Истражувања на антимикробното и антифунгалното дејство на метиленското сино: светлина наспроти темнина

Двајца читатели ја гледаат фразата „антимикробно дејство на метиленското сино“ и замислуваат различни нешта. Едниот замислува сина течност што ги труе микробите при контакт. Другиот замислува постапка во која боја плус црвена светлина ги уништува. Во двете претстави има дел од вистината. Ниту една не е целосен концепт, а нивното мешање е причината поради која повеќето тврдења на интернет се погрешни.

Оваа разлика е темата на овој преглед. Метиленското сино има умерена токсичност во темнина при доволна концентрација. Со црвена светлина станува фотосензибилизатор: апсорбира фотон, достигнува реактивна триплетна состојба и поттикнува оксидативни хемиски реакции што оштетуваат повеќе цели истовремено. Тој режим активиран со светлина има свое име, антимикробна фотодинамичка терапија, и свои услови. Концентрацијата сама по себе не го дефинира. Брановата должина, светлосната доза, инкубацијата, кислородот и организмот го одредуваат исходот.

Двата концепта на уништување

Најпрво разгледајте го концептот во темнина. Метиленското сино е позитивно наелектризирана фенотиазиниумска боја. Се поврзува со микробните обвивки, навлегува во клетките во различен степен и учествува во редокс-реакции и реакции на врзување. Нема учество на фотони. До уништување доаѓа, но само при концентрации што многу се разликуваат зависно од организмот, а механизмот не е насочен кон една јасно определена цел.

Фотодинамичкиот концепт додава светлина. Црвените фотони во опсегот од 630 до 680 nm се преклопуваат со апсорпцискиот опсег на бојата, при што максимумот на мономерот е близу 664 nm. Апсорпцијата ја префрла бојата во краткотрајна синглетна состојба, а потоа во подолготрајна триплетна состојба. Оттаму следуваат две групи реакции. Кај хемиските реакции од тип I, триплетната состојба пренесува електрон на супстрат и започнува радикални патишта што вклучуваат супероксидни и хидроксилни видови. Кај хемиските реакции од тип II, таа пренесува енергија директно на кислородот во основна состојба и создава синглетен кислород. Двата процеса можат да се одвиваат истовремено, па опишувањето на бојата како средство што дејствува исклучиво преку синглетен кислород е премногу поедноставено. Еден преглед на односот меѓу структурата и активноста на фенотиазиниумските фотосензибилизатори директно го покажува тоа: кај сродните бои, бактериската фототоксичност не го следела само приносот на синглетен кислород, бидејќи внесувањето, локализацијата и редукцијата во неактивната леуко-форма биле подеднакво важни како фотофизиката. Фотохемијата зад правилото за брановата должина е објаснета во придружниот преглед на бојата во комбинација со црвена светлина.

Синглетниот кислород е клучен за едно корисно својство. Тој реагира со многу биомолекули истовремено, па нападот е мултифакторски наместо насочен кон еден ензим или протеин за врзување. Еден темелен опис на фотодинамичката антимикробна хемотерапија го истакнал ова како причина зошто конвенционалните профили на резистенција имаат мала тежина: дополнителен протеин што врзува пеницилин или мутирана топоизомераза не блокираат налет на реактивен кислород. Таа логика се потврдила при тестирање против Staphylococcus aureus резистентен на метицилин и ентерококи резистентни на ванкомицин, како што покажува матрицата подолу. Тоа не значи дека резистенцијата е невозможна, туку само дека функционира поинаку. Ефлуксните пумпи и антиоксидативните одбранбени механизми сепак можат да ја променат потребната доза, особено кај габите.

Матрица на организми и истражувачки модели

Оваа табела е централниот дел на статијата. Секоја вредност е специфична за протоколот: иста боја, различна светлосна доза или инкубација, различен број. Не ги сметајте MBC, MLC и MIC за меѓусебно заменливи. MBC и MLC тука значат дека нема преживеани при супкултивирање, додека MIC значи инхибиција на растот. Условите на осветлување се наведени за секоја ставка.

Организам и модел	Резултат во темнина	Резултат со светлина	Услови
S. aureus NCTC 6571, планктонска суспензија	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Табела од преглед, бела светлина 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, планктонска суспензија	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Примарен протокол од 1997, 1.7 mW per cm2 во текот на 1 час, околу 6.3 J per cm2, инокулум близу 10^6 CFU per mL, наведено во оригиналната студија за фотобактерицидното дејство на фенотиазиниумските бои
MRSA EMRSA-15, планктонски	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Табела од преглед, околу 12 J per cm2, четирикратно зголемување на чувствителноста
MRSA EMRSA-16, планктонски	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Истиот протокол како погоре
E. coli NCTC 9001, планктонски	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Истиот протокол, петкратно зголемување на чувствителноста
P. aeruginosa NCTC 10622, планктонски	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Истиот протокол, дваесеткратно зголемување на чувствителноста
E. faecalis NCTC 775, планктонски	MLC 100 uM	MLC 100 uM	Протокол од 1997 при 6.3 J per cm2, без подобрување за овој сој и оваа доза
E. faecium резистентен на ванкомицин, планктонски	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Табела од преглед, без подобрување со основната боја, додека похидрофобните метилирани деривати покажале подобрување, според студијата за ентерококи резистентни на ванкомицин
Candida albicans, планктонска	MIC над 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39 и 1.59 ug per mL при 5, 10 и 15 J per cm2	Прединкубација во темнина од 30 минути, црвена LED-светлина од 600 до 650 nm со максимум на 635 nm, според студија за зависноста од дозата на антифунгалното фотодинамичко дејство на метиленското сино
C. albicans YEM14 наспроти сој со прекумерна експресија на ефлуксни пумпи, уништување мерено преку CFU	Не е применливо	Околу 5 log уништување на родителскиот сој, речиси нулто уништување на сојот со прекумерна експресија на CDR1/CDR2	100 uM боја, инкубација од 30 минути, 660 nm при 60 J per cm2, според студија за ефектите на ефлуксните пумпи врз фотоуништувањето со метиленско сино
Хифи на Trichophyton rubrum наспроти спори	Не е применливо	MIC за хифи околу 6.3 ug per mL, за спори околу 2.0 ug per mL; за целосно блокирање на CFU биле потребни 5 ug per mL плус 100 J per cm2 за хифите наспроти 1.25 ug per mL плус 40 J per cm2 за спорите	Фотодинамички протокол со 635 nm, според студија за чувствителноста на дерматофитите во различни развојни стадиуми
Зрел субгингивален биофилм од 33 видови, уред Calgary, ден 6	Само MB: намалување на вкупниот број за над 80 проценти	MB плус LED од 660 nm: намалување на метаболичката активност за околу 55 проценти, без широко преструктурирање на заедницата	0.01 проценти боја (100 ug per mL), 660 nm при околу 330 mW per cm2 во текот на 5 минути, анаеробен раст, според ин витро студија на орален биофилм од повеќе видови

Се издвојуваат три обрасци. Прво, грам-позитивните стафилококи умираат при ниски микромоларни концентрации, додека грам-негативните стапчести бактерии во темнина бараат приближно сто пати повеќе боја, бидејќи надворешната мембрана на грам-негативните бактерии го ограничува навлегувањето. Светлината ја намалува разликата, но не ја отстранува. Второ, антифунгалното дејство на метиленското сино е реално, но условено: антифунгалното уништување на Candida со метиленско сино нагло се подобрува со светлосната доза, а една фенотипска промена, како прекумерна експресија на ефлуксни пумпи, може да го поништи уништувањето од 5 log при идентична доза. Трето, зрелиот биофилм се однесува поинаку од суспензиите, што е контекстот во кој треба да се толкува редот за оралниот биофилм.

Бактерии: каде светлината помага најмногу, а каде не

Стафилококите се чувствителниот случај. Дури и вредностите од прегледната табела за епидемиски MRSA се на нивото на споредбените вредности за ванкомицин или под нив кога се применува светлина, а диметилираните деривати дале уште подобри резултати, бидејќи метилацијата ја зголемила липофилноста и приносот на синглетен кислород, истовремено зголемувајќи ја отпорноста на редукција во леуко-форма. Овој хемиски детаљ е важен: покажува дека уништувањето е резултат на доставувањето плус фотофизиката, а не само на фотофизиката.

Грам-негативните организми го илустрираат делот што се однесува на доставувањето. На Pseudomonas му биле потребни 500 uM во темнина и 25 uM со светлина, што е дваесеткратно подобрување, но вредноста со осветлување сè уште е значително над опсегот за стафилококи. Катјонскиот полнеж ѝ помага на бојата да се приближи до надворешната мембрана, но продирањето останува ограничувачкиот фактор. Формулациите, времето на инкубација и изборот на дериват ги менуваат овие бројки повеќе отколку повторното користење на истата боја во поголема доза.

Ентерококите се предупредувачкиот пример. Во постарите протоколи, E. faecalis воопшто не покажал предност од светлината, а на E. faecium резистентен на ванкомицин му била потребна друга молекула наместо повеќе светлина. Секој што наведува една MBC-вредност за метиленското сино како општа антибактериска константа погрешно ја чита литературата. Таква константа не постои. Постојат само вредности специфични за сојот, подлогата, инокулумот, инкубацијата, брановата должина и флуенцата. Како да ги читате тие вредности без да се доведете во заблуда е објаснето во водичот за толкување на кривите на уништување.

Габи: чувствителни, но стадиумот и пумпите одлучуваат

Габичните ѕидови од глукани, манани и хитин претставуваат поинаков проблем за внесувањето отколку кај бактериите, а габите имаат и активни одбранбени механизми. Резултатот за ефлуксот кај Candida погоре е најизразениот пример: идентична боја, идентична светлина, идентична подлога, но сојот со прекумерна експресија преживеал, додека родителскиот сој изгубил околу 99.999 проценти од единиците што формираат колонии. Дерматофитите додаваат и развојна димензија. Спорите умираат многу полесно од хифите, па протокол што ги отстранува спорите може сепак да остави живи фрагменти од хифи при истата доза.

Затоа извештаите за антифунгалното дејство на метиленското сино бараат исто толку прецизно дефинирање на светлосните услови како и бактериските. Клиничките фотодинамички студии за нокти и кожа комбинирале 1 до 2 проценти боја со измерена црвена светлина при дефинирани флуенци и следење, и го разграничувале клиничкиот изглед од миколошкото елиминирање. Тие испитувања се разгледани во резимето на фотодинамичките докази за габични промени на ноктите и кожата. Нанесувањето разредена боја на лезија при собно осветлување ја репродуцира бојата, но ја изоставува постапката.

Проверка со биофилм: орален модел со 33 видови

Студијата од 2024 за орален биофилм од повеќе видови заслужува внимание бидејќи го испитува тешкиот, а не лесниот случај. Триесет и три орални видови, вклучувајќи ги Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium и орални стрептококи, растеле анаеробно и формирале зрел биофилм на ден 6. Третманот бил со 0.01 проценти боја и LED од 660 nm во текот на 5 минути при висока густина на зрачна моќност. И бојата сама и светлината сама значително го намалиле вкупниот број, а комбинацијата ја намалила метаболичката активност за околу половина, но заедницата не се преструктурирала и биофилмот не бил стерилизиран.

Тоа е вистински ефект со јасно признаена граница. Тој го поддржува фотодинамичкиот третман како локална дополнителна постапка во исчистен џеб, а не како средство за испирање што само по себе лекува дијагностициран пародонтитис. Тоа нè води до општиот јаз.

Зошто лабораториското уништување не е исто што и третман

При определување на планктонска MBC, еднообразни клетки се изложуваат на еднообразна боја и еднообразна светлина во подлога снабдена со кислород. Лезијата не нуди ништо од тоа. Матриксот го забавува навлегувањето, состојбите слични на оние кај перзистентните клетки ја толерираат оксидацијата, крвта и ексудатот ја апсорбираат светлината, геометријата на ткивото остава сенки, а хипоксичните џебови ги ослабуваат реакциите од тип II бидејќи синглетниот кислород по дефиниција бара молекуларен кислород. Мешаните инфекции додаваат видови што се разликуваат во внесувањето и чувствителноста, па вредноста за еден референтен сој не може да го претставува местото.

Оралниот пример го прави јазот конкретен. Намалувањето на Porphyromonas или стрептококи во лабораториски сад, или преполовувањето на култивиран биофилм, не утврдува дека сино средство за испирање лекува пародонтитис, излекува ендодонтска инфекција или елиминира бактериемија. Клиничката пародонтална грижа зависи од механичко нарушување и отстранување на биофилмот, плус справување со анатомијата на џебот, при што третманот заснован на светлина се истражува како локализирана дополнителна постапка. Концентрацијата на бојата што убива во лабораториско бунарче нема фиксен однос со концентрацијата што стигнува до бактериите под линијата на непцето, а собното осветлување не е доза од 660 nm. Границите во однос на дозирањето, безбедноста и интеракциите за каква било орална употреба треба да ги утврди клиничар, како што е наведено во референтниот преглед за безбедност и интеракции.

Што не претставуваат овие докази

Ова не е тврдење за средство за дезинфекција во домаќинството. Бактерицидните табели користат дефинирани соеви, подлоги, времиња на контакт, спектри и флуенци. Тие не кажуваат ништо за кујнски површини, потребните времиња на контакт во присуство на органски нечистотии или регулаторните стандарди за дезинфекција.

Ова не е ни замена за системски антибиотик. Конвенционалното фотодинамичко дејство бара бојата, апсорбираната светлина и кислородот да бидат на исто место во исто време. Светлината не стигнува до длабоки или дисеминирани места на начинот на кој проголтан лек стигнува до крвта. Литературата го позиционира овој пристап за пристапна локална инфекција или како дополнителна постапка, токму како што Wainwright ја поставил локалната дезинфекција од самиот почеток.

Непристрасното резиме е потесно, но сепак интересно. Метиленското сино има умерена антимикробна активност во темнина, а црвената светлина овозможува многу поголем фотодинамички ефект кај многу бактерии и габи, со големи разлики меѓу светлина и темнина, како 500 наспроти 25 uM за Pseudomonas и 80 наспроти 20 uM за епидемиски MRSA, покрај поучните неуспеси кај ентерококите и Candida со функционален ефлукс. Пренесувањето на резултатите во практиката зависи подеднакво од доставувањето, физиологијата на биофилмот и кислородот, колку и од номиналната концентрација на бојата. Кога овие услови се јасно наведени, бројките имаат значење. Кога ќе се изостават, бројките не значат ништо.