Тестови со метиленско сино кај квасец: броење живи клетки наспроти мерење на времето на респирација

На лабораториската маса стојат две епрувети. И двете се сини. Во едната, сините клетки под микроскоп означуваат мртов квасец. Во другата, епрувета што од сина станува безбојна означува дека квасецот е жив и респирира. Иста боја, спротивни толкувања. Ако ги помешате двата теста, секој заклучок се превртува.

Токму таа разлика е темата на целата статија. Метиленското сино е редокс-боја: во оксидирана состојба е сино, а во редуцирана состојба е безбојно леукометиленско сино. Броењето за процена на вијабилноста ја користи таа хемија во кратко микроскопско набљудување. Експериментот за респирација ја користи во реакција на целата смеса чиј тек се мери со време. Секој бара сопствен протокол, сопствени контроли и сопствена доза скептицизам.

Броење за процена на вијабилноста: кратко боење, брзо отчитување

Протоколот што се користи во пиварството е најстандардизираната верзија. Подгответе 0.01% w/v метиленско сино во 2% натриум цитрат, измешајте го 1:1 со суспензијата од квасец и испитајте ја смесата по краток, однапред утврден интервал. Објавените интервали варираат од 1 до 2 минути во прирачникот на Brewing Science Institute до околу 5 минути во истражувачки протоколи, додека методот на OIV за микробиологија на вино бара испитување во рок од 10 минути. Концентрацијата на бојата во смесата за броење на крај е околу 0.005%. Наполнете подобрена комора на Neubauer и при зголемување од околу 400x класифицирајте ги темносините клетки како невијабилни, а необоените како вијабилни. Во методот на OIV, светлосините клетки се сметаат за живи, што веќе навестува проблем со субјективноста разгледан подолу.

Концентрацијата на клетките се пресметува од геометријата на комората. Кога се брои целиот централен квадрат со страна од 1 mm, бројот на клетки по mL е еднаков на N помножено со факторот на разредување и со 10^4, каде што N е бројот на клетки во таа површина, како што е наведено во методите на ASBC за квасец. Вијабилноста се пресметува поедноставно: бројот на необоени клетки поделен со вкупниот број клетки, помножен со 100. Избројте околу 400 клетки за процена на вијабилноста, според споредбената студија на FEMS за пиварството и практиката на OIV. Доследно користете едно правило за граничните линии, на пример вклучувајте ги клетките на долните и левите линии од мрежата, а исклучувајте ги оние на горните и десните.

Правилото за пупките треба да се утврди пред да започне броењето. Според честа конвенција, пупката се брои како посебна клетка кога ќе достигне околу половина од големината на мајчината клетка, а под таа големина се брои заедно со мајчината клетка. Кое правило и да го изберете, применувајте го во секој квадрат и запишете го на работниот лист за следниот оператор да го повтори.

Работен лист за броење (испечатете го)

Овој работен лист е оригинален материјал за оваа статија. Препишете го во тетратка или испечатете по еден за секој примерок.

Вијабилност (%) = 100 x необоени / (необоени + темносини). Вкупно клетки по mL = N x фактор на разредување x 10^4, каде што N се добива од дефинираната површина на комората. Запишете го интервалот на боење покрај резултатот, бидејќи вредноста за вијабилност без наведено време на отчитување не е репродуктивна.

Зошто вредностите за вијабилност варираат

Времето е првата интерференција и може да влијае во двете насоки. Метаболички активните клетки ја редуцираат бојата, па раното отчитување може да ги затекне живите клетки пред да ја завршат редукцијата и погрешно да ги класифицира како мртви. Но продолженото изложување само по себе е токсично и создава навистина оштетени сини клетки, предизвикувајќи лажно боење што означува смрт. Затоа еден лабораториски наставен протокол пропишува оценување во рок од 5 минути, како што е документирано во наставниот протокол за квасец од Wisconsin. Најсигурно е да се каже дека оценувањето со метиленско сино зависи од времето, па утврдете еден краток интервал и одржувајте го ист за секој примерок во серијата.

Примероците со ниска вијабилност носат втор извор на пристрасност. Стандардизираниот метод предупредува дека метиленското сино може да ја прецени вистинската вијабилност кога таа е под околу 80%, бидејќи клетките што сè уште ја редуцираат бојата не мора да ја задржале способноста за размножување. Пиварската литература ја опишува истата несигурност кога вијабилноста е значително намалена. Сметајте го метиленското сино за брза, приближна процена, а критичните одлуки при ниска вијабилност, како повторното внесување култура за ферментација, потврдете ги со броење колонии на подлога или со дополнително боење.

Ефектите од матрицата се трети. Методот на OIV се изведува при pH околу 4.6 и предупредува дека силно пуферираните примероци со ниска pH-вредност го спречуваат правилното однесување на бојата, а истовремено советува тестот да не се користи при концентрации на шеќер над 100 g/L, кога клетките погрешно изгледаат светлосини. Експериментална споредба на pH-вредностите при боење утврди значително изменета чувствителност низ испитаниот опсег, во согласност со студија за метод со метиленско сино зависен од pH. Остатоците се посебна замка: обоените честички во нечистите комини личат на мртви клетки и ја зголемуваат варијабилноста меѓу операторите.

Таа варијабилност е квантифицирана, а не само анегдотска. Во шестмесечно пиварско испитување објавено во споредбата на FEMS за квасец, мерењата со метиленско сино во дупликат имале просечна стандардна девијација од 6.1%, наспроти 0.2% кај проточната цитометрија со оксонол, при што резултатите на двајца оператори се разликувале до 13 процентни поени за истиот примерок. Квантитативна споредба на методите за вијабилност од 2023 година утврди дека флуоресцентната микроскопија и проточната цитометрија се значително попрецизни, а воедно покажа дека перформансите зависат од видот и матрицата. Класичниот опис на методот од Painting и Kirsop (PMID 24430080) останува референтна точка, а поширокиот преглед на тестовите за вијабилност и виталност на квасец (PMID 25154541) го вбројува метиленското сино меѓу дополнителните, а не конечните тестови. Трипанското сино тука не е автоматски подобар избор: тоа укажува на губење на интегритетот на мембраната, додека метиленското сино укажува на внесување на бојата и редукциска активност, па клетките под стрес може различно да се класифицираат со двете бои.

Експериментот за респирација: измерете го времето до исчезнување на сината боја

Вториот тест воопшто не користи микроскоп. Квасец, глукоза и разредено метиленско сино се ставаат во затворена епрувета, а со часовник се мери колку време е потребно да исчезне сината боја. При метаболизмот, клетките создаваат редукциски еквиваленти што ја претвораат сината боја во нејзината безбојна форма, додека растворениот кислород повторно ја оксидира. Кога клетките ќе ја намалат количината на кислород, преовладува нето-редукцијата и епруветата се обезбојува. Затоа крајната точка ја одразува рамнотежата меѓу респирацијата, концентрацијата на бојата и достапноста на кислород, и треба да се пријавува како време на редукција или обезбојување на метиленското сино, а не како директна стапка на потрошувачка на молекуларен кислород.

Користете многу поразредена боја отколку при процена на вијабилноста, за измереното време да биде во практичен опсег. Прирачникот на AQA за задолжителни практични вежби на ниво A добро го стандардизира ова: 1 g глукоза на 100 mL вода загреана на околу 30 C, 5 g сув квасец додаден непосредно пред употреба и работен раствор на бојата со концентрација околу 0.001%, подготвен со разредување на 0.1 mL од 1% основен раствор до 100 mL. Измешајте 2 mL суспензија од квасец и глукоза со 2 mL работен раствор на бојата, оставете ја смесата да ја достигне температурата на тестирање, протресете еднаш 10 секунди, вклучете го мерачот на време и не протресувајте повторно. Протресувањето повторно внесува кислород и ја враќа сината боја во епруветата, што е најголемиот процедурален артефакт. AQA наведува дека препаратот вообичаено треба да се обезбои во рок од околу 5 минути на 35 C, со просечни времиња од испитувањата од 275 s на 20 C, 128 s на 35 C и 145 s на 45 C. Тоа се примери од една експериментална поставка, а не универзални референтни вредности. Квантитативната врска меѓу стапката на редукција и метаболички активниот квасец во контролирани услови е поткрепена со наменски студии за редукцијата, вклучително и трудот индексиран како PMID 25773544 и механистичката студија во Yeast (2014).

Демонстрација на временскиот тек (оригинален материјал)

Табелата подолу е оригинална демонстрација подготвена за оваа статија со поставката според AQA опишана погоре: 2 mL смеса од квасец и глукоза со 2 mL работен раствор на бојата со концентрација околу 0.001%, едно протресување од 10 секунди, а потоа инкубација без вознемирување. Записите се примерни отчитувања во формат што треба да го користи студентска група, со индекс на стапката дефиниран како 1 поделено со времето на обезбојување во секунди. Изведете го експериментот со истите епрувети и заменете ги овие записи со измерени вредности.

Прикажете го индексот на стапката во зависност од температурата за епруветите A, B и C. Кривата расте, а потоа се израмнува или опаѓа, што е очекуваниот образец за процес поттикнат од ензими, а не права линија. Епруветите D, E и F не се податочни точки на таа крива. Тие се контролите што овозможуваат кривата да се толкува.

Контроли што му даваат значење на секој тест

Секое испитување на респирацијата бара три придружни контроли. Зовриен или убиен квасец со глукоза и боја треба да остане син, со што се потврдува дека брзата редукција зависи од жив метаболизам. Жив квасец со боја, но без додадена глукоза, е контрола за супстратот, но сепак очекувајте бавно обезбојување, бидејќи квасецот ги троши ендогените резерви. Глукоза со боја, но без квасец, е хемиската слепа проба, која е неопходна бидејќи глукозата во алкална средина може да го редуцира метиленското сино и без присуство на клетки.

Броењето за процена на вијабилноста бара поинаков вид контрола: процедурална доследност. Ист основен раствор на бојата, ист сооднос на мешање, ист интервал на боење, иста површина на комората, исти правила за пупките и граничните линии, со броење без увид во идентитетот на примерокот каде што е можно. Кога резултатите на двајца оператори се разликуваат за десет поени, работниот лист обично ја открива причината: различно време на отчитување, различен праг за сината боја или различни правила за пупките. Техниките за подготвување и набљудување обоени клетки се поврзани со методите за едноставно боење бактерии, додека поширок преглед на тоа што означува бојата во различни примероци се наоѓа во атласот за микроскопско боење. За физичката основа на квантитативното отчитување на кој било интензитет на сина боја, референтниот материјал за апсорпција со наведени услови објаснува зошто секој коефициент мора да биде придружен со податоци за растворувачот, pH-вредноста и концентрацијата.

Изберете го тестот според прашањето. Колку клетки се живи во моментов е прашање на броење, на кое се одговара со микроскоп и работен лист. Колку активно респирира оваа култура е кинетичко прашање, на кое се одговара со стоперка и епрувети во контролирани услови. Метиленското сино служи за двете, но никогаш во иста епрувета во исто време.