മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ചുള്ള യീസ്റ്റ് പരിശോധനകൾ: ജീവനുള്ള കോശങ്ങളെ എണ്ണുന്നതും ശ്വസനസമയം അളക്കുന്നതും

ലാബ് ബെഞ്ചിൽ രണ്ട് ട്യൂബുകളുണ്ട്. രണ്ടും നീലയാണ്. ഒന്നിൽ, സൂക്ഷ്മദർശിനിയിലൂടെ കാണുന്ന നീല കോശങ്ങൾ ചത്ത യീസ്റ്റിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മറ്റൊന്നിൽ, നീലയിൽനിന്ന് നിറമില്ലാത്തതായി മാറുന്ന ട്യൂബ് യീസ്റ്റ് ജീവനോടെയുണ്ടെന്നും ശ്വസിക്കുന്നുണ്ടെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഒരേ ചായം, വിപരീത വ്യാഖ്യാനങ്ങൾ. ഈ രണ്ട് പരിശോധനകളും തമ്മിൽ തെറ്റിച്ചാൽ എല്ലാ നിഗമനങ്ങളും തലകീഴാകും.

ഈ വ്യത്യാസമാണ് ലേഖനത്തിന്റെ കാതൽ. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒരു റിഡോക്സ് ചായമാണ്: ഓക്സീകരിക്കപ്പെട്ട നിലയിൽ അത് നീലയാണ്; റിഡക്ഷന് വിധേയമായാൽ നിറമില്ലാത്ത ല്യൂക്കോമെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ആകുന്നു. ജീവക്ഷമതാ എണ്ണലിൽ ഈ രാസസ്വഭാവം ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഹ്രസ്വമായ ഒരു സൂക്ഷ്മദർശിനി നിരീക്ഷണത്തിനാണ്. ശ്വസനപരീക്ഷണത്തിൽ ഇത് ഉപയോഗിക്കുന്നത് മിശ്രിതം മുഴുവനിലുമുള്ള പ്രതികരണത്തിന്റെ സമയം അളക്കാനാണ്. ഓരോന്നിനും അതിന്റേതായ നടപടിക്രമവും നിയന്ത്രണങ്ങളും വിമർശനാത്മക വിലയിരുത്തലും ആവശ്യമാണ്.

ജീവക്ഷമതാ എണ്ണൽ: ഹ്രസ്വമായി നിറംപിടിപ്പിക്കുക, ഉടൻ നിരീക്ഷിക്കുക

ബ്രൂവറികളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന നടപടിക്രമമാണ് ഏറ്റവും മാനകീകരിക്കപ്പെട്ട രൂപം. 2% സോഡിയം സിട്രേറ്റിൽ 0.01% w/v മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ തയ്യാറാക്കുക, യീസ്റ്റ് സസ്പെൻഷനുമായി 1:1 അനുപാതത്തിൽ കലർത്തുക, നിശ്ചിതമായ ഒരു ഹ്രസ്വ ഇടവേളയ്ക്കുശേഷം മിശ്രിതം പരിശോധിക്കുക. പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ഇടവേളകൾ Brewing Science Institute കൈപ്പുസ്തകത്തിൽ 1 മുതൽ 2 മിനിറ്റ് വരെയും ഗവേഷണ നടപടിക്രമങ്ങളിൽ ഏകദേശം 5 മിനിറ്റുമാണ്; OIV വൈൻ സൂക്ഷ്മജീവശാസ്ത്ര രീതിയിൽ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ പരിശോധിക്കണമെന്ന് നിർദേശിക്കുന്നു. എണ്ണലിനുള്ള മിശ്രിതത്തിലെ ചായത്തിന്റെ സാന്ദ്രത ഏകദേശം 0.005% ആകും. മെച്ചപ്പെടുത്തിയ Neubauer ചേംബറിൽ മിശ്രിതം നിറച്ച്, ഏകദേശം 400x വർധനയിൽ കടുംനീല കോശങ്ങളെ ജീവക്ഷമതയില്ലാത്തവയായും നിറംപിടിക്കാത്ത കോശങ്ങളെ ജീവക്ഷമതയുള്ളവയായും വർഗീകരിക്കുക. OIV രീതിയിൽ ഇളംനീല കോശങ്ങളെ ജീവനുള്ളവയായി കണക്കാക്കുന്നു; താഴെ ചർച്ച ചെയ്യുന്ന വ്യക്തിനിഷ്ഠതയുടെ പ്രശ്നത്തിലേക്ക് ഇത് ഇതിനകം സൂചന നൽകുന്നു.

കോശസാന്ദ്രത ചേംബറിന്റെ ജ്യാമിതിയിൽനിന്നാണ് കണക്കാക്കുന്നത്. നടുവിലുള്ള 1 mm സമചതുരം മുഴുവൻ എണ്ണുമ്പോൾ, ഓരോ mL-ലുമുള്ള കോശങ്ങളുടെ എണ്ണം N ഗുണം നേർപ്പിക്കൽ ഘടകം ഗുണം 10^4 ആണ്; ഇവിടെ N ആ ഭാഗത്തെ കോശങ്ങളുടെ എണ്ണമാണ്. ഇത് ASBC യീസ്റ്റ് രീതികളിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നു. ജീവക്ഷമത കണക്കാക്കുന്നത് കൂടുതൽ ലളിതമാണ്: നിറംപിടിക്കാത്ത കോശങ്ങളുടെ എണ്ണം ആകെ കോശങ്ങളുടെ എണ്ണംകൊണ്ട് ഹരിച്ച് 100 കൊണ്ട് ഗുണിക്കുക. FEMS ബ്രൂവറി താരതമ്യ പഠനവും OIV രീതിയും പിന്തുടർന്ന്, ജീവക്ഷമത കണക്കാക്കാൻ ഏകദേശം 400 കോശങ്ങൾ എണ്ണുക. ഒരു അതിർത്തിനിയമം സ്ഥിരമായി പാലിക്കുക; ഉദാഹരണത്തിന്, താഴെയും ഇടതുവശത്തുമുള്ള ഗ്രിഡ് വരകളിലെ കോശങ്ങളെ ഉൾപ്പെടുത്തുകയും മുകളിലെയും വലതുവശത്തെയും വരകളിലുള്ളവയെ ഒഴിവാക്കുകയും ചെയ്യുക.

എണ്ണൽ തുടങ്ങുന്നതിനുമുമ്പ് മുകുളങ്ങളെ എങ്ങനെ കണക്കാക്കണമെന്ന് തീരുമാനിക്കണം. മുകുളം മാതൃകോശത്തിന്റെ ഏകദേശം പകുതി വലുപ്പത്തിലെത്തിയാൽ അതിനെ പ്രത്യേക കോശമായി എണ്ണുകയും അതിൽ ചെറുതാണെങ്കിൽ മാതൃകോശത്തോടൊപ്പം കണക്കാക്കുകയും ചെയ്യുന്നതാണ് സാധാരണ രീതി. ഏതു നിയമം തിരഞ്ഞെടുത്താലും എല്ലാ സമചതുരങ്ങളിലും അത് പ്രയോഗിക്കുക; അടുത്തയാൾക്കും അതേ രീതി ആവർത്തിക്കാനായി വർക്ക്‌ഷീറ്റിൽ അത് രേഖപ്പെടുത്തുക.

എണ്ണൽ വർക്ക്‌ഷീറ്റ് (ഇത് അച്ചടിക്കുക)

ഈ ലേഖനത്തിനായി പ്രത്യേകം തയ്യാറാക്കിയതാണ് ഈ വർക്ക്‌ഷീറ്റ്. ഒരു നോട്ട്ബുക്കിലേക്ക് പകർത്തുകയോ ഓരോ സാമ്പിളിനും ഒന്ന് വീതം അച്ചടിക്കുകയോ ചെയ്യുക.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, ഇവിടെ N നിർവചിച്ച ചേംബർ ഭാഗത്തുനിന്നുള്ള എണ്ണമാണ്. ഫലത്തിനരികിൽ നിറംപിടിപ്പിക്കൽ ഇടവേള രേഖപ്പെടുത്തുക; സമയവിവരമില്ലാത്ത ജീവക്ഷമതാ മൂല്യം പുനരാവർത്തിച്ച് ലഭ്യമാക്കാനാവില്ല.

ജീവക്ഷമതാ മൂല്യങ്ങൾ വ്യതിചലിക്കുന്നത് എന്തുകൊണ്ട്

സമയമാണ് ആദ്യത്തെ ഇടപെടൽ; അത് ഇരുദിശകളിലും ബാധിക്കുന്നു. ഉപാപചയപരമായി സജീവമായ കോശങ്ങൾ ചായത്തെ റിഡക്ഷന് വിധേയമാക്കുന്നു. അതിനാൽ നേരത്തെയുള്ള നിരീക്ഷണത്തിൽ, ഈ പ്രക്രിയ പൂർത്തിയാക്കുന്നതിനുമുമ്പുള്ള ജീവനുള്ള കോശങ്ങളെ ചത്തവയായി തെറ്റായി വർഗീകരിക്കാം. എന്നാൽ ദീർഘനേരത്തെ സമ്പർക്കം തന്നെ വിഷകരമാണ്; അത് യഥാർത്ഥത്തിൽ കേടുപാടുകൾ സംഭവിച്ച നീല കോശങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുകയും വ്യാജമായ മരണസൂചന നൽകുന്ന നിറംപിടിക്കൽ സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ ഒരു ലബോറട്ടറി അധ്യാപന നടപടിക്രമം 5 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ വർഗീകരണം നടത്തണമെന്ന് നിർദേശിക്കുന്നു; ഇത് Wisconsin യീസ്റ്റ് അധ്യാപന നടപടിക്രമത്തിൽ രേഖപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ചുള്ള വർഗീകരണം സമയത്തെ ആശ്രയിക്കുന്നു എന്നതാണ് സൂക്ഷ്മമായി പറയാവുന്ന നിഗമനം. അതിനാൽ ഒരു ഹ്രസ്വ ഇടവേള നിശ്ചയിച്ച് ഒരു പരമ്പരയിലെ എല്ലാ സാമ്പിളുകളിലും അത് സ്ഥിരമായി പാലിക്കുക.

കുറഞ്ഞ ജീവക്ഷമതയുള്ള സാമ്പിളുകളിൽ രണ്ടാമതൊരു പക്ഷപാതമുണ്ട്. ഏകദേശം 80%-ൽ താഴെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ യഥാർത്ഥ ജീവക്ഷമതയെക്കാൾ ഉയർന്ന മൂല്യം നൽകാമെന്ന് മാനകീകരിച്ച രീതി മുന്നറിയിപ്പ് നൽകുന്നു; കാരണം, ചായത്തെ ഇപ്പോഴും റിഡക്ഷന് വിധേയമാക്കുന്ന കോശങ്ങൾക്ക് പ്രത്യുത്പാദനശേഷി നിലനിൽക്കണമെന്നില്ല. ജീവക്ഷമത ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞ സാഹചര്യങ്ങളിലെ ഇതേ വിശ്വാസ്യതക്കുറവ് ബ്രൂവിങ് സാഹിത്യവും വിവരിക്കുന്നു. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ വേഗത്തിലുള്ള ഏകദേശ വിലയിരുത്തലായി കാണുക. ഒരു കൾച്ചർ വീണ്ടും ചേർത്ത് ഉപയോഗിക്കുന്നത് പോലുള്ള, കുറഞ്ഞ ജീവക്ഷമതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട നിർണായക തീരുമാനങ്ങൾ പ്ലേറ്റ് എണ്ണലിലൂടെയോ അനുബന്ധമായ മറ്റൊരു നിറംപിടിപ്പിക്കൽ രീതിയിലൂടെയോ സ്ഥിരീകരിക്കുക.

സാമ്പിൾ മാട്രിക്സിന്റെ സ്വാധീനങ്ങളാണ് മൂന്നാമത്തേത്. OIV രീതി ഏകദേശം pH 4.6-ൽ നടത്തുന്നു; ശക്തമായി ബഫർ ചെയ്ത താഴ്ന്ന pH ഉള്ള സാമ്പിളുകൾ ചായത്തിന്റെ ശരിയായ പ്രവർത്തനം തടയുമെന്ന് അത് മുന്നറിയിപ്പ് നൽകുന്നു. പഞ്ചസാര 100 g/L-ൽ കൂടുതലുള്ളപ്പോൾ കോശങ്ങൾ തെറ്റിദ്ധരിപ്പിക്കുന്ന വിധത്തിൽ ഇളംനീലയായി കാണപ്പെടുന്നതിനാൽ പരിശോധന ഒഴിവാക്കാനും നിർദേശിക്കുന്നു. നിറംപിടിപ്പിക്കലിലെ pH താരതമ്യം ചെയ്ത ഒരു പരീക്ഷണത്തിൽ, പരിശോധിച്ച പരിധിയിലുടനീളം സംവേദനക്ഷമത ഗണ്യമായി മാറുന്നതായി കണ്ടെത്തി; ഇത് pH-നെ ആശ്രയിക്കുന്ന മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ രീതിയെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. അവശിഷ്ടങ്ങൾ മറ്റൊരു കെണിയാണ്: അശുദ്ധമായ മാഷുകളിലെ നിറംപിടിച്ച കണങ്ങൾ ചത്ത കോശങ്ങളെപ്പോലെ തോന്നുകയും പരിശോധന നടത്തുന്നവർക്കിടയിലെ വ്യത്യാസം വർധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

ഈ വ്യത്യാസം കേവലം അനുഭവവിവരമല്ല; അളന്ന് രേഖപ്പെടുത്തിയതാണ്. FEMS യീസ്റ്റ് താരതമ്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത ആറുമാസത്തെ ബ്രൂവറി പരീക്ഷണത്തിൽ, ആവർത്തിച്ച മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അളവുകളുടെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ ശരാശരി 6.1% ആയിരുന്നു; ഓക്സോനോൾ ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രിയിൽ ഇത് 0.2% ആയിരുന്നു. ഒരേ സാമ്പിളിൽ രണ്ട് പരിശോധനക്കാരുടെ ഫലങ്ങൾ തമ്മിൽ 13 ശതമാന പോയിന്റ് വരെ വ്യത്യാസമുണ്ടായി. ജീവക്ഷമതാ രീതികളുടെ 2023-ലെ അളവാധിഷ്ഠിത താരതമ്യം ഫ്ലൂറസൻസ് സൂക്ഷ്മദർശിനി നിരീക്ഷണവും ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രിയും ഗണ്യമായി കൂടുതൽ കൃത്യതയുള്ളതാണെന്ന് കണ്ടെത്തി; അതേസമയം പ്രകടനം സ്പീഷീസിനെയും മാട്രിക്സിനെയും ആശ്രയിക്കുന്നതായും കാണിച്ചു. Painting, Kirsop എന്നിവർ നൽകിയ പരമ്പരാഗത രീതിവിവരണം (PMID 24430080) ഇപ്പോഴും പ്രധാന അവലംബമാണ്. വിപുലമായ യീസ്റ്റ് ജീവക്ഷമത, ജീവപ്രവർത്തനക്ഷമത പരിശോധനകളുടെ അവലോകനം (PMID 25154541) മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ നിർണായക പരിശോധനയായല്ല, അനുബന്ധ പരിശോധനകളിലൊന്നായാണ് കാണുന്നത്. ട്രൈപാൻ ബ്ലൂ ഇവിടെ സ്വാഭാവികമായും മെച്ചപ്പെട്ട പകരമാകുന്നില്ല: അത് കോശസ്തരത്തിന്റെ അഖണ്ഡത നഷ്ടപ്പെടുന്നതിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു; മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ചായം ഉൾക്കൊള്ളുന്നതും റിഡക്ഷൻ പ്രവർത്തനവും ചേർന്നാണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. അതിനാൽ സമ്മർദത്തിലായ കോശങ്ങൾ ഈ രണ്ട് ചായങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ വ്യത്യസ്തമായി വർഗീകരിക്കപ്പെടാം.

ശ്വസനപരീക്ഷണം: നീലനിറം അപ്രത്യക്ഷമാകുന്ന സമയം അളക്കുക

രണ്ടാമത്തെ പരിശോധനയിൽ സൂക്ഷ്മദർശിനി ഉപയോഗിക്കുന്നേയില്ല. യീസ്റ്റ്, ഗ്ലൂക്കോസ്, നേർപ്പിച്ച മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ എന്നിവ അടച്ച ട്യൂബിൽ ചേർക്കുന്നു; നീലനിറം അപ്രത്യക്ഷമാകാൻ എത്ര സമയമെടുക്കുന്നു എന്ന് അളക്കുന്നു. കോശങ്ങൾ ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം നടത്തുമ്പോൾ, നീല ചായത്തെ നിറമില്ലാത്ത രൂപത്തിലേക്ക് മാറ്റുന്ന റിഡക്ഷൻ തുല്യങ്ങൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു; അതേസമയം ദ്രവിച്ച ഓക്സിജൻ അതിനെ വീണ്ടും ഓക്സീകരിക്കുന്നു. കോശങ്ങൾ ഓക്സിജന്റെ അളവ് കുറച്ചുകഴിഞ്ഞാൽ, ആകെ റിഡക്ഷൻ മേൽക്കൈ നേടുകയും ട്യൂബിലെ നിറം നഷ്ടപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ അന്തിമബിന്ദു ശ്വസനം, ചായത്തിന്റെ സാന്ദ്രത, ഓക്സിജന്റെ ലഭ്യത എന്നിവയുടെ സന്തുലനത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു. അതിനെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ റിഡക്ഷൻ സമയമെന്നോ നിറനഷ്ട സമയമെന്നോ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യണം; തന്മാത്രാ ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗത്തിന്റെ നേരിട്ടുള്ള നിരക്കായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യരുത്.

സമയം സൗകര്യപ്രദമായ പരിധിയിൽ ലഭിക്കാൻ, ജീവക്ഷമതാ പരിശോധനയിലേതിനെക്കാൾ വളരെ നേർപ്പിച്ച ചായം ഉപയോഗിക്കുക. AQA A ലെവൽ നിർബന്ധിത പ്രായോഗിക പരീക്ഷണ കൈപ്പുസ്തകം ഇത് നന്നായി മാനകീകരിക്കുന്നു: ഏകദേശം 30 C വരെ ചൂടാക്കിയ 100 mL വെള്ളത്തിൽ 1 g ഗ്ലൂക്കോസ്, ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് തൊട്ടുമുമ്പ് ചേർക്കുന്ന 5 g ഉണക്കിയ യീസ്റ്റ്, 1% സ്റ്റോക്ക് ദ്രാവകത്തിന്റെ 0.1 mL എടുത്ത് 100 mL വരെ നേർപ്പിച്ച് തയ്യാറാക്കുന്ന ഏകദേശം 0.001% പ്രവർത്തന ചായദ്രാവകം. 2 mL യീസ്റ്റ്-ഗ്ലൂക്കോസ് സസ്പെൻഷൻ 2 mL പ്രവർത്തന ചായദ്രാവകവുമായി കലർത്തുക, പരീക്ഷണ താപനിലയിലെത്തിച്ച് സ്ഥിരപ്പെടുത്തുക, ഒരിക്കൽ 10 സെക്കൻഡ് കുലുക്കുക, ടൈമർ ആരംഭിക്കുക, പിന്നെ വീണ്ടും കുലുക്കരുത്. കുലുക്കുന്നത് വീണ്ടും ഓക്സിജൻ പ്രവേശിപ്പിച്ച് ട്യൂബിനെ നീലയാക്കുന്നു; നടപടിക്രമം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഏറ്റവും വലിയ കൃത്രിമ സ്വാധീനം ഇതാണ്. 35 C-ൽ ഈ മിശ്രിതം സാധാരണയായി ഏകദേശം 5 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ നിറം നഷ്ടപ്പെടുത്തണമെന്ന് AQA പറയുന്നു. പരീക്ഷണ ശരാശരികൾ 20 C-ൽ 275 s, 35 C-ൽ 128 s, 45 C-ൽ 145 s ആയിരുന്നു. ഇവ ഒരു പരീക്ഷണക്രമത്തിൽനിന്നുള്ള ഉദാഹരണങ്ങളാണ്; സർവസാധാരണ മാനദണ്ഡങ്ങളല്ല. നിയന്ത്രിത സാഹചര്യങ്ങളിൽ റിഡക്ഷൻ നിരക്കും ഉപാപചയപരമായി സജീവമായ യീസ്റ്റും തമ്മിലുള്ള അളവാധിഷ്ഠിത ബന്ധത്തെ പ്രത്യേക റിഡക്ഷൻ പഠനങ്ങൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. PMID 25773544 എന്ന നിലയിൽ സൂചികപ്പെടുത്തിയ പഠനവും Yeast (2014)-ലെ പ്രവർത്തനയന്ത്രവിവരണ പഠനവും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.

സമയക്രമ പ്രദർശനം (പ്രത്യേകം തയ്യാറാക്കിയ സാമഗ്രി)

മുകളിൽ വിവരിച്ച AQA മാതൃകയിലുള്ള പരീക്ഷണക്രമം ഉപയോഗിച്ച് ഈ ലേഖനത്തിനായി പ്രത്യേകം തയ്യാറാക്കിയ പ്രദർശനമാണ് താഴെയുള്ള പട്ടിക: 2 mL യീസ്റ്റ്-ഗ്ലൂക്കോസ് മിശ്രിതവും ഏകദേശം 0.001% ഉള്ള 2 mL പ്രവർത്തന ചായദ്രാവകവും ചേർത്ത്, ഒരിക്കൽ 10 സെക്കൻഡ് കുലുക്കിയശേഷം ഇളക്കാതെ ഇൻക്യുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നു. ഒരു വിദ്യാർഥിസംഘം രേഖപ്പെടുത്തേണ്ട രൂപത്തിലുള്ള ഉദാഹരണ അളവുകളാണ് പട്ടികയിൽ നൽകിയിരിക്കുന്നത്. നിരക്ക് സൂചിക എന്നത് 1-നെ സെക്കൻഡിലുള്ള നിറനഷ്ട സമയംകൊണ്ട് ഹരിച്ച മൂല്യമാണ്. ഇതേ ട്യൂബുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പരീക്ഷണം നടത്തി ഈ ഉദാഹരണങ്ങൾക്കുപകരം അളന്ന മൂല്യങ്ങൾ ചേർക്കുക.

A, B, C ട്യൂബുകൾക്കായി താപനിലയ്ക്കെതിരെ നിരക്ക് സൂചിക ഗ്രാഫിൽ രേഖപ്പെടുത്തുക. വക്രം ഉയർന്നശേഷം പരന്നതാകുകയോ താഴുകയോ ചെയ്യുന്നു; എൻസൈമുകൾ നയിക്കുന്ന പ്രവർത്തനത്തിൽ പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന രൂപം ഇതാണ്, നേർരേഖയല്ല. D, E, F ട്യൂബുകൾ ഈ വക്രത്തിലെ ഡാറ്റാ പോയിന്റുകളല്ല. വക്രത്തെ വ്യാഖ്യാനിക്കാൻ സഹായിക്കുന്ന നിയന്ത്രണങ്ങളാണ് അവ.

ഓരോ പരിശോധനയ്ക്കും അർഥം നൽകുന്ന നിയന്ത്രണങ്ങൾ

ഓരോ ശ്വസനപരീക്ഷണത്തിനും ഒപ്പം മൂന്ന് നിയന്ത്രണങ്ങൾ വേണം. തിളപ്പിച്ചതോ കൊന്നതോ ആയ യീസ്റ്റ്, ഗ്ലൂക്കോസ്, ചായം എന്നിവ ചേർത്ത മിശ്രിതം നീലയായി തുടരണം; വേഗത്തിലുള്ള റിഡക്ഷൻ ജീവനുള്ള കോശങ്ങളുടെ ഉപാപചയത്തെ ആശ്രയിക്കുന്നുവെന്ന് ഇത് തെളിയിക്കുന്നു. ഗ്ലൂക്കോസ് ചേർക്കാതെ ജീവനുള്ള യീസ്റ്റും ചായവും ചേർത്ത മിശ്രിതം ഒരു സബ്‌സ്ട്രേറ്റ് നിയന്ത്രണമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, യീസ്റ്റ് ആന്തരിക സംഭരങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനാൽ പതുക്കെയുള്ള നിറനഷ്ടം പ്രതീക്ഷിക്കാം. യീസ്റ്റ് ഇല്ലാതെ ഗ്ലൂക്കോസും ചായവും ചേർത്ത മിശ്രിതമാണ് രാസ ബ്ലാങ്ക്. കോശങ്ങളൊന്നുമില്ലാതെയും ക്ഷാരസ്വഭാവമുള്ള ഗ്ലൂക്കോസ് ദ്രാവകത്തിന് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ റിഡക്ഷന് വിധേയമാക്കാനാകുന്നതിനാൽ ഇത് അനിവാര്യമാണ്.

ജീവക്ഷമതാ എണ്ണലിന് മറ്റൊരു തരത്തിലുള്ള നിയന്ത്രണമാണ് വേണ്ടത്: നടപടിക്രമത്തിലെ സ്ഥിരത. ഒരേ ചായ സ്റ്റോക്ക് ദ്രാവകം, ഒരേ കലർത്തൽ അനുപാതം, ഒരേ നിറംപിടിപ്പിക്കൽ ഇടവേള, ഒരേ ചേംബർ ഭാഗം, ഒരേ മുകുള-അതിർത്തി നിയമങ്ങൾ എന്നിവ പാലിക്കുക; സാധ്യമെങ്കിൽ സാമ്പിൾ വിവരങ്ങൾ അറിയാതെ എണ്ണുക. രണ്ട് പരിശോധനക്കാരുടെ ഫലങ്ങൾ തമ്മിൽ പത്ത് പോയിന്റ് വ്യത്യാസമുണ്ടെങ്കിൽ, സാധാരണയായി വർക്ക്‌ഷീറ്റ് കാരണം വെളിപ്പെടുത്തും: വ്യത്യസ്ത സമയം, നീലനിറം നിർണയിക്കുന്ന വ്യത്യസ്ത പരിധി, അല്ലെങ്കിൽ വ്യത്യസ്ത മുകുളനിയമങ്ങൾ. നിറംപിടിപ്പിച്ച കോശങ്ങൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന്റെയും നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന്റെയും സാങ്കേതികരീതികൾ ലളിതമായ ബാക്ടീരിയ നിറംപിടിപ്പിക്കൽ രീതികളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. വിവിധ സാമ്പിളുകളിൽ ഈ ചായം എന്തെല്ലാം അടയാളപ്പെടുത്തുന്നു എന്നതിന്റെ വിശാലമായ പരിചയം സൂക്ഷ്മദർശിനി നിറംപിടിപ്പിക്കൽ അറ്റ്ലസിൽ ലഭ്യമാണ്. നീലനിറത്തിന്റെ ഏത് തീവ്രതയും അളവാധിഷ്ഠിതമായി വായിക്കുന്നതിനു പിന്നിലെ ഭൗതികശാസ്ത്രം മനസ്സിലാക്കാൻ, സാഹചര്യങ്ങൾ വ്യക്തമാക്കിയ ആഗിരണ അവലംബം സഹായിക്കുന്നു; ഓരോ ഗുണാങ്കത്തോടൊപ്പവും അതിന്റെ ലായകം, pH, സാന്ദ്രത എന്നിവയുടെ സാഹചര്യങ്ങൾ എന്തുകൊണ്ട് രേഖപ്പെടുത്തണമെന്ന് അത് വിശദീകരിക്കുന്നു.

ചോദ്യത്തിന് അനുസരിച്ച് പരിശോധന തിരഞ്ഞെടുക്കുക. ഇപ്പോൾ എത്ര കോശങ്ങൾ ജീവനോടെയുണ്ട് എന്നത് എണ്ണലിന്റെ ചോദ്യമാണ്; സൂക്ഷ്മദർശിനിയും വർക്ക്‌ഷീറ്റും ഉപയോഗിച്ചാണ് ഉത്തരം കണ്ടെത്തുന്നത്. ഈ കൾച്ചർ എത്ര സജീവമായി ശ്വസിക്കുന്നു എന്നത് ചലനാത്മകതയുടെ ചോദ്യമാണ്; സ്റ്റോപ്പ്‌വാച്ചും നിയന്ത്രിത ട്യൂബുകളും ഉപയോഗിച്ചാണ് ഉത്തരം കണ്ടെത്തുന്നത്. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ രണ്ടിനും ഉപകരിക്കുന്നു; എന്നാൽ ഒരേ ട്യൂബിൽ ഒരേ സമയത്ത് രണ്ടിനും ഒരിക്കലും ഉപയോഗിക്കാനാവില്ല.