Метиленско сино во истражувањата со риби-зебри: додаток при одгледувањето и експериментален конфундирачки фактор

Водата за јајца на риби-зебри често е бледосина, а речиси никој не запишува зошто. Бојата е метиленско сино, додадено против габи, а повеќето протоколи го третираат како дел од позадината. Тука „позадина“ е погрешниот поим. Посоодветен е непријавен експериментален фактор: нешто што е присутно во третираните садови, а го нема во контролите, фармаколошки е активно при употребените концентрации и може да ги промени токму крајните показатели што ги мери експериментот.

Оваа разлика е основата на сè што следува. Рутинската заштита од габи при одгледувањето е едно прашање. Дали додатокот е неутрален во однос на вашиот тест е друго. Поновата литература за рибите-зебри дава охрабрувачки одговор на првото, а непријатен на второто.

Што всушност пропишуваат упатствата

Не постои единствен стандард, што е дел од проблемот. Упатствата на Канадскиот совет за грижа за животните дозволуваат 0.5 mg/L, или 0.00005%, во растворот за транспорт на јајца и ларви за да се намали растот на габите. Европските упатства за лабораториски животни опишуваат ембриони што се чуваат во медиум кој често ги содржи истите 0.00005%. Рецептот за E3 на Cold Spring Harbor наведува двојно повеќе, 1 mg/L или 0.0001%, како состојка во рецептот. Наспроти ова стои забележливо изоставување: упатството на OECD за тестирање на токсичност кај ембриони на риби пропишува реконституирана вода за разредување и испитувана хемикалија, без препорака за метиленско сино ниту во верзијата од 2013 година ниту во подоцнежната ревизија. Така, една лабораторија одгледува ембриони на риби-зебри во сина вода со метиленско сино уште од првите часови од животот, друга го спроведува регулаторниот тест со ембриони во бистра вода, а двете го нарекуваат својот медиум нормален. Секој што споредува резултати меѓу лаборатории или обединува историски контролни податоци ја наследува таа недоследност.

За контекст на концентрациите, 0.00005% е околу 1.56 микромоларни, а 0.0001% околу 3.13 микромоларни. Овие бројки се ниски и лесно е да се протолкуваат како премногу ниски за да имаат значење. Студиите подолу ја проверуваат токму таа претпоставка, при токму тие концентрации.

Читателите што доаѓаат од акваристиката, наместо од лабораторијата, ја среќаваат истата молекула во поинакво опкружување, опфатено во аквариумскиот водич за метиленско сино. Хемијата е иста; објаснувањето за тоа како бојата пренесува електрони низ клетките покажува зошто редокс-активно соединение постојано се појавува во трудови за метаболизмот. Она што следува се однесува конкретно на водата за јајца на риби-зебри со метиленско сино.

Метаболизам: ефектот ја менува насоката со развојниот стадиум

Најинформативната студија изложувала риби-зебри со нормален развој од првиот ден од животот до 5 дена по оплодувањето и го мерела оксидативниот метаболизам во секој стадиум, како што опишува објавениот извештај за експериментите со ембрионален метаболизам. Овој образец заслужува внимателно да се објасни бидејќи ја менува насоката.

На 1 ден по оплодувањето, базалната потрошувачка на кислород се зголемила кај изложените ембриони при двете концентрации што се користат при одгледувањето. На 2 дена, потенцијалот на митохондријалната мембрана во површинскиот слој на ларвите бил зголемен при изложување на 0.00005%, 0.0001% и 0.0003%. До 4 до 5 дена, по изведувањето, насоката се сменила: оксидативната потрошувачка на енергија се намалила, без разлика дали изложувањето било континуирано од оплодувањето или само акутно од ден 3 до ден 4. Паралелно, транскриптите за подединиците на митохондријалните респираторни комплекси се намалиле и на 1 и на 4 дена, заедно со транскриптите поврзани со стероидогенезата и глуконеогенезата.

Уште две набљудувања ја изоструваат сликата. При повисоката концентрација за одгледување, изведувањето настапило малку порано: изложените ембриони предничеле на 2 дена, а контролите ги достигнале до ден 3. И самата оска на стресниот одговор изгледала зачувана: кога ларви стари 5 дена биле подложени на стресор со вително движење, кортизолот во целото тело се зголемил нормално во двете групи. Значи, при овие дози бојата не е општ развоен отров и не го потиснува секој физиолошки одговор. Таа го менува енергетскиот метаболизам зависно од стадиумот: нагоре пред изведувањето и надолу потоа.

Однесување: зошто две студии не се согласуваат и зошто двете можат да бидат во право

Литературата за однесувањето изгледа противречна сè додека дизајните на изложувањето не се споредат еден покрај друг. Една студија за развојната и бихевиоралната безбедност изложувала ембриони од околу 6 часа по оплодувањето на концентрации до 10 микромоларни, ги обновувала растворите секојдневно до ден 4, потоа ги префрлила ларвите во медиум без боја за деновите 5 и 6 и на ден 6 ја тестирала локомоцијата во тест со светло-темно. Резултатот: немало значаен ефект врз смртноста, изведувањето или морфологијата, ниту ефект од третманот врз локомоцијата. Авторите оправдано препорачале 10 микромоларни како горна граница во нивните услови.

Втора група, со дел од истите автори како студијата за метаболизмот, го спровела изложувањето онака како што навистина се одвива одгледувањето: бојата била присутна од 2 до 3 часа по оплодувањето, со секојдневно делумно обновување, а однесувањето се мерело додека изложувањето сè уште траело или завршило неодамна. При истите рутински концентрации, ларвите покажале намалена локомоција во 24-часовен тест, повторлива кај различни соеви и во различни лаборатории, а студијата за бихевиоралното конфундирање го поврзала ефектот со серотонергичниот тонус, во согласност со познатото инхибирање на моноамин оксидазата од бојата. Најпоказателно е што ембрионалниот медиум со метиленско сино го прикрил очекуваниот локомоторен одговор на флуоксетин, селективен инхибитор на повторното преземање на серотонин (SSRI). Затоа скрининг-тест спроведен во сина вода може да пропушти ефект од лек што би се открил во бистра вода.

Нема вистинска противречност. Едно соединение може да не остави мерлив преостанат ефект два дена по отстранувањето во еден тест, а сепак да биде активно додека е присутно во друг. Практичното толкување е дека резултатот без утврден ефект оправдува горна граница на концентрацијата, а не тврдење за неутралност, додека резултатот со утврден ефект го опишува релевантниот ризик: активно изложување во периодот на мерење, во токму онаа поставеност што ја користат повеќето лаборатории.

Редокс-боја во редокс-тест

Уште една замка заслужува посебен пасус бидејќи го нарушува мерниот систем, а не животното. Тестот Alamar Blue за потрошувачка на енергија и самиот се заснова на редокс-хемија: резазуринот се редуцира во флуоресцентен резоруфин. Метиленското сино исто така учествува во редокс-хемија. Во контролите без клетки, двете концентрации за одгледување малку, но значајно ја намалиле флуоресценцијата на Alamar Blue по 24 часа. Во експериментите со животни, изложените ембриони биле исплакнати најмалку трипати во медиум без боја пред тестот, а биолошкиот ефект кај изведените ларви бил поголем од интерференцијата без клетки. Значи, двете тврдења се точни: исплакнатите животни задржуваат вистински метаболички ефект, а неисплакнатата боја дополнително создава директен хемиски артефакт. Контролите мора да ги разграничат двете, инаку ниту една бројка нема значење. Општите насоки за толкување на резултатите од тестови засновани на бои тука имаат особено голема важност.

Временска линија на развојните стадиуми

Оригинален приказ за оваа статија. Концентрациите се двете стандардни вредности за одгледување, 0.00005% и 0.0001%, освен ако не е наведено поинаку.

Образецот што треба да се запомни е рано зголемување и подоцнежно намалување на метаболичките показатели, со бихевиорални ефекти присутни за време на изложувањето и немерливи по елиминирањето на бојата во единствениот тест што го проверил тоа.

Контролна листа за дизајнот на контролите

Втор оригинален приказ. Користете го кога протоколите за риби-зебри со метиленско сино се вклучени во експеримент.

1. Пријавете ја бојата како реагенс, а не како вода. Наведете ја концентрацијата и во проценти и во микромоларни единици, почетокот и крајот во часови или денови по оплодувањето, распоредот на обновување и периодот на отстранување на бојата пред секое мерење.
2. Усогласете ги контролите со прашањето. На студија за испитуваната хемикалија ѝ се потребни контроли без боја; на студија за одгледувањето ѝ се потребни групи без боја наспроти групи со боја, со евидентиран исход во однос на габите, бидејќи ниту една од наведените студии не ја мерела антифунгалната ефикасност.
3. Исплакнете пред редокс-тестовите, а потоа проверете. Исплакнете најмалку трипати во медиум без боја и паралелно спроведете контрола без клетки со боја и реагенс, бидејќи бојата директно го намалува сигналот на Alamar Blue.
4. Сметајте ги показателите на однесувањето и моноамините за високоризични. Студиите за локомоција, реакција на ненадеен стимул, однесување слично на анксиозност, антидепресиви и инхибитори на MAO треба да ја избегнуваат бојата за време на мерењето или да докажат неутралност за конкретниот показател; период од еден до два дена без боја отстранил еден локомоторен ефект, но тоа не е докажано за други експериментални парадигми.
5. Сметајте ги метаболичките и митохондријалните показатели за високоризични во секој стадиум. Потрошувачката на кислород, потрошувачката на енергија, мембранскиот потенцијал и транскриптите на респираторниот синџир се менуваат при концентрациите за одгледување, во спротивни насоки пред и по изведувањето.
6. Не пренесувајте заклучоци за неутралност од еден дизајн на друг. Резултат без утврден ефект по отстранувањето на бојата не важи за тековно изложување; морфолошки резултат без утврден ефект не важи за метаболизмот или интеракциите со лекови; резултат во еден сој, на една температура или при едно времетраење на тестот не важи за други.
7. Наведете го упатството што сте го следеле и неговата алтернатива. Изречно наведете ги концентрациите според CCAC, европските упатства или Cold Spring Harbor и посочете дека тестот на OECD со ембриони ја изоставува бојата, за читателот да може да ги смести вашите животни во соодветен контекст.

Ништо од ова не е аргумент против употребата на бојата за јајцата да се одржат живи. Тоа е аргумент против непреиспитаното пренесување на избор направен при одгледувањето во податоците. Синото во садот е молекула со фармаколошко дејство, а експериментите што најверојатно ќе бидат искривени се токму високопропусните метаболички и невробихевиорални скрининзи за кои денес се претпочитаат млади риби-зебри. Евидентирајте го, контролирајте го, отстранете го со исплакнување пред мерењето и проверете го тестот во кој можеби незабележливо учествува.