ബയോഫിലിമുകൾക്കെതിരെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ: പ്രകാശത്താൽ സജീവമാക്കുന്ന ലബോറട്ടറി പഠനങ്ങൾ അളക്കുന്നത് എന്താണ്

ബയോഫിലിം എന്നത് ദ്രാവകത്തിൽ പൊങ്ങിക്കിടക്കുന്ന കോശങ്ങളുടെ കൂട്ടമല്ല. അതൊരു ഘടനയാണ്: ഒരു പ്രതലത്തിൽ പറ്റിപ്പിടിച്ച കോശങ്ങൾ, അവ സ്വയം നിർമ്മിച്ച പോളിസാക്കറൈഡുകൾ, പ്രോട്ടീനുകൾ, കോശബാഹ്യ DNA എന്നിവയുടെ മാട്രിക്സിൽ ഉൾച്ചേർന്നിരിക്കുന്നു; പുറത്തുനിന്ന് അകത്തേക്ക് ഓക്സിജന്റെയും പോഷകങ്ങളുടെയും അളവിൽ വ്യത്യാസങ്ങളുമുണ്ട്. ദ്രാവകത്തിൽ സ്വതന്ത്രമായി നിലനിൽക്കുന്ന ബാക്ടീരിയകളെ മിനിറ്റുകൾക്കുള്ളിൽ നശിപ്പിക്കുന്ന ഒരു സംയുക്തം, അതേ ജീവികൾ ഫിലിമായി വളരുമ്പോൾ പരാജയപ്പെടാൻ കാരണം ഈ ഘടനയാണ്. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെയും ബയോഫിലിമുകളെയും കുറിച്ചുള്ള ഏതൊരു അവകാശവാദവും ഈ ഘടനയുടെ പശ്ചാത്തലത്തിൽ വായിക്കണം. കാരണം, എത്ര ചായം കോശങ്ങളിലെത്തുന്നു എന്നും എത്ര പ്രകാശം ചായത്തിലെത്തുന്നു എന്നും തീരുമാനിക്കുന്നത് മാട്രിക്സാണ്.

ഈ അവലോകനം കൃത്യമായി മൂന്ന് സ്രോതസ്സുകളാണ് ഉൾക്കൊള്ളുന്നത്. ഒന്ന് പശ്ചാത്തലവിവരമാണ്. രണ്ടെണ്ണം ലബോറട്ടറി പരീക്ഷണങ്ങളാണ്. ഈ പങ്കുകൾ വേർതിരിച്ചുനിർത്തുന്നതാണ് ഇവിടെ പിന്തുടരുന്ന രീതി. ഒരു പരീക്ഷണപാത്രത്തിലെ ഫലത്തെ മനുഷ്യനിലെ അണുബാധ ചികിത്സിക്കുന്നതിനുള്ള തെളിവെന്നപോലെ ഉദ്ധരിക്കുക എന്ന, ഈ വിഷയത്തിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ പിശക് ഒഴിവാക്കാൻ ഇത് സഹായിക്കുന്നു.

പശ്ചാത്തല സ്രോതസ്സ് രസതന്ത്രത്തെക്കുറിച്ചാണ്, സൂക്ഷ്മജീവികളെ നശിപ്പിക്കുന്നതിനെക്കുറിച്ചല്ല

മൂന്നിൽ ഏറ്റവും പഴയത് 2005-ൽ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ഫീനോതയസീനിയം ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറുകളുടെ വികസനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരണാത്മക അവലോകനമാണ്. 19-ാം നൂറ്റാണ്ടിലെ ഒരു ചായത്തിൽനിന്ന് കാൻസറിന്റെ ഫോട്ടോഡൈനാമിക് ചികിത്സയ്ക്കും പിന്നീട് ഫോട്ടോഡൈനാമിക് ആന്റിമൈക്രോബിയൽ കീമോതെറാപ്പിക്കും വേണ്ടിയുള്ള ഒരു മുഖ്യ സംയുക്തമായി മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ വളർന്നുവന്നത് അത് വിവരിക്കുന്നു. ഘടനയും പ്രവർത്തനവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധമാണ് അതിന്റെ സംഭാവന: ക്രോമോഫോറിന്റെ മെത്തിലേഷൻ കൊഴുപ്പിനോടുള്ള ആകർഷണം, സിംഗ്ലെറ്റ് ഓക്സിജൻ ഉൽപ്പാദനം, പ്രകാശസഹായത്തോടെ ബാക്ടീരിയകളെ നശിപ്പിക്കുന്ന ശേഷി എന്നിവ വർധിപ്പിക്കുന്നു; അതേസമയം, പ്രവർത്തനക്ഷമത കുറഞ്ഞ ല്യൂക്കോ രൂപത്തിലേക്കുള്ള നിരോക്സീകരണം മന്ദഗതിയിലാക്കുന്നു. ഈ മേഖലയിലെ പ്രശ്നവും അത് വ്യക്തമായി പറയുന്നു. മിക്ക റിപ്പോർട്ടുകളും സാധാരണ വാണിജ്യ ചായങ്ങളാണ് ഉപയോഗിച്ചത്; അവയുടെ വ്യുത്പന്നങ്ങളുടെ വികസനം താരതമ്യേന കുറവായിരുന്നു.

നിങ്ങളുടെ ധാരണയിലെ പ്രവർത്തനരീതി വിശദീകരിക്കുന്ന ഭാഗത്തിനായി ആ അവലോകനം ഉപയോഗിക്കുക: പ്രകാശം ചായത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു; ട്രിപ്ലെറ്റ് അവസ്ഥ Type II ഊർജ കൈമാറ്റത്തിലൂടെ ഓക്സിജനുമായി ഇടപെട്ട് സിംഗ്ലെറ്റ് ഓക്സിജനോ, Type I ഇലക്ട്രോൺ കൈമാറ്റത്തിലൂടെ റാഡിക്കലുകളോ സൃഷ്ടിക്കുന്നു. ഇങ്ങനെ ഒന്നിലധികം ഘടകങ്ങളിലൂടെയുള്ള ആക്രമണം നടക്കുന്നതിനാലാണ് പരമ്പരാഗത പ്രതിരോധരീതികൾ ഫോട്ടോഡൈനാമിക് നശീകരണത്തിനെതിരെ അത്ര ഫലപ്രദമാകാത്തത്. ലോഗ് കുറവിന് തെളിവായി ഇത് ഉദ്ധരിക്കരുത്. അത്തരമൊരു കുറവും ഇത് അളന്നിട്ടില്ല. ഈ പ്രവർത്തനരീതിക്ക് പിന്നിലെ വിപുലമായ പ്രകാശരസതന്ത്രം ഫോട്ടോഡൈനാമിക് ചികിത്സയുടെ തെളിവുസമാഹാരത്തിൽ വിശദീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. ഒരു പ്രത്യേക വിളക്കിന് ഈ പ്രവർത്തനം സാധ്യമാക്കാനാകുമോ എന്ന് നിർണയിക്കുന്ന തരംഗദൈർഘ്യനിയമങ്ങൾ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ചുവന്ന പ്രകാശം ആഗിരണം ചെയ്യുന്നതെങ്ങനെ എന്ന ലേഖനത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.

രണ്ട് ബയോഫിലിം പരീക്ഷണങ്ങൾ, രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ഫലസൂചികകൾ

രണ്ട് പരീക്ഷണപ്രബന്ധങ്ങളും വായിലെ ബയോഫിലിമുകളിൽ 660 nm-ൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ ഫോട്ടോഡൈനാമിക് പ്രവർത്തനം പരിശോധിക്കുന്നു. എന്നാൽ മറ്റേതാണ്ട് എല്ലാ കാര്യങ്ങളിലും അവ വ്യത്യസ്തമാണ്. വ്യത്യസ്ത സൂക്ഷ്മജീവിസമൂഹങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത പ്രായങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത ചായ ഫോർമുലേഷനുകൾ, വ്യത്യസ്ത പ്രകാശ ഡോസുകൾ, എല്ലാറ്റിനുമുപരി വ്യത്യസ്ത ഫലസൂചികകൾ. ആ വ്യത്യാസമാണ് ഈ ലേഖനത്തിന്റെ കേന്ദ്രവിഷയം; താഴെയുള്ള താരതമ്യപ്പട്ടികയും അതാണ് അവതരിപ്പിക്കുന്നത്.

ആദ്യത്തേത് 2024-ൽ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച മോണയ്ക്കടിയിലെ പക്വമായ, പല സ്പീഷീസുകളുള്ള ബയോഫിലിമിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഇൻ വിട്രോ പഠനമാണ്. കാൽഗറി ബയോഫിലിം ഉപകരണത്തിലെ പോളിസ്റ്റൈറീൻ പിന്നുകളിൽ മുപ്പത്തിമൂന്ന് സ്പീഷീസുകളെ ഒരുമിച്ച് വളർത്തി. ഓക്സിജനില്ലാത്ത സാഹചര്യത്തിൽ പോഷണം നൽകി, 72 മണിക്കൂറിനുശേഷം വളർച്ചാമാധ്യമം മാറ്റി, നാമമാത്രമായി 7 ദിവസം വരെ വളർച്ച തുടർന്നു. നാനോകണങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെടുത്താത്ത മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ 0.01 ശതമാനം സാന്ദ്രതയിൽ ഉപയോഗിച്ചതിനൊപ്പം, 660 nm ചുവന്ന LED ഏകദേശം 330 mW per square cm തീവ്രതയിൽ 2 mm അകലത്തിൽനിന്ന് 5 മിനിറ്റ് പ്രയോഗിച്ചു. ഇവ ഗുണിച്ചാൽ ഏകദേശം 99 J per square cm ലഭിക്കുന്നു. നാല് വിഭാഗങ്ങളുള്ള വ്യക്തമായ ഫാക്ടോറിയൽ രൂപകൽപ്പനയായിരുന്നു ഇത്: ചികിത്സിക്കാത്ത നിയന്ത്രണവിഭാഗം, പ്രകാശമില്ലാതെ ചായം, ചായമില്ലാതെ പ്രകാശം, ചായവും പ്രകാശവും ഒരുമിച്ച്.

രണ്ടാമത്തേത് 2021-ൽ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച വായിൽ ആദ്യം കുടിയേറുന്ന സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ ബയോഫിലിമിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഇൻ വിട്രോ പഠനമാണ്. നാല് സ്ട്രെപ്റ്റോകോക്കസ് സ്പീഷീസുകളെ 1 ശതമാനം സുക്രോസ് ചേർത്ത 96 വെൽ പ്ലേറ്റുകളിൽ 24 മണിക്കൂർ ഒരുമിച്ച് വളർത്തി. 4.65 micromolar സാന്ദ്രതയിൽ ബീറ്റാ സൈക്ലോഡെക്സ്ട്രിൻ നാനോകണങ്ങളുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ആയിരുന്നു ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ. ബയോഫിലിം തടസ്സങ്ങളിലൂടെ ചായം എത്തിക്കാൻ ഉദ്ദേശിച്ച വിതരണ ഫോർമുലേഷനാണിത്. രണ്ട് പ്രകാശസ്രോതസ്സുകളും 660 nm ചുവന്ന പ്രകാശമായിരുന്നു; ഓരോന്നും 90 സെക്കൻഡ് പ്രയോഗിച്ചു. എന്നാൽ ഡോസുകൾ വളരെ വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു: ലേസർ വിഭാഗത്തിൽ 320 J per square cm, LED വിഭാഗത്തിൽ 8.1 J per square cm. നിയന്ത്രണവിഭാഗങ്ങളിൽ പ്രകാശമില്ലാത്ത ചായം, ലേസർ മാത്രം, LED മാത്രം, സലൈൻ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണം, സൂക്ഷ്മജീവിവിരുദ്ധ താരതമ്യമാനദണ്ഡമായി 0.2 ശതമാനം ക്ലോർഹെക്സിഡിൻ എന്നിവ ഉൾപ്പെട്ടു.

7 ദിവസം പഴക്കമുള്ള, 33 സ്പീഷീസുകളടങ്ങിയ ഓക്സിജനില്ലാത്ത സമൂഹവും, 24 മണിക്കൂർ പഴക്കമുള്ള, ആദ്യം കുടിയേറുന്ന 4 സ്പീഷീസുകളുടെ ഫിലിമും വ്യത്യസ്ത അളക്കൽ സംവിധാനങ്ങളാണ്. തുടർന്നുവരുന്ന സംഖ്യകളുടെ ശരാശരി എടുക്കാനാവില്ല.

ഓരോ പഠനവും യഥാർഥത്തിൽ അളന്നത്

പക്വമായ ബയോഫിലിം പഠനത്തിൽ, 485 nm-ൽ വായിച്ച TTC നിരോക്സീകരണത്തിലൂടെയുള്ള ഉപാപചയ പ്രവർത്തനവും, 33 സ്പീഷീസുകൾക്കുള്ള പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിച്ച ചെക്കർബോർഡ് DNA DNA ഹൈബ്രിഡൈസേഷനിലൂടെയുള്ള ബാക്ടീരിയ സമൃദ്ധിയുമായിരുന്നു ഫലസൂചികകൾ. കണ്ടെത്തൽപരിധി ഏകദേശം 10,000 കോശങ്ങളായിരുന്നു. ജീവനക്ഷമമായ സൂക്ഷ്മജീവികളെ എണ്ണുന്നതിനുള്ള പ്ലേറ്റിംഗ്, ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ് ഉപയോഗിച്ച ബയോമാസ് അളക്കൽ, ജീവനുള്ളതും മരിച്ചതുമായ കോശങ്ങളുടെ ഇമേജിംഗ്, വീണ്ടും വളരുന്നുണ്ടോ എന്ന തുടർപരിശോധന എന്നിവ ഉണ്ടായിരുന്നില്ല. LED മാത്രം ഉപയോഗിച്ചപ്പോൾ, LED ഉപയോഗിക്കാത്ത വിഭാഗങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം ഏകദേശം 50 ശതമാനം കുറഞ്ഞു; ചായവും LED-യും ഒരുമിച്ച് ഉപയോഗിച്ചപ്പോൾ ഏകദേശം 55 ശതമാനം കുറഞ്ഞു. ചായം മാത്രം ഉപയോഗിച്ച വിഭാഗം സ്ഥിതിവിവരശാസ്ത്രപരമായി ചികിത്സിക്കാത്ത നിയന്ത്രണവിഭാഗത്തോടൊപ്പം നിന്നു. DNA-യിൽനിന്ന് കണക്കാക്കിയ എണ്ണത്തിൽ, ചായം മാത്രം, LED മാത്രം, ചായവും LED-യും ഒരുമിച്ച് എന്നീ മൂന്ന് വിഭാഗങ്ങളും നിയന്ത്രണവിഭാഗത്തേക്കാൾ ഗണ്യമായി താഴെയായിരുന്നു; ഈ മൂന്നിനുമിടയിൽ ഗണ്യമായ വ്യത്യാസമുണ്ടായിരുന്നില്ല. ഇതിന്റെ നിഗമനം രചയിതാക്കൾ നേരിട്ട് പറയുന്നു: ഈ പ്രയോഗങ്ങൾ ഇതിനകം പറ്റിപ്പിടിച്ച് വളർന്ന പലതരം സൂക്ഷ്മജീവികളടങ്ങിയ ബയോഫിലിമിനെ നശിപ്പിച്ചില്ല. പക്വമായ പെരിയോഡോണ്ടൽ ബയോഫിലിമിന്റെ ഘടന യാന്ത്രികമായി തകർക്കേണ്ടതുണ്ട്; ഫോട്ടോഡൈനാമിക് പ്രയോഗങ്ങൾക്ക് പരമാവധി ഒരു അനുബന്ധത്തിന്റെ പങ്കേ ഉള്ളൂ.

ആദ്യം കുടിയേറുന്ന സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ പഠനത്തിൽ, തിരഞ്ഞെടുത്ത കൾച്ചർ മാധ്യമങ്ങളിൽനിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത ജീവനക്ഷമമായ സൂക്ഷ്മജീവികളായിരുന്നു ഫലസൂചിക; അത് ലോഗാരിത്മിക് സ്കെയിലിൽ രേഖപ്പെടുത്തി. പ്രകാശമില്ലാതെ ചായം ഉപയോഗിച്ച വിഭാഗം സലൈൻ വിഭാഗത്തിൽനിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരുന്നില്ല. പ്രകാശത്താൽ സജീവമാക്കിയ രണ്ട് വിഭാഗങ്ങളും—ലേസറും ആവരണത്തിനുള്ളിലാക്കിയ ചായവും, LED-യും ആവരണത്തിനുള്ളിലാക്കിയ ചായവും—നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണത്തെ അപേക്ഷിച്ച് ജീവനക്ഷമമായ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ എണ്ണം ഏകദേശം 4 log വരെ കുറച്ചു. ആ അളവിൽ ഇത് 10,000 മടങ്ങ് അഥവാ 99.99 ശതമാനം കുറവാണ്. ഇവയിൽ ഒന്നും ക്ലോർഹെക്സിഡിനിൽനിന്ന് സ്ഥിതിവിവരശാസ്ത്രപരമായി വ്യത്യസ്തമായിരുന്നില്ല. പ്രകാശം മാത്രം ഉപയോഗിച്ചതിന്റെയും പ്രകാശമില്ലാതെ ചായം മാത്രം ഉപയോഗിച്ചതിന്റെയും മൂല്യങ്ങൾ പ്രത്യേകം വിശ്വസനീയമായ ലോഗ് സംഖ്യകളായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടില്ല. അതിനാൽ, പ്രബന്ധം പിന്തുണയ്ക്കുന്ന സംഗ്രഹം ഇതാണ്: പ്രകാശത്താൽ സജീവമാക്കിയ, ആവരണത്തിനുള്ളിലാക്കിയ ചായം കുറവ് ഉണ്ടാക്കി; പ്രകാശമില്ലാത്ത ചായം അങ്ങനെ ചെയ്തില്ല; ഈ ചെറുപ്രായമുള്ള ഫിലിം മാതൃകയിൽ കുറവിന്റെ വലുപ്പം അണുനാശക താരതമ്യമാനദണ്ഡത്തിനൊപ്പമായിരുന്നു.

ചികിത്സയ്ക്കുശേഷമുള്ള പുനർവളർച്ചയോ ശേഷിക്കുന്ന ബയോമാസോ മാട്രിക്സ് ഘടനയോ രണ്ട് പ്രബന്ധങ്ങളും അളന്നിട്ടില്ല. CFU കുറയുന്നത് ശേഷിക്കുന്ന മാട്രിക്സിനെക്കുറിച്ച് ഒന്നും പറയുന്നില്ല. ഉപാപചയം കുറയുന്നത് അതിജീവിച്ച സൂക്ഷ്മജീവികളെക്കുറിച്ച് ഒന്നും പറയുന്നില്ല. ആരാണ് ജീവനോടെ ഉള്ളതെന്ന് DNA എണ്ണത്തിന് പറയാനാവില്ല.

പരിശോധനാരീതിയുടെയും ഫലസൂചികകളുടെയും താരതമ്യം

ഈ പട്ടികയാണ് ലേഖനത്തിലെ താരതമ്യവിഭവം. ഒരു പഠനം എന്താണ് തെളിയിക്കുന്നതെന്ന് കാണാൻ ഒരു നിരയിലൂടെ വായിക്കുക; ഏത് ചോദ്യങ്ങൾക്കാണ് രണ്ട് പഠനങ്ങളും ഉത്തരം നൽകാത്തതെന്ന് കാണാൻ ഒരു കോളത്തിലൂടെ താഴേക്ക് വായിക്കുക.

മൂന്ന് വ്യത്യാസങ്ങൾ ഊന്നിപ്പറയേണ്ടതുണ്ട്. ഒന്നാമതായി, പക്വമായ മാതൃകയിൽ ഉപാപചയത്തിലെ പ്രഭാവത്തിന്റെ ഏതാണ്ട് മുഴുവനും പ്രകാശം മാത്രം ഉപയോഗിച്ച വിഭാഗം വിശദീകരിക്കുന്നു. അതിനാൽ 55 ശതമാനം എന്ന സംഖ്യ ചായം മുഖേനയുള്ള നശീകരണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നില്ല. രണ്ടാമതായി, ചെറുപ്രായമുള്ള മാതൃകയിൽ പ്രകാശമില്ലാത്ത ഫോർമുലേഷൻ പ്രവർത്തനരഹിതമാണ്; പ്രകാശത്തോടൊപ്പം മാത്രമാണ് പ്രഭാവം പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നത്. ഇതാണ് പ്രകാശസജീവീകരണത്തിന്റെ അടയാളം. മൂന്നാമതായി, DNA-യിൽനിന്ന് കണക്കാക്കിയ എണ്ണത്തിലെ 80 ശതമാനം ഇടിവ് ഗണിതപരമായി ഏകദേശം 0.7 log-നോട് അടുക്കുന്നത് അളക്കുന്ന ഘടകം ജീവനക്ഷമമായ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ എണ്ണമാണെങ്കിൽ മാത്രമാണ്. ഇവിടെ അങ്ങനെയല്ല; അതിനാൽ അതിനെ ഒരിക്കലും ലോഗ് അടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള നശീകരണമായി ഉദ്ധരിക്കരുത്. അനുബന്ധ ദന്ത ബയോഫിലിം പശ്ചാത്തലം വായിലെ ബയോഫിലിമും ദന്ത ഗവേഷണവും സംബന്ധിച്ച സമാഹാരത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. പഠനങ്ങളിലുടനീളം മാതൃകകൾ, പ്രയോഗമാർഗങ്ങൾ, ഫലസൂചികകൾ എന്നിവ വേർതിരിക്കുന്നതിനുള്ള പൊതുരീതി ലബോറട്ടറി രീതികളുടെ മാർഗദർശിയിൽ വിശദീകരിച്ചിട്ടുണ്ട്.

ബയോഫിലിം പഠനങ്ങൾ വായിക്കാൻ പ്രത്യേക നിയമങ്ങൾ വേണ്ടതെന്തുകൊണ്ട്

ഒരു മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ബയോഫിലിം ഫലം അതിന്റെ സ്വന്തം പരീക്ഷണപ്ലേറ്റിനപ്പുറം എന്തെങ്കിലും അർഥമാക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നാല് ഘടകങ്ങൾ തീരുമാനിക്കുന്നു.

ബയോഫിലിമിന്റെ പ്രായവും മാട്രിക്സുമാണ് ആദ്യം. പഴക്കമുള്ള ഫിലിമുകൾ കൂടുതൽ കട്ടിയുള്ളതും കൂടുതൽ പരസ്പരബന്ധങ്ങളുള്ളതും ചായത്തിന് ഉള്ളിലേക്ക് കടക്കാൻ കൂടുതൽ പ്രയാസമുള്ളതുമാണ്. സംഘടിതമായ ബയോഫിലിമിലൂടെ ചായം കടക്കുന്നതിനുള്ള പ്രയാസവും പ്രകാശം ശരിയായി വ്യാപിക്കാത്തതുമാണ് പ്രധാന പരിമിതികളെന്ന് 2021-ലെ രചയിതാക്കൾ പറയുന്നു. സൈക്ലോഡെക്സ്ട്രിൻ ആവരണത്തിലാക്കൽ പോലുള്ള വാഹകതന്ത്രങ്ങൾ കൃത്യമായി ഈ പരിമിതിയെ നേരിടാനുള്ള ശ്രമങ്ങളാണ്. അതുകൊണ്ടാണ് ഫോർമുലേഷൻ ഒരു ചെറിയ വിശദാംശമല്ലാതെ പരീക്ഷണത്തിലെ ഒരു ഘടകമാകുന്നത്.

ഡോസ് കണക്കാക്കലാണ് രണ്ടാമത്തേത്. ഒരേ തരംഗദൈർഘ്യത്തിൽ ഇവിടെ ഫ്ലൂയൻസ് മൂല്യങ്ങൾ 8.1 മുതൽ 320 J per square cm വരെ, ഏകദേശം നാല്പത് മടങ്ങ് വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു. വികിരണതീവ്രത 90 mW മുതൽ ഒരു ചതുരശ്ര cm-ന് നിരവധി W വരെ വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു. ഒരേ തരംഗദൈർഘ്യം എന്നത് ഒരേ പ്രകാശപ്രയോഗം എന്നല്ല. ഒരു ഡോസ്–പ്രതികരണ വക്രം നിർവചിക്കാൻ മതിയാകുന്ന വിധത്തിൽ രണ്ട് പഠനങ്ങളും ഡോസ് ക്രമാനുസൃതമായി മാറ്റി പരിശോധിക്കുന്നില്ല.

നിയന്ത്രണവിഭാഗങ്ങളാണ് മൂന്നാമത്തേത്. പ്രകാശമില്ലാത്ത ചായവിഭാഗം ഇല്ലാത്ത പഠനത്തിന് ചായത്തിന്റെ സ്വാഭാവിക വിഷപ്രഭാവം ഒഴിവാക്കാനാവില്ല; പ്രകാശം മാത്രമുള്ള വിഭാഗം ഇല്ലാത്ത പഠനത്തിന് ഏതെങ്കിലും ഫലം പ്രകാശസജീവീകരണത്തിന്റേതാണെന്ന് പറയാനുമാവില്ല. രണ്ട് പ്രബന്ധങ്ങളിലും ഇവ രണ്ടും ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്; അത് അവയുടെ ഒരു ശക്തിയാണ്. പ്രകാശം മാത്രമുള്ള വിഭാഗം എന്തുകൊണ്ട് പ്രധാനമാണെന്ന് പക്വമായ ഫിലിം പഠനം കാണിക്കുന്നു: അതില്ലായിരുന്നെങ്കിൽ ഉപാപചയഫലം ചായത്തിന്റെ പ്രഭാവമായി വായിക്കപ്പെടുമായിരുന്നു.

ഫലസൂചികകളാണ് നാലാമത്തേത്. ജീവനക്ഷമത, ഉപാപചയം, DNA സമൃദ്ധി, ബയോമാസ്, ഘടന, പുനർവളർച്ച എന്നിവ ആറ് വ്യത്യസ്ത അവകാശവാദങ്ങളാണ്. ഇവിടെ ഒരു പ്രബന്ധവും രണ്ടിലധികം അളക്കുന്നില്ല. പ്രത്യേകിച്ച് പുനർവളർച്ച ഒരിടത്തും പരിശോധിച്ചിട്ടില്ല. അതിനാൽ പ്രഭാവം നിലനിൽക്കുന്നുണ്ടോ എന്നത് അളന്നിട്ടില്ലാത്ത കാര്യമാണ്, തെളിയിക്കപ്പെട്ട ഒന്നല്ല.

അണുബാധ ചികിത്സിക്കുന്നതിനെക്കുറിച്ച് ഇതിലൂടെ തെളിയിക്കപ്പെടാത്തത്

ഈ പരീക്ഷണ സംവിധാനങ്ങളിലൊന്നിലും രക്തചംക്രമണം, പ്രതിരോധകോശങ്ങൾ, ഉമിനീർ പ്രവാഹം, മോണച്ചാലിലെ ദ്രവത്തിന്റെ പുതുക്കൽ, യാന്ത്രികമായി അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കംചെയ്യൽ എന്നിവ ഇല്ല. ഒരു വെല്ലിലെ ചായത്തിന്റെ സാന്ദ്രത, മനുഷ്യനിൽ ഏതെങ്കിലും മാർഗത്തിലൂടെ നൽകിയശേഷമുള്ള കലാസാന്ദ്രതയല്ല. ചെറുപ്രായമുള്ളതോ പക്വമായതോ ആയ ഒരു ലബോറട്ടറി ഫിലിമിൽ ഒരിക്കൽ 5 മിനിറ്റോ 90 സെക്കൻഡോ പ്രകാശം പ്രയോഗിക്കുന്നത് ഒരു ചികിത്സാക്രമമല്ല. സ്വതന്ത്രമായി പൂർണമായി ഇല്ലാതാക്കുന്ന രീതിയെന്നതിനു പകരം യാന്ത്രിക നീക്കലിന് സാധ്യതയുള്ള ഒരു അനുബന്ധമായി ഫോട്ടോഡൈനാമിക് പ്രയോഗത്തെ അവതരിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് പക്വമായ ഫിലിം പഠനത്തിലെ രചയിതാക്കൾ തന്നെയും ഇത് പറയുന്നു.

ശരിയായ സംഗ്രഹം പരിമിതവും ഉറച്ചതുമാണ്. പ്രകാശത്താൽ സജീവമാക്കിയ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് പക്വമായ ഒരു ലബോറട്ടറി വായ്-സൂക്ഷ്മജീവിസമൂഹത്തെ നശിപ്പിക്കാതെ അതിന്റെ ഉപാപചയവും DNA-യിൽനിന്ന് കണക്കാക്കിയ സമൃദ്ധിയും കുറയ്ക്കാനാകും; ആ സംവിധാനത്തിൽ ഉപാപചയത്തിലെ കുറവിന്റെ ഭൂരിഭാഗവും പ്രകാശം മാത്രം ഉണ്ടാക്കുന്നതാണ്. പ്രകാശത്താൽ സജീവമാക്കിയ, സൈക്ലോഡെക്സ്ട്രിൻ വഹിക്കുന്ന ചായത്തിന് ചെറുപ്രായമുള്ള ലബോറട്ടറി സ്ട്രെപ്റ്റോകോക്കൽ ഫിലിമിലെ ജീവനക്ഷമമായ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ എണ്ണം നിരവധി പത്തിരട്ടി തോതുകളിൽ കുറയ്ക്കാനാകും; അതേ മാതൃകയിൽ ഇത് ക്ലോർഹെക്സിഡിനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്ന അളവിലാണ്. ഈ രണ്ട് നിരീക്ഷണങ്ങളിലേതെങ്കിലും മനുഷ്യനിലെ അണുബാധയ്ക്കു ബാധകമാണോ എന്നത് വിതരണം, പ്രകാശം എത്താനുള്ള സൗകര്യം, ഓക്സിജൻ, ശരീരഘടന, ക്ലിനിക്കൽ ഫലസൂചികകൾ എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. അവ അളക്കാനായി ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരുന്നില്ല.