Метиленско сино во лабораториските тестови за G6PD: што всушност прави бојата

Студент набљудува две епрувети по инкубацијата. Едната ја добила очекуваната боја. Другата не. Студентот заклучува дека вториот пациент има дефицит на глукоза-6-фосфат дехидрогеназа. Заклучокот можеби е точен, но при расудувањето се прескокнува концептот врз кој се заснова тестот. Ништо во епруветата не го мери ензимот директно. Во епруветата се мери она што го произведува ензимот, со метиленското сино како посредник.

Кога ќе се разбере ова индиректно мерење, постапката, контролите и долгиот список на погрешни резултати веќе не изгледаат произволни.

Краткиот одговор

Метиленското сино во тестирањето за G6PD е редокс-индикатор. Ензимот G6PD создава NADPH, а системите зависни од NADPH го редуцираат синото метиленско сино до неговата безбојна леукоформа (или го користат за пренос на електрони). Нормалната ензимска активност овозможува ефикасна редукција. Намалената активност доведува до бавна или нецелосна редукција. Тоа е целиот сигнал.

Два историски метода ја користат истата боја, но се разликуваат по крајната точка. Ако ги разграничите, најголемиот дел од забуната исчезнува.

Два теста, една боја, различни крајни точки

Првиот е тестот за директна редукција на метиленско сино, опишан од Сас и соработниците, а подоцна евалуиран од Гибс. Тука крајната точка е самата боја: оксидираното сино метиленско сино се редуцира до безбојно леукометиленско сино, а брзината на таа промена го одразува капацитетот за создавање NADPH. Оригиналниот труд за скринингот е индексиран на PubMed под Сас и сор. (1966).

Вториот е тестот на Бруер за редукција на метхемоглобин. Натриум нитритот прво го оксидира хемоглобинот до кафеав метхемоглобин. Метиленското сино потоа дејствува како посредник во преносот на електрони: редуцираното метиленско сино пренесува редукциски еквиваленти на метхемоглобинот, претворајќи го повторно во црвен хемоглобин. Затоа видливата крајна точка е кафеаво наспроти црвено, а не сино наспроти безбојно. Оригиналниот метод е објавен во Билтенот на Светската здравствена организација (Бруер и сор., 1960).

Од хемиска гледна точка, непрецизно е тестот на Бруер да се нарекува тест за обезбојување на бојата. Бојата се менува циклично меѓу своите форми; хемоглобинот ја менува бојата. Дијаграмот подолу ги прикажува двете патеки.

Реакцијата во основата на тестот

G6PD го катализира првиот оксидативен чекор на пентозофосфатната патека:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Зрелите еритроцити во голема мера зависат од оваа патека за NADPH, како што е разгледано во прегледот на Луцато и соработниците во Blood (2020). NADPH го одржува глутатионот во редуцирана состојба и ја штити клетката од оксидативно оштетување. Метиленското сино се вклучува во овој систем како акцептор на електрони. Доволно G6PD обезбедува доволно NADPH, што овозможува ефикасна редукција. Ниското ниво на G6PD го прекинува синџирот уште на првата алка.

Замислете ја бојата како мерач на гориво, а не како мотор. Таа ја покажува достапноста на NADPH. Сè друго што ја менува таа достапност или отчитувањето може да ја помести стрелката без никаква промена во генот.

Како се изведува постапката од типот на Бруер

Формулациите на реагенсите се менувале низ децениите, па опис наменет за настава не смее да се помеша со клинички протокол. Секоја лабораторија ја следи својата валидирана стандардна оперативна постапка. Со оваа напомена, класичната постапка со епрувети се изведува на следниов начин, во облик документиран со три епрувети и 3-часовна инкубација во оваа објавена примена:

1. Епрувета со примерок од пациентот: полна крв со глукоза, натриум нитрит и метиленско сино. Нитритот создава метхемоглобин, глукозата го поддржува метаболизмот на еритроцитите, а бојата овозможува пренос на електрони зависен од NADPH.
2. Оксидирана контрола: крв со нитрит и глукоза, но без метиленско сино. Таа ја покажува кафеавата крајна точка на метхемоглобинот, односно образецот на дефицит.
3. Хемоглобинска контрола: крв со вода. Таа ја покажува црвената крајна точка на хемоглобинот, односно нормалниот образец.
4. Инкубирајте ги сите епрувети на приближно 37 C, обично 3 часа, со нежно мешање.
5. Разредете мал аликвот од секоја епрувета во дестилирана вода за да се лизираат клетките и да се овозможи јасна споредба на боите.
6. Споредете ја епруветата со примерокот од пациентот со двете контроли. Враќањето кон црвена боја укажува на значителен редукциски капацитет. Задржувањето на кафеавата боја укажува на изразен дефицит.

Една историска формулација користела околу 1 mL крв со реагенси со приближни концентрации од 180 mM натриум нитрит, 280 mM декстроза и 0.4 mM метиленско сино. Сметајте ги овие бројки за пример од литературата, а не за универзална спецификација.

Читање на резултатот

Квалитативниот скрининг најдобро разликува околу 30 до 40 проценти од нормалната активност, како што е разгледано во овој преглед во Malaria Journal за недостатоците во откривањето на дефицит на G6PD. Затоа нормален резултат од скринингот значи дека тестот не открил тежок дефицит. Тој не потврдува целосно нормална активност.

Зошто скринингот може да доведе до погрешен заклучок

Ретикулоцитозата по хемолиза е класична причина за лажно нормален резултат. Младите еритроцити и ретикулоцитите содржат повеќе G6PD од старите клетки. За време на акутна хемолитична епизода, најстарите клетки со најголем дефицит можеби веќе се уништени, па останува млада популација чија активност при тестирањето изгледа нормална. Истата биолошка појава ги доведува во заблуда и квантитативните тестови, не само скринингот со боја.

Неодамнешната трансфузија го прикрива дефицитот бидејќи донорските еритроцити внесуваат сопствен ензим во примерокот. Mayo Clinic Laboratories ја наведува трансфузијата меѓу причините за неверодостојни резултати за ензимска активност, заедно со ретикулоцитозата и интерференцијата од леукоцитите.

Хетерозиготните жени се најсложениот случај. Случајната инактивација на X-хромозомот создава мешавина од нормални и дефицитарни еритроцити, а вкупната активност може да се движи од тешко дефицитарна до навидум нормална. Квалитативниот скрининг често не ги открива средните фенотипови. Документацијата на СЗО за тестирање за G6PD детално го разгледува ова ограничување.

Староста на примерокот, температурата на чување, субјективноста при визуелното одредување на крајната точка, хематокритот и квалитетот на реагенсите внесуваат дополнителен аналитички шум покрај овие биолошки влијанија.

Скринингот не е дијагноза

Резултат од скрининг што укажува на дефицит, средна активност или што не е во согласност со клиничката слика бара квантитативен тест за ензимската активност на G6PD. СЗО ја смета квантитативната спектрофотометрија со контролирана температура за референтен пристап. Во тој тест, во хемолизат од еритроцити се додаваат глукоза-6-фосфат и NADP+, а создадениот NADPH се следи преку зголемувањето на апсорбанцата на 340 nm. Брзината на промената е пропорционална на ензимската активност, која обично се нормализира според хемоглобинот и се изразува во единици по грам. Тековната клиничко-лабораториска практика е сумирана во ставката за активност на G6PD во каталогот на тестови на Mayo.

При толкувањето се користи референтниот опсег валидиран од лабораторијата, често изразен во однос на нормалната активност во популацијата, при што дефицитот обично се разгледува околу прагот од 30 проценти, а средната активност над него. Целните профили на производи на СЗО за тестови за G6PD (2022) ја утврдуваат таа дијагностичка рамка. Ако неодамнешна хемолиза или трансфузија го прави фенотипизирањето неверодостојно, повторете го тестирањето откако популацијата на еритроцити повторно ќе се стабилизира; молекуларното тестирање може да даде дополнителни информации, но не го заменува мерењето на ензимската активност.

Разграничување што вреди да се зачува

Метиленското сино во овие тестови е ex vivo лабораториски реагенс. Тоа е различна тема од безбедноста на давање метиленско сино на пациент, која е опфатена во насоките за контраиндикациите за метиленско сино. Биохемијата ги поврзува двете теми, бидејќи и лекот зависи од редукција зависна од NADPH, но боја во епрувета не е доза во крвотокот. За контекст за тоа како бојата се однесува како средство за боење во поинакви услови, видете ги принципите на боење со метиленско сино, а за хемиската група на која ѝ припаѓа — редокс-боите во лабораторијата.

Скринингот проверува дали редукцискиот капацитет изгледа зачуван. Потврдното тестирање проверува колкава количина ензим навистина е присутна. Бојата добро служи за првото прашање, под услов никој да не бара од неа да одговори на второто.