കോർട്ടിസോൾ സാധാരണ രീതിയിൽ ഉയർന്നു. അതിനാൽ ഈ അളവുകളിൽ ചായം പൊതുവായ ഒരു വളർച്ചാവിഷമല്ല; എല്ലാ ശരീരപ്രവർത്തന പ്രതികരണങ്ങളെയും അത് മന്ദമാക്കുന്നുമില്ല. ഘട്ടത്തിനനുസരിച്ച് ഊർജ ഉപാപചയത്തെ അത് മാറ്റുന്നു: വിരിയലിനു മുമ്പ് ഉയർത്തുകയും അതിനുശേഷം താഴ്ത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.

പെരുമാറ്റം: രണ്ട് പഠനങ്ങൾ വിയോജിക്കുന്നതെന്തുകൊണ്ട്, രണ്ടും ശരിയാകുന്നതെങ്ങനെ

സമ്പർക്കം നൽകുന്ന പരീക്ഷണരീതികൾ ചേർത്തുവെച്ച് നോക്കുന്നതുവരെ പെരുമാറ്റത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങൾ പരസ്പരവിരുദ്ധമായി തോന്നും. ഒരു വളർച്ചാ-പെരുമാറ്റ സുരക്ഷാ പഠനത്തിൽ, ബീജസങ്കലനത്തിനു ശേഷം ഏകദേശം 6 മണിക്കൂർ മുതൽ ഭ്രൂണങ്ങളെ 10 micromolar വരെയുള്ള സാന്ദ്രതകൾക്ക് വിധേയമാക്കി. 4-ാം ദിവസം വരെ ലായനികൾ ദിവസവും പുതുക്കി. തുടർന്ന് 5-ാം ദിവസവും 6-ാം ദിവസവും ലാർവകളെ ചായമില്ലാത്ത മാധ്യമത്തിലേക്കു മാറ്റി; 6-ാം ദിവസം വെളിച്ചം-ഇരുട്ട് അസേയിൽ ചലനം പരിശോധിച്ചു. ഫലം: മരണനിരക്ക്, വിരിയൽ, രൂപഘടന എന്നിവയിൽ ഗണ്യമായ മാറ്റമില്ല; ചലനത്തിലും പരീക്ഷണ ഇടപെടലിന്റെ ഫലമില്ല. തങ്ങളുടെ പരീക്ഷണ സാഹചര്യങ്ങളിൽ 10 micromolar ഒരു ഉയർന്ന പരിധിയായി ഗവേഷകർ ന്യായമായും ശുപാർശ ചെയ്തു.

ഉപാപചയ പഠനത്തിലെ ചില ഗവേഷകർ കൂടി ഉൾപ്പെട്ട രണ്ടാമത്തെ സംഘം, പരിപാലനം യഥാർഥത്തിൽ നടക്കുന്ന രീതിയിലായിരുന്നു സമ്പർക്കം നൽകിയത്: ബീജസങ്കലനത്തിനു ശേഷം 2 മുതൽ 3 മണിക്കൂർ വരെ പ്രായമായ ഘട്ടം മുതൽ ചായം ഉണ്ടായിരുന്നു; ദിവസവും ഭാഗികമായി പുതുക്കി. സമ്പർക്കം തുടരുമ്പോഴോ അവസാനിച്ചതിന് തൊട്ടുപിന്നാലെയോ പെരുമാറ്റം അളന്നു. ഇതേ പതിവ് സാന്ദ്രതകളിൽ, 24 മണിക്കൂർ അസേയിൽ ലാർവകളുടെ ചലനം കുറഞ്ഞു. വ്യത്യസ്ത സ്ട്രെയിനുകളിലും ലബോറട്ടറികളിലും ഇത് ആവർത്തിക്കാനായി. പെരുമാറ്റ ഫലങ്ങളെ ആശയക്കുഴപ്പത്തിലാക്കുന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനം ഈ ഫലത്തെ സെറോട്ടോണിൻ സംവിധാനത്തിന്റെ പ്രവർത്തനനിലയുമായി ബന്ധപ്പെടുത്തി; ചായത്തിന്റെ അറിയപ്പെടുന്ന മോണോഅമീൻ ഓക്സിഡേസ് തടയൽ സ്വഭാവവുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. ഏറ്റവും ശ്രദ്ധേയമായി, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അടങ്ങിയ ഭ്രൂണ മാധ്യമം SSRI ആയ ഫ്ലൂഓക്സറ്റീനോടുള്ള പ്രതീക്ഷിച്ച ചലനപ്രതികരണത്തെ മറച്ചു. അതിനാൽ നീലവെള്ളത്തിൽ നടത്തുന്ന സ്ക്രീനിങ് അസേ, നിറമില്ലാത്ത വെള്ളത്തിൽ പ്രകടമാകുന്ന ഒരു മരുന്നിന്റെ ഫലം കണ്ടെത്താതിരിക്കാം.

ഇവിടെ യഥാർഥ വൈരുധ്യമില്ല. ഒരു അസേയിൽ സംയുക്തം നീക്കംചെയ്ത് രണ്ടു ദിവസം കഴിഞ്ഞാൽ കണ്ടെത്താവുന്ന ശേഷഫലം ഇല്ലാതിരിക്കാം; അതേസമയം മറ്റൊരു അസേയിൽ അത് ഉള്ളപ്പോൾ സജീവമായി തുടരുകയും ചെയ്യാം. പ്രായോഗികമായി മനസ്സിലാക്കേണ്ടത് ഇതാണ്: ഫലം കണ്ടെത്താത്ത പഠനം ഉയർന്ന സാന്ദ്രതാപരിധിയെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, നിഷ്പക്ഷതയെക്കുറിച്ചുള്ള അവകാശവാദത്തെ അല്ല. ഫലം കണ്ടെത്തിയ പഠനം പ്രസക്തമായ അപകടസാധ്യതയെ വിവരിക്കുന്നു: മിക്ക ലബോറട്ടറികളും ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ ക്രമീകരണത്തിൽ, അളവെടുപ്പ് സമയപരിധിക്കുള്ളിൽ തുടരുന്ന സജീവ സമ്പർക്കം.

ഒരു റെഡോക്സ് അസേയ്ക്കുള്ളിലെ റെഡോക്സ് ചായം

മറ്റൊരു കെണിക്ക് പ്രത്യേകം ഒരു ഖണ്ഡിക ആവശ്യമാണ്; കാരണം അത് മൃഗത്തെയല്ല, അളവെടുപ്പ് സംവിധാനത്തെയാണ് ബാധിക്കുന്നത്. Alamar Blue ഊർജച്ചെലവ് അസേ തന്നെ റെഡോക്സ് രസതന്ത്രമാണ്: റെസാസ്യൂറിൻ നിരോക്സീകരിക്കപ്പെട്ട് ഫ്ലൂറസെന്റ് റെസോറുഫിൻ ആകുന്നു. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും റെഡോക്സ് രസതന്ത്രത്തിൽ പങ്കെടുക്കുന്നു. കോശങ്ങളില്ലാത്ത കൺട്രോളുകളിൽ, പരിപാലനത്തിനുള്ള രണ്ടു സാന്ദ്രതകളും 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷം Alamar Blue ഫ്ലൂറസെൻസ് ചെറുതായെങ്കിലും ഗണ്യമായി കുറച്ചു. മൃഗപരീക്ഷണങ്ങളിൽ, സമ്പർക്കത്തിന് വിധേയമായ ഭ്രൂണങ്ങളെ അസേയ്ക്ക് മുമ്പ് ചായമില്ലാത്ത മാധ്യമത്തിൽ കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് തവണ കഴുകി. വിരിഞ്ഞ ലാർവകളിലെ ജൈവഫലം കോശങ്ങളില്ലാത്ത സാഹചര്യത്തിലെ ഇടപെടലിനെക്കാൾ വലുതായിരുന്നു. അതിനാൽ രണ്ടും ശരിയാണ്: കഴുകിയ മൃഗങ്ങളിൽ യഥാർഥ ഉപാപചയ ഫലം നിലനിൽക്കുന്നു; കഴുകിനീക്കാത്ത ചായം അതിനുമുകളിൽ നേരിട്ടുള്ള രാസപരമായ അളവെടുപ്പ് കൃത്രിമഫലവും ചേർക്കുന്നു. കൺട്രോളുകൾ ഇവ രണ്ടിനെയും വേർതിരിക്കണം; ഇല്ലെങ്കിൽ ഒരു അളവിനും അർഥമുണ്ടാകില്ല. ചായങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള അസേ ഫലങ്ങൾ വായിക്കുന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള പൊതുവായ മാർഗനിർദേശം ഇവിടെ അസാധാരണമാംവിധം പ്രസക്തമാണ്.

വളർച്ചാഘട്ടങ്ങളുടെ സമയരേഖ

ഈ ലേഖനത്തിനായി തയ്യാറാക്കിയ ആദ്യ പ്രത്യേക ഉള്ളടക്കം. പ്രത്യേകം സൂചിപ്പിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിൽ, സാന്ദ്രതകൾ പരിപാലനത്തിനുള്ള രണ്ട് സാധാരണ മൂല്യങ്ങളായ 0.00005%, 0.0001% എന്നിവയാണ്.

ഓർത്തിരിക്കേണ്ട മാതൃക ഉപാപചയ ഫലസൂചകങ്ങളിൽ ആദ്യഘട്ടത്തിലെ വർധനയും പിന്നീടുള്ള കുറവുമാണ്. സമ്പർക്കം തുടരുമ്പോൾ പെരുമാറ്റഫലങ്ങൾ ഉണ്ടായിരുന്നു; ചായം ശരീരത്തിൽ നിന്ന് നീങ്ങിയ ശേഷമുള്ള അവസ്ഥ പരിശോധിച്ച ഏക അസേയിൽ അവ കണ്ടെത്താനായില്ല.

കൺട്രോൾ രൂപകൽപ്പനയ്ക്കുള്ള ചെക്ക്‌ലിസ്റ്റ്

രണ്ടാമത്തെ പ്രത്യേക ഉള്ളടക്കം. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിക്കുന്ന സീബ്രാഫിഷ് പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ ഒരു പരീക്ഷണവുമായി കൂടിച്ചേരുമ്പോൾ ഇത് ഉപയോഗിക്കുക.

1. ചായത്തെ വെള്ളമായല്ല, ഒരു റിയാജന്റായി രേഖപ്പെടുത്തുക. സാന്ദ്രത ശതമാനത്തിലും micromolar-ലും വ്യക്തമാക്കുക. സമ്പർക്കം ആരംഭിക്കുന്നതും അവസാനിക്കുന്നതും ബീജസങ്കലനത്തിനു ശേഷമുള്ള മണിക്കൂറുകളിലോ ദിവസങ്ങളിലോ രേഖപ്പെടുത്തുക; പുതുക്കൽ ക്രമവും ഓരോ അളവെടുപ്പിനു മുമ്പുള്ള ചായനീക്ക ഇടവേളയും വ്യക്തമാക്കുക.
2. ഗവേഷണചോദ്യത്തിന് അനുയോജ്യമായ കൺട്രോളുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുക. പരിശോധനാ രാസവസ്തുവിനെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിന് ചായമില്ലാത്ത കൺട്രോളുകൾ വേണം. പരിപാലനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിന് ചായമില്ലാത്തതും ചായമുള്ളതുമായ വിഭാഗങ്ങളും, ഫംഗസ് നിയന്ത്രണ ഫലത്തിന്റെ രേഖപ്പെടുത്തലും വേണം; കാരണം ഉദ്ധരിച്ച രണ്ടു പഠനങ്ങളും ഫംഗസ് നിയന്ത്രണ ഫലപ്രാപ്തി അളന്നിട്ടില്ല.
3. റെഡോക്സ് അസേകൾക്കു മുമ്പ് കഴുകുക; തുടർന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുക. ചായമില്ലാത്ത മാധ്യമത്തിൽ കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് തവണ കഴുകുക. ഒപ്പം കോശങ്ങളില്ലാത്ത, ചായവും റിയാജന്റും ചേർന്ന കൺട്രോളും നടത്തുക; കാരണം ചായം Alamar Blue സിഗ്നൽ നേരിട്ട് കുറയ്ക്കുന്നു.
4. പെരുമാറ്റവും മോണോഅമീൻ ഫലസൂചകങ്ങളും ഉയർന്ന അപകടസാധ്യതയുള്ളവയായി കാണുക. ചലനം, ഞെട്ടൽ പ്രതികരണം, ഉത്കണ്ഠാസദൃശ പെരുമാറ്റം, ആന്റിഡിപ്രസന്റ്, MAO-തടയൽ എന്നിവയെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങൾ അളവെടുപ്പിനിടെ ചായം ഒഴിവാക്കുകയോ ഓരോ ഫലസൂചകത്തിലും അതിന്റെ നിഷ്പക്ഷത തെളിയിക്കുകയോ വേണം. ഒന്നു മുതൽ രണ്ടു ദിവസം വരെയുള്ള ചായനീക്ക ഇടവേള ഒരു ചലനഫലം ഇല്ലാതാക്കി; എന്നാൽ മറ്റു പരീക്ഷണരീതികൾക്ക് ഇത് തെളിയിച്ചിട്ടില്ല.
5. ഉപാപചയ, മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ഫലസൂചകങ്ങളെ എല്ലാ ഘട്ടങ്ങളിലും ഉയർന്ന അപകടസാധ്യതയുള്ളവയായി കാണുക. ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം, ഊർജച്ചെലവ്, മെംബ്രേൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ, ശ്വസനശൃംഖലയുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ എന്നിവ പരിപാലന സാന്ദ്രതകളിൽ മാറുന്നു; വിരിയലിനു മുമ്പും ശേഷവും വിപരീത ദിശകളിലാണ് മാറ്റം.
6. ഒരു പരീക്ഷണരീതിയിലെ നിഷ്പക്ഷത മറ്റൊന്നിലേക്ക് കടമെടുക്കരുത്. ചായനീക്കത്തിനുശേഷം ഫലം കണ്ടെത്താത്തത് തുടരുന്ന സമ്പർക്കത്തിന് ബാധകമല്ല; രൂപഘടനയിൽ ഫലം കണ്ടെത്താത്തത് ഉപാപചയത്തിനോ മരുന്നുമായുള്ള പരസ്പരപ്രവർത്തനത്തിനോ ബാധകമല്ല; ഒരു സ്ട്രെയിനിലോ താപനിലയിലോ അസേ ദൈർഘ്യത്തിലോ ലഭിച്ച ഫലം മറ്റുള്ളവയ്ക്ക് ബാധകമല്ല.
7. നിങ്ങൾ പിന്തുടർന്ന മാർഗനിർദേശവും അതിനു ബദലായുള്ളതും വ്യക്തമാക്കുക. CCAC, യൂറോപ്യൻ, അല്ലെങ്കിൽ Cold Spring Harbor സാന്ദ്രതകൾ വ്യക്തമായി പേരെടുത്തു പറയുക. OECD ഭ്രൂണപരിശോധന എവിടെയാണ് ചായം ഒഴിവാക്കുന്നതെന്നും സൂചിപ്പിക്കുക; അങ്ങനെ നിങ്ങളുടെ മൃഗങ്ങൾ ഏതു സാഹചര്യത്തിലാണെന്ന് വായനക്കാരന് മനസ്സിലാക്കാം.

മുട്ടകളെ ജീവനോടെ നിലനിർത്താൻ ചായം ഉപയോഗിക്കുന്നതിനെ ഇതൊന്നും എതിർക്കുന്നില്ല. പരിപാലനത്തിലെ ഒരു തിരഞ്ഞെടുപ്പ് പരിശോധിക്കപ്പെടാതെ ഡാറ്റയെ ബാധിക്കുന്നതിനെതിരെയാണ് ഈ വാദം. പാത്രത്തിലെ നീലനിറം ഔഷധശാസ്ത്രപരമായ പ്രവർത്തനമുള്ള ഒരു തന്മാത്രയാണ്. ഇപ്പോൾ ചെറുപ്രായത്തിലുള്ള സീബ്രാഫിഷിനെ മുൻഗണനയോടെ ഉപയോഗിക്കുന്ന, ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ടുള്ള ഉപാപചയ, നാഡീ-പെരുമാറ്റ സ്ക്രീനിങ്ങുകളാണ് ഏറ്റവും കൂടുതൽ വികലമാകാൻ സാധ്യതയുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾ. അത് രേഖപ്പെടുത്തുക, അതിനായി കൺട്രോളുകൾ ഒരുക്കുക, അളക്കുന്നതിനു മുമ്പ് കഴുകിനീക്കുക, അത് നിശ്ശബ്ദമായി പങ്കെടുത്തേക്കാവുന്ന അസേ പരിശോധിക്കുക.