DNA, RNA സ്റ്റെയിനിങ്ങിനുള്ള മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ: ജെലുകളിലെയും മെംബ്രേനുകളിലെയും ഉപയോഗങ്ങൾ

ഒരു വിദ്യാർഥി അഗറോസ് ജെൽ റൺ ചെയ്ത് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നു. തിളക്കമുള്ള ബാൻഡ് പ്രതീക്ഷിച്ചിടത്ത് ഒന്നും കാണുന്നില്ല. അടുത്ത പ്രവർത്തനമേഖലയിൽ, ഒരു പോസ്റ്റ്ഡോക്ടറൽ ഗവേഷകൻ അതേ നീലക്കുപ്പിയിലെ ദ്രാവകം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു നോർത്തേൺ മെംബ്രേൻ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുകയും മൂന്ന് മിനിറ്റിനുള്ളിൽ വ്യക്തമായ റൈബോസോമൽ ബാൻഡുകൾ ലഭിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ജെൽ പരാജയപ്പെട്ടെന്ന് വിദ്യാർഥി നിഗമനത്തിലെത്തുന്നു. ജെൽ പരാജയപ്പെട്ടിട്ടില്ല. ഈ രണ്ട് പ്രവർത്തനങ്ങളും വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു; ഒരേ ചായം അവയ്ക്ക് മറുപടി നൽകുന്നത് വ്യത്യസ്ത സംവേദനക്ഷമതയോടെയും വ്യത്യസ്ത പശ്ചാത്തലത്തോടെയും തുടർന്ന് ചെയ്യേണ്ട കാര്യങ്ങൾക്കുള്ള വ്യത്യസ്ത നിയമങ്ങളോടെയുമാണ്.

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ചുള്ള DNA സ്റ്റെയിനിങ്ങിനും RNA സ്റ്റെയിനിങ്ങിനും ഒരേ രസതന്ത്രമാണുള്ളത്, പക്ഷേ ലക്ഷ്യം ഒന്നല്ല. ഒരു ജെലിൽ, സുഷിരങ്ങളുള്ള മാട്രിക്സിനുള്ളിൽ എത്ര ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഉണ്ടെന്നാണ് ചായം കാണിക്കുന്നത്. ഒരു മെംബ്രേനിൽ, ട്രാൻസ്ഫർ വിജയിച്ചോ എന്നും ലെയ്നുകളിൽ ഒരേ അളവിലാണോ സാമ്പിൾ ലോഡ് ചെയ്തതെന്നും അത് കാണിക്കുന്നു. ഈ വ്യത്യാസം വ്യക്തമായാൽ, പ്രോട്ടോക്കോളുകളും കണ്ടെത്തൽ പരിധികളും അനുയോജ്യതാ പരിധികളും മനസ്സിലാക്കാൻ എളുപ്പമാണ്.

ചുരുക്കത്തിലുള്ള ഉത്തരം

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സമതല ഘടനയുള്ള ഒരു കാറ്റയോണിക് ചായമാണ്. ഫോസ്ഫേറ്റിനോടുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ആകർഷണം, ബേസ് ജോഡികൾക്കിടയിലെ ഇന്റർകലേഷൻ, മൈനർ ഗ്രൂവുമായുള്ള ബന്ധം എന്നിവയുടെ സംയോജനത്തിലൂടെ ഇത് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുമായി കോവാലന്റ് ബന്ധമില്ലാതെ, തിരിച്ചുമാറ്റാവുന്ന രീതിയിൽ ബന്ധിക്കുന്നു. ഈ തിരിച്ചുമാറ്റാവുന്ന സ്വഭാവമാണ് പ്രധാനം. ബാൻഡുകൾ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് ദൃശ്യപ്രകാശത്തിൽ കാണാനും രേഖപ്പെടുത്താനും, തുടർന്ന് ക്ലോണിങ്, ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ, വീണ്ടും പ്രോബിങ് എന്നിവയ്ക്കായി സ്റ്റെയിൻ നീക്കുകയോ ശുദ്ധീകരിക്കുകയോ ചെയ്യാനും കഴിയും.

ഇരട്ട ഇഴകളുള്ള DNA-യുടെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അഗറോസ് ജെൽ സ്റ്റെയിനിങ്ങിനുള്ള സാധാരണ ദ്രുതരീതി വെള്ളത്തിൽ 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ആണ്. ഏകദേശം 15 minutes സ്റ്റെയിനിങ്ങും തുടർന്ന് ഏകദേശം 15 minutes വെള്ളത്തിൽ ഡീസ്റ്റെയിനിങ്ങും നടത്തി വെളുത്ത ലൈറ്റ് ബോക്സിൽ നിരീക്ഷിക്കുന്നു. മെംബ്രേനുകൾക്കുള്ള പരമ്പരാഗത നോർത്തേൺ ബ്ലോട്ട് രീതിയിൽ, pH 5.2-ന് അടുത്തുള്ള സോഡിയം അസറ്റേറ്റിൽ 0.02 മുതൽ 0.04 percent വരെ ചായം ഉപയോഗിക്കുന്നു. ട്രാൻസ്ഫറിനും ഇമ്മൊബിലൈസേഷനും ശേഷം ഏതാനും മിനിറ്റ് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത്, വെള്ളത്തിൽ കഴുകി, ഹൈബ്രിഡൈസേഷനുമുമ്പ് സ്റ്റെയിൻ പൂർണമായി നീക്കുന്നു. സംവേദനക്ഷമത പരിമിതമാണ്: നല്ല സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഓരോ ജെൽ ബാൻഡിലും പതിനായിരമല്ല, പതിനുകൾ മുതൽ നൂറുകൾ വരെ നാനോഗ്രാം അളവാണ് കണ്ടെത്താനാകുന്നത്; സൂക്ഷ്മമായ കണക്കുകൾ നൽകുന്ന മാർഗ്ഗനിർദേശങ്ങൾ 0.5 മുതൽ 1 microgram വരെ രേഖപ്പെടുത്തുന്നു. ഇത് എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡ്, SYBR സ്റ്റെയിനുകളുടേതിനെക്കാൾ പല ഓർഡറുകൾ കൂടുതലുള്ള അളവാണ്. മെംബ്രേനുകളിൽ ഒരു പ്രത്യേക ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിനായി പ്രയോജനപ്രദമായ ഒറ്റ കണ്ടെത്തൽ പരിധിയില്ല, കാരണം സ്റ്റെയിൻ പ്രധാനമായും സമൃദ്ധമായ റൈബോസോമൽ RNA-യും ലോഡ് ചെയ്ത മൊത്തം വസ്തുവുമാണ് കാണിക്കുന്നത്. ചില്ലറവിൽപ്പനയിൽ ലഭിക്കുന്ന സപ്ലിമെന്റ് ദ്രാവകം ഈ രണ്ട് രീതികളിലും പകരമായി ഉപയോഗിക്കരുത്. സാധൂകരിച്ച രീതികൾ അനലിറ്റിക്കൽ ഗ്രേഡ് ചായം, നിർവചിച്ച ബഫറുകൾ, RNA ഉൾപ്പെടുമ്പോൾ RNase-രഹിത കൈകാര്യം എന്നിവയാണ് അടിസ്ഥാനമാക്കുന്നത്.

ബന്ധനം എങ്ങനെ പ്രവർത്തിക്കുന്നു, എവിടെയാണ് അത് തെറ്റിദ്ധരിപ്പിക്കുന്നത്

പ്രയോജനപ്രദമായ മാതൃകയ്ക്ക് മൂന്ന് ഭാഗങ്ങളുണ്ട്. ഒന്നാമതായി, ധനചാർജുള്ള വളയഘടന ഋണചാർജുള്ള ഫോസ്ഫേറ്റ് ബാക്ക്ബോണിലേക്ക് ആകർഷിക്കപ്പെടുന്നു. കുറഞ്ഞ ലവണസാന്ദ്രതയിൽ ഈ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഘടകമാണ് പ്രധാനമെന്ന് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിക് പഠനങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നു. അതേസമയം, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ–DNA ബന്ധനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരു സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിക് പഠനത്തിൽ സംഗ്രഹിക്കുന്നതുപോലെ, മോഡലിങ്ങും മോളിക്യുലർ ഡൈനാമിക്സും ഇരട്ട ഇഴകളുള്ള DNA-യിൽ ഇന്റർകലേഷനും മൈനർ ഗ്രൂവ് ബന്ധനവും സ്ഥിരതയുള്ള രീതികളായി കാണിക്കുന്നു. രണ്ടാമതായി, GC-യോട് കുറച്ചധികം മുൻഗണനയുണ്ട്. മോഡലിങ് CpG, GpC ഘട്ടങ്ങൾക്ക് മുൻഗണന നൽകുകയും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഇന്റർകലേഷന്റെ മുൻഗണനകളെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങളിൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ GC കൂടുതലുള്ള ഡ്യൂപ്ലെക്സുകളുമായുള്ള മുൻഗണനാപൂർവമായ ബന്ധം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു. എന്നാൽ AT ഡ്യൂപ്ലെക്സുകളും ബന്ധിക്കുന്നു. പതിവ് സ്റ്റെയിനിങ് സീക്വൻസ്-നിർദിഷ്ടമല്ല. മൂന്നാമതായി, ഒറ്റ ഇഴയുള്ള DNA-യും RNA-യും പ്രധാനമായും ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകളിലൂടെയും ലഭ്യമായ ബേസുകളുമായും ഡ്യൂപ്ലെക്സ് മേഖലകളുമായുമുള്ള സ്റ്റാക്കിങ്ങിലൂടെയും ബന്ധിക്കുന്നു. അതുകൊണ്ടാണ് നീളം, സീക്വൻസ്, ദ്വിതീയ ഘടന എന്നിവയ്ക്കനുസരിച്ച് സ്റ്റെയിനിങ്ങിന്റെ തീവ്രത മാറുന്നത്.

ഇതിൽനിന്ന് രണ്ട് ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാകുന്നു. ബന്ധനം കോവാലന്റ് അല്ലാത്തതിനാൽ, കഴുകുമ്പോൾ ചായം നീങ്ങിപ്പോകുന്നു. പ്രത്യേകം ഫിക്സ് ചെയ്തില്ലെങ്കിൽ പോളിഅക്രിലമൈഡ് ബാൻഡുകൾ വേഗത്തിൽ മങ്ങും. സാധാരണ സ്റ്റെയിനിങ് താൽക്കാലികമായതിനാലാണ് സ്ഥിരമായി ഫിക്സ് ചെയ്യാനുള്ള പ്രത്യേക വകഭേദം നിലവിലുള്ളത്; ഇത് PAGE ജെലുകൾക്കായി Soto, Draper എന്നിവർ വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്. ചായം ഒരു ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ ആയതിനാൽ, ഓക്സിജന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത DNA-യെ ഏറെനേരം തീവ്രപ്രകാശത്തിൽ വയ്ക്കുന്നത് ഗ്വാനിനെ ഓക്സിഡൈസ് ചെയ്യുകയും ഒടുവിൽ ഇഴകളിൽ നിക്കുകൾ ഉണ്ടാക്കുകയും ചെയ്യാം. ഈ സംവിധാനം മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സെൻസിറ്റൈസ് ചെയ്യുന്ന ഗ്വാനിൻ ഓക്സിഡേഷനെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിൽ വിശദീകരിച്ചിട്ടുണ്ട്. വെളുത്ത പ്രകാശത്തിൽ ഹ്രസ്വമായി നിരീക്ഷിക്കുന്നത് പരമ്പരാഗത എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡ് പ്രവർത്തനക്രമങ്ങളിൽ അറിയപ്പെടുന്ന UV കേടുപാടുകൾ ഒഴിവാക്കുന്നു. തുടർ ഉപയോഗത്തിനായി DNA വീണ്ടെടുക്കുമ്പോൾ ഇത് യഥാർഥ നേട്ടമാണ്. ദൃശ്യപ്രകാശം താരതമ്യേന സൗമ്യമാണ്, പക്ഷേ നിരുപദ്രവമല്ല. DNA ക്ലോൺ ചെയ്യാനാണെങ്കിൽ പ്രകാശത്തിൽ വയ്ക്കുന്ന സമയം കുറയ്ക്കുക. ഈ ജാഗ്രതയ്ക്കു പിന്നിലെ വിപുലമായ ഫോട്ടോകെമിസ്ട്രിക്ക് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഫോട്ടോകെമിസ്ട്രിയിലെ രണ്ട് പാതകൾ കാണുക. ഓക്സിഡൈസ് ചെയ്ത രൂപം ബന്ധിക്കുന്നതും റിഡ്യൂസ് ചെയ്ത രൂപം ബന്ധിക്കാത്തതും വിശദീകരിക്കുന്ന റെഡോക്സ് ജോഡിയെയും ചാർജ് അവസ്ഥകളെയും കുറിച്ച് അറിയാൻ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ ഘടനയുടെയും ഗുണങ്ങളുടെയും രസതന്ത്രം കാണുക.

പ്രവർത്തനം ഒന്ന്: ജെലുകൾക്കുള്ളിലെ സ്റ്റെയിനിങ്

ജെൽ സ്റ്റെയിനിങ് ഒരു ചോദ്യത്തിനാണ് മറുപടി നൽകുന്നത്: ഈ ബാൻഡിൽ നഗ്നനേത്രങ്ങൾകൊണ്ട് കാണാൻ മതിയായ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഉണ്ടോ? അഗറോസിലെ ഇരട്ട ഇഴകളുള്ള DNA ആണ് ഏറ്റവും നന്നായി പഠിക്കപ്പെട്ട സാഹചര്യം. Flores-ന്റെയും സഹപ്രവർത്തകരുടെയും യഥാർഥ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ജെൽ രീതി 1 percent അഗറോസിൽ 0.02 percent ദ്രുതപ്രോട്ടോക്കോൾ സാധൂകരിക്കുകയും തുടർന്ന് വിജയകരമായ വീണ്ടെടുപ്പും ക്ലോണിങ്ങും കാണിക്കുകയും ചെയ്തു. അതേ വിതരണക്കാരന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ IBI Scientific-ന്റെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉൽപ്പന്ന പേജിലും കാണാം. അവിടെ 0.04 percent മെംബ്രേൻ രീതിയും ദ്രുത ജെൽ വകഭേദവും ഒപ്പത്തിനൊപ്പം നൽകിയിരിക്കുന്നു.

പ്രായോഗിക പ്രവർത്തനക്രമം:

1. സാധാരണ രീതിയിൽ ജെൽ റൺ ചെയ്യുക. പരിഷ്കരിച്ച രീതിയിൽ ട്രാൻസ്ഫറോ വേർതിരിവിന്റെ വ്യക്തതയോ സാധൂകരിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിൽ, ഇലക്ട്രോഫോറസിസിനിടെയല്ല, അതിനുശേഷം സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക.
2. ഡിസ്റ്റിൽഡ് വെള്ളത്തിലുള്ള 0.02 percent w/v മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിൽ മുക്കി, മൃദുവായി ഇളക്കിക്കൊണ്ട് ഏകദേശം 15 minutes വയ്ക്കുക.
3. മാട്രിക്സിന്റെ പശ്ചാത്തലനിറം കുറയുകയും ബാൻഡുകൾ വേറിട്ടു കാണുകയും ചെയ്യുന്നതുവരെ പലതവണ വെള്ളം മാറ്റി, ആകെ ഏകദേശം 15 minutes ഡീസ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക.
4. വെളുത്ത പ്രകാശമുള്ള ഇല്യൂമിനേറ്ററിൽ ഉടൻ ഫോട്ടോ എടുക്കുക.

അഗറോസും പോളിഅക്രിലമൈഡും വ്യത്യസ്തമായി പെരുമാറുന്നു. അഗറോസ് മാട്രിക്സിൽ ചായം നിലനിർത്തുന്നതിനാൽ, ഡീസ്റ്റെയിനിങ്ങാണ് മന്ദഗതിയിലുള്ള ഘട്ടം. നേർത്ത പോളിഅക്രിലമൈഡ് ജെലുകൾ വേഗത്തിൽ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യപ്പെടുന്നു, പക്ഷേ ചായം വേഗത്തിൽ നഷ്ടപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു. ഇത് തുടർ ഉപയോഗത്തിനായി ബാൻഡുകൾ മുറിച്ചെടുക്കാൻ സഹായിക്കുമ്പോൾ, ദീർഘകാല രേഖകൾ സൂക്ഷിക്കുന്നതിന് ദോഷകരമാണ്. സ്ഥാപിതമായ Current Protocols ശൈലിയിലുള്ള PAGE രീതികൾ പിന്തുടർന്ന്, പോളിഅക്രിലമൈഡിലെ സിന്തറ്റിക് ഒലിഗോന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ അതേ 0.02 percent രീതി ഉപയോഗിച്ച് ആവർത്തിച്ചുള്ള വെള്ളം കഴുകലുകളോടെ 20 മുതൽ 30 minutes വരെ സമയത്തിനുള്ളിൽ കണ്ടെത്താം. നേർപ്പിച്ച TBE-യിൽ ഏകദേശം 0.0002 percent ഉപയോഗിക്കുന്ന വളരെ നേർപ്പിച്ച വകഭേദങ്ങൾ, തുടർ ഉപയോഗത്തിനുള്ള ഒലിഗോകൾക്കായി പല മണിക്കൂറുകളിലായി പ്രയോഗിച്ചതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. എന്നാൽ അതിനുള്ള തെളിവുകളുടെ അടിത്തറ ദുർബലമാണ്.

DNA ആണോ RNA ആണോ എന്നത് പ്രധാനമാണ്. ഇരട്ട ഇഴകളുള്ള DNA ആണ് ഏറ്റവും ശക്തമായ ഘടനാധിഷ്ഠിത ബന്ധനം നൽകുന്നത്. RNA-യും ഒറ്റ ഇഴയുള്ള DNA-യും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യപ്പെടുന്നു, പക്ഷേ ദുർബലമായും മുൻകൂട്ടി പ്രവചിക്കാൻ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള രീതിയിലുമാണ്. ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് അഗറോസ് RNA ജെലുകൾക്കായി, മിക്ക ലബോറട്ടറികളും ജെലിനുള്ളിലെ നീല സ്റ്റെയിനിങ് ഒഴിവാക്കി ആദ്യം RNA ഒരു മെംബ്രേനിലേക്ക് മാറ്റുന്നു; തുടർന്ന് അവിടെ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നു. ഇതിലൂടെ ദുർബലമായ ജെൽ സിഗ്നലിനുപകരം കൂടുതൽ വ്യക്തമായ മെംബ്രേൻ സിഗ്നലും ലോഡിങ്ങിന്റെ രേഖയും ലഭിക്കുന്നു.

പ്രവർത്തനം രണ്ട്: മെംബ്രേനുകളിലെ സ്റ്റെയിനിങ്

മെംബ്രേൻ സ്റ്റെയിനിങ് മറ്റൊരു ചോദ്യത്തിനാണ് മറുപടി നൽകുന്നത്: ട്രാൻസ്ഫർ വിജയിച്ചോ, ലെയ്നുകൾ താരതമ്യയോഗ്യമാണോ? പരമ്പരാഗത ഉപയോഗം Herrin, Schmidt എന്നിവരുടെ തിരിച്ചുമാറ്റാവുന്ന നോർത്തേൺ ബ്ലോട്ട് സ്റ്റെയിനാണ്. യഥാർഥ രീതിയിൽ pH 5.0-ലുള്ള 50 mM സോഡിയം അസറ്റേറ്റിൽ 0.04 percent ചായം ഉപയോഗിച്ച് 2 മുതൽ 3 minutes വരെ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് വെള്ളത്തിൽ കഴുകുന്നു. ഹൈബ്രിഡൈസേഷനുമുമ്പ് SSPE-യിലെ നേർപ്പിച്ച SDS ഉപയോഗിച്ച് ഇത് നീക്കം ചെയ്യാം.

വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ആധുനിക വകഭേദം ഇങ്ങനെയാണ്:

1. RNA അല്ലെങ്കിൽ ഡീനേച്ചർ ചെയ്ത DNA നൈലോണിലേക്കോ നൈട്രോസെല്ലുലോസിലേക്കോ ട്രാൻസ്ഫർ ചെയ്യുക. തുടർന്ന് സ്റ്റെയിനിങ്ങിനിടെ സാമ്പിൾ നഷ്ടപ്പെടാതിരിക്കാൻ UV ക്രോസ്ലിങ്കിങ്ങിലൂടെയോ ബേക്കിങ്ങിലൂടെയോ ഇമ്മൊബിലൈസ് ചെയ്യുക.
2. നിർബന്ധമല്ലെങ്കിലും പതിവായി ചെയ്യുന്നത്: മെംബ്രേൻ 5 percent അസറ്റിക് ആസിഡിൽ ഏകദേശം 15 minutes നനയ്ക്കുക.
3. pH 5.2-ന് അടുത്തുള്ള 0.3 മുതൽ 0.5 M വരെ സോഡിയം അസറ്റേറ്റിൽ 0.02 മുതൽ 0.04 percent വരെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് 5 മുതൽ 10 minutes വരെ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക.
4. വെള്ളത്തിൽ കഴുകി 5 മുതൽ 15 minutes വരെ ഡീസ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക, രേഖപ്പെടുത്തുക, തുടർന്ന് ഹൈബ്രിഡൈസേഷനുമുമ്പ് ശേഷിക്കുന്ന ചായം നീക്കം ചെയ്യുക.

നോർത്തേൺ പ്രവർത്തനങ്ങളിൽ ധനചാർജുള്ള നൈലോണാണ് പ്രധാനമായും ഉപയോഗിക്കുന്നത്. അതേ അസറ്റിക് ആസിഡ്–അസറ്റേറ്റ് പ്രവർത്തനക്രമം നൈട്രോസെല്ലുലോസിലും പ്രവർത്തിക്കുന്നു. ട്രാൻസ്ഫർ സ്ഥിരീകരിക്കാനും, 28S, 18S ബാൻഡുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യാനും (അല്ലെങ്കിൽ ബാക്ടീരിയൽ RNA-യ്ക്ക് 23S, 16S), ലാഡറുകളും സ്റ്റാൻഡേർഡുകളും അടയാളപ്പെടുത്താനും, മൊത്തം RNA നോർമലൈസേഷന്റെ ഏകദേശ രേഖ സൂക്ഷിക്കാനുമാണ് ചിത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നത്. പ്രസിദ്ധീകരിച്ച നോർത്തേൺ രീതികൾ ലോഡിങ് പരിശോധിക്കാൻ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത റൈബോസോമൽ ബാൻഡുകളുടെ അളവ് നിർണയിക്കുന്നു. നോർമലൈസേഷനായി മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ റൈബോസോമൽ ബാൻഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച ഡയറി സയൻസ് പഠനവും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. സതേൺ മെംബ്രേനുകളും ഇതേ രീതിയിൽ ദൃശ്യമാക്കാം. എന്നാൽ നോർത്തേൺ ലോഡിങ്ങും ട്രാൻസ്ഫറും പരിശോധിക്കുന്നതിനാണ് ഈ ചായത്തിന്റെ ഉപയോഗം കൂടുതൽ സ്ഥാപിതമായിരിക്കുന്നത്. കൂടാതെ, സതേൺ DNA ട്രാൻസ്ഫറിനുമുമ്പ് ഡീനേച്ചർ ചെയ്യുന്നതിനാൽ ജെലിന്റെ സംവേദനക്ഷമതാ കണക്കുകൾ അവിടെ നേരിട്ട് ബാധകമല്ല.

കണ്ടെത്തൽ പരിധികളും പശ്ചാത്തലവും: നീല ചായം പിന്നിലാകുന്നിടങ്ങൾ

താഴെയുള്ള താരതമ്യം ഉദ്ദേശ്യപൂർവം ഏകദേശമാണ്. സ്റ്റെയിന്റെ പ്രകടനം ജെൽ ശതമാനം, ബാൻഡിന്റെ വീതി, ഒപ്റ്റിക്സ്, ഡീസ്റ്റെയിനിങ് കൃത്യമായി പാലിക്കൽ എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. ഓരോ സംഖ്യയെയും കൃത്യമായ സ്പെസിഫിക്കേഷനായി കാണാതെ, അളവിന്റെ ഏകദേശ തോതായി കാണുക.

പരിമിതമായ സിഗ്നൽ ഉപയോഗയോഗ്യമാണോ എന്ന് തീരുമാനിക്കുന്നത് പശ്ചാത്തല നിയന്ത്രണമാണ്. ബന്ധിക്കാത്ത ചായത്തിന് തീവ്രനിറമുള്ളതിനാൽ, ബന്ധിച്ച ചായം നീക്കാതെ ബന്ധിക്കാത്ത ചായം നീക്കുന്നതിലൂടെയാണ് കോൺട്രാസ്റ്റ് ലഭിക്കുന്നത്. കൂടുതൽ സാന്ദ്രതയുള്ള സ്റ്റെയിൻ അപൂർവമായേ സംവേദനക്ഷമത കൂട്ടൂ. പ്രധാനമായും അത് ഡീസ്റ്റെയിനിങ് സമയം കൂട്ടുകയാണ് ചെയ്യുന്നത്. ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ ജെൽ, മെംബ്രേൻ, ക്യാമറ എന്നിവയിൽ ഒരു ഡൈല്യൂഷൻ സീരീസ് പരീക്ഷിക്കുക. സംയോജിത സാന്ദ്രത ഇൻപുട്ടിന്റെ അളവിന് ആനുപാതികമായി തുടരുന്ന പരിധി മാത്രം ഉപയോഗിക്കുക. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അർധ-അളവാധിഷ്ഠിത ലോഡിങ് നോർമലൈസേഷനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. എന്നാൽ ഇത് ഉയർന്ന ഡൈനാമിക് റേഞ്ചുള്ള ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് അസേ അല്ല, കാരണം മെംബ്രേൻ ശേഷി, ട്രാൻസ്ഫർ കാര്യക്ഷമത, സാച്ചുറേഷൻ, ഡീസ്റ്റെയിനിങ് എന്നിവ ഓരോ ലെയ്നിലും വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു.

അനുയോജ്യതാ പരിധികൾ: സ്റ്റെയിനിങ്ങിനുശേഷം എന്തെല്ലാം സാധ്യമാണ്

നീല സ്റ്റെയിനിങ്ങിനുശേഷമുള്ള ക്ലോണിങ് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. Flores-ും സഹപ്രവർത്തകരും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത അഗറോസ് ബാൻഡുകൾ മുറിച്ചെടുത്ത് DNA വീണ്ടെടുക്കുകയും ലിഗേറ്റ് ചെയ്ത് ട്രാൻസ്ഫോം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. UV ഉപയോഗിച്ചുള്ള എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡ് സ്റ്റെയിനിങ്ങിനുശേഷമുള്ളതിനെക്കാൾ മികച്ച ക്ലോണിങ് അവർ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. ചായം തന്നെയുള്ള ഏതെങ്കിലും നേട്ടമല്ല, കുറവായ പ്രകാശജന്യ കേടുപാടാണ് സാധ്യതയുള്ള കാരണം. വെളുത്ത പ്രകാശത്തിൽ വയ്ക്കുന്ന സമയം കുറയ്ക്കുകയും വീണ്ടെടുത്ത DNA സാധാരണ ജെൽ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ശുദ്ധീകരണത്തിലൂടെ കടത്തുകയും ചെയ്യുക.

PCR-നും സീക്വൻസിങ്ങിനുമുള്ള തെളിവുകൾ കുറവാണ്. ശേഷിക്കുന്ന ചായം ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുമായി ബന്ധിക്കുന്നതിനാൽ, എൻസൈമാറ്റിക് ഘട്ടങ്ങൾക്കുമുമ്പ് ഡീസ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് ശുദ്ധീകരിക്കുക. നീല ജെലിൽനിന്ന് ശരിയായി ശുദ്ധീകരിച്ച DNA പ്രവർത്തിക്കുമെന്നാണ് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നത്. എന്നാൽ വിവിധ പോളിമറേസുകളിലും സീക്വൻസിങ് രസതന്ത്രങ്ങളിലും നേരിട്ട് കൂടെ എത്തുന്ന ചായം എത്രത്തോളം സഹിക്കപ്പെടുന്നു എന്നത് നന്നായി അളന്നിട്ടില്ല. അത് അനുമാനിക്കരുത്.

ക്രമം കർശനമായി പാലിക്കുമ്പോൾ ബ്ലോട്ട് ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ അനുയോജ്യമാണ്: ട്രാൻസ്ഫർ ചെയ്യുക, ഇമ്മൊബിലൈസ് ചെയ്യുക, സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക, രേഖപ്പെടുത്തുക, ഡീസ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക, ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യുക. ഇതാണ് Herrin, Schmidt എന്നിവരുടെ രൂപകൽപ്പന. ട്രാൻസ്ഫറിനുമുമ്പ് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നതോ ഡീസ്റ്റെയിനിങ് ഒഴിവാക്കുന്നതോ മറ്റൊരു രീതിയാണ്; അതിന് പ്രത്യേക സാധൂകരണം ആവശ്യമാണ്. ചായം നീക്കിയശേഷം സാധാരണ പ്രോബ് സ്ട്രിപ്പിങ്ങും വീണ്ടും പ്രോബിങ്ങും പതിവുപോലെ നടത്താം. അതേ ചായകുടുംബം ഉപയോഗിച്ചുള്ള കോശതല സ്റ്റെയിനിങ്ങിനെക്കുറിച്ചും ഫിക്സ് ചെയ്ത ഫിലിമിന്റെ തത്വം ജീവനുള്ള കോശങ്ങളുടെ രീതികൾക്ക് ബാധകമാകാത്തതിന്റെ കാരണത്തെക്കുറിച്ചും അറിയാൻ മൈക്രോസ്കോപ്പി സ്റ്റെയിനിങ് അറ്റ്ലസ് കാണുക.

സ്ഥിരമായ ഫിക്സേഷൻ വകഭേദം ഒഴിവാക്കിയാൽ, തുടർ ഉപയോഗത്തിനുള്ള അഗറോസിലും നീല ചായം ഉപയോഗിച്ച് സ്ഥാനം കണ്ടെത്തിയ PAGE ഒലിഗോകളിലും ബാൻഡ് മുറിച്ചെടുക്കൽ പ്രവർത്തിക്കും. തിരിച്ചുമാറ്റാവുന്ന ഒരു ബൈൻഡറിന് ഡീസ്റ്റെയിനിങ്ങിനുശേഷമുള്ള ഇലക്ട്രോഎല്യൂഷൻ രാസപരമായി സാധ്യമാണ്. എന്നാൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് പ്രത്യേകമായ നിയന്ത്രിത യീൽഡ് ഡാറ്റ കുറവാണ്. എല്യൂഷനുശേഷം ലവണങ്ങൾ നീക്കുകയോ പ്രെസിപ്പിറ്റേറ്റ് ചെയ്യുകയോ ചെയ്യുക.

ആവർത്തിക്കുന്ന പരാജയങ്ങൾ

മങ്ങിയ ജെൽ ബാൻഡുകൾ സാധാരണയായി വർണ്ണാധിഷ്ഠിത സ്റ്റെയിനിന് മതിയായ പിണ്ഡമില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു, പ്രത്യേകിച്ച് ചെറിയ ഒറ്റ ഇഴയുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളിലോ RNA ലക്ഷ്യങ്ങളിലോ. കൂടുതൽ ലോഡ് ചെയ്യുക, പുതിയ സ്റ്റെയിൻ ഉപയോഗിക്കുക, സാന്ദ്രത കൂട്ടുന്നതിനുമുമ്പ് സ്റ്റെയിനിങ് സമയം നീട്ടുക, ഡീസ്റ്റെയിനിങ് നേരത്തേ നിർത്തുക. കോൺട്രാസ്റ്റില്ലാതെ പൂർണമായും നീലയായ ജെൽ സാധാരണയായി അമിത സ്റ്റെയിനിങ്ങിനെയോ വെള്ളം വളരെ കുറച്ചുതവണ മാത്രം മാറ്റിയതിനെയോ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മങ്ങുന്ന PAGE ബാൻഡുകൾ പ്രതീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന രാസസ്വഭാവമാണ്, സ്റ്റെയിനിങ്ങിന്റെ പരാജയമല്ല. വേഗത്തിൽ ഫോട്ടോ എടുക്കുക. മെംബ്രേനിലെ അസമമായ പശ്ചാത്തലം മടക്കുകൾ, കുമിളകൾ, വിരലടയാളങ്ങൾ, അസമമായ ഇളക്കൽ, ഭാഗികമായ ട്രാൻസ്ഫർ എന്നിവയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ കൺട്രോൾ ഇല്ലാതെ അതിനെ അസമമായ ലോഡിങ്ങായി വ്യാഖ്യാനിക്കരുത്. മങ്ങിയതും പരന്നതുമായ റൈബോസോമൽ പാറ്റേൺ വിഘടനത്തെ സൂചിപ്പിക്കാം. എന്നാൽ അപൂർണമായ ട്രാൻസ്ഫർ, വളരെ കുറച്ച് മൊത്തം RNA (സാധാരണ ലെയ്നുകളിൽ ഏതാനും മുതൽ പതിനുകൾ വരെ മൈക്രോഗ്രാം ഉണ്ടാകും), അമിത ഡീസ്റ്റെയിനിങ് എന്നിവയും കാരണമാകാം. ചായം സമൃദ്ധമായ റൈബോസോമൽ RNA ആണ് കാണിക്കുന്നത്. അത് ഒരു പ്രത്യേക ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് കാണിക്കുന്നില്ല. ആ ജോലി പ്രോബിനാണ്.

അതിശയോക്തിയില്ലാത്ത സുരക്ഷയും കൈകാര്യവും

എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡിനെക്കാൾ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ കൈകാര്യം ചെയ്യാൻ എളുപ്പമാണ്, പക്ഷേ അത് നിരുപദ്രവമല്ല. നിലവിലെ ഒരു MilliporeSigma സുരക്ഷാ ഡാറ്റാ ഷീറ്റ് ചായത്തെ വായിലൂടെ പ്രവേശിക്കുമ്പോഴുള്ള തീവ്ര വിഷാംശത്തിന്റെ Category 4 ആയി വർഗ്ഗീകരിക്കുന്നു; വിഴുങ്ങിയാൽ ഹാനികരമാണ്. Sigma-Aldrich മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ SDS പ്രകാരം അംഗീകൃത മാലിന്യനിർമാർജന മാർഗ്ഗത്തിലൂടെ ഇത് നീക്കം ചെയ്യണം. എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡിന് കൂടുതൽ ശക്തമായ ജനിതകവിഷാംശ മുന്നറിയിപ്പുകളുണ്ട്. അതിന്റെ Sigma-Aldrich എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡ് SDS പ്രത്യുത്പാദന കോശങ്ങളിലെ സംശയിക്കപ്പെടുന്ന പ്രത്യാഘാതങ്ങളും ഉൾക്കൊള്ളുന്നു. Thermo Fisher ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സ്റ്റെയിൻ മാർഗ്ഗനിർദേശത്തിൽ പറയുന്നതുപോലെ, അതിന്റെ ജെലുകളും ദ്രാവകങ്ങളും സാധാരണയായി അപകടകരമായ രാസമാലിന്യമായി വേർതിരിക്കുന്നു. രണ്ടിനും SDS-ഉം സ്ഥാപനത്തിന്റെ നിയമങ്ങളും പാലിക്കുക. ഉണങ്ങിയ ചായം മുറുകെ അടച്ച് ഈർപ്പമില്ലാതെ സൂക്ഷിക്കുക. പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുവദിക്കുന്നത്ര മാത്രം പ്രവർത്തന സ്റ്റെയിൻ വീണ്ടും ഉപയോഗിക്കുക. സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത മെംബ്രേനുകൾ ഫിൽറ്റർ ഷീറ്റുകൾക്കിടയിൽ ഉണങ്ങിയ നിലയിൽ സൂക്ഷിക്കുക. ബാൻഡുകൾ വ്യാപിച്ച് മാഞ്ഞുപോകുന്നതിനുമുമ്പ് ജെലുകളുടെ ഫോട്ടോ എടുക്കുക.

ലാബ് ബെഞ്ചിലെ ഈ ചുരുക്കവാക്യം ഓർക്കുക. ഉയർന്ന ലോഡിൽ വെളുത്ത പ്രകാശത്തിൽ ദൃശ്യമാകുമോ എന്നാണ് ജെലുകൾ പരിശോധിക്കുന്നത്. പ്രോബ് സംവേദനക്ഷമമായ ജോലി ചെയ്യുന്നതിനുമുമ്പ്, ട്രാൻസ്ഫറും ലോഡിങ്ങുമാണ് മെംബ്രേനുകൾ പരിശോധിക്കുന്നത്. പരിമിതമായ സംവേദനക്ഷമത, തിരിച്ചുമാറ്റാവുന്ന ബന്ധനം, നടപടികളുടെ കർശനമായ ക്രമം എന്നിവയോടെ ഒരേ ചായം രണ്ടിനും ഉപയോഗപ്പെടുന്നു.