Толкување на изгледот на колониите на E. coli и други организми на EMB агар

Студент со исцртување инокулира непознат примерок на агар со еозин и метиленско сино, го инкубира преку ноќ и потоа затекнува плоча со темни колонии со зелен сјај. Во лабораториската тетратка запишува „E. coli, потврдено.“ Тој запис тврди повеќе отколку што плочата може да поткрепи. Плочата покажува фенотип на раст и ферментација во одредени услови. Идентитетот на видот е посебно тврдење за кое се потребни посебни докази.

Овој водич ги разгледува резултатите на EMB агар како задача за толкување. Ја објаснува основната идеја, води низ илустративен атлас на плочи со контроли и ги посочува случаите во кои учебничкиот приказ може да доведе во заблуда.

Идејата зад плочата

EMB агарот е и селективен и диференцијален. Боите еозин Y и метиленско сино потиснуваат многу грам-позитивни организми, па подлогата го фаворизира растот на грам-негативните. Истите бои служат како индикатори: кога организмот го ферментира достапниот шеќер и локално создава доволно киселина, колонијата силно ја врзува бојата и станува темновиолетова до сино-црна. При интензивно создавање киселина, површината на колонијата може да покажува металнозелена иридесценција. Протоколот на ASM за плочи со агар со еозин и метиленско сино ја опишува оваа комбинација на селекција и диференцијација и обезбедува референтни фотографии за настава.

Пред толкувањето на кој било резултат, важен е еден детаљ: проверете која формулација се користи. Постарата формулација Holt Harris Teague содржи лактоза и сахароза, додека Levine EMB содржи само лактоза. Организам што ферментира сахароза, но не и лактоза, како многу изолати на Serratia marcescens, може да изгледа различно на двете верзии. Документацијата на производителот за EMB подлоги јасно ја наведува оваа разлика во формулацијата. Запишете ги производителот и формулацијата во тетратката, заедно со резултатот.

Подготвениот неинокулиран EMB агар обично е црвено-кафеав до црвеникаво-виолетов, понекогаш со зеленикава нијанса или фин талог. Таа позадинска боја не е раст. При секое толкување споредувајте со неинокулирана плоча или со документираниот почетен изглед и прочитајте ја примарната плоча по околу 18 до 24 часа аеробна инкубација на 35 до 37 C, освен ако наставниот протокол не наведува поинаку. Продолжената инкубација може да го промени изгледот поврзан со ферментацијата.

Како да ја набљудувате плочата

Користете два вида осветлување. Прво прегледајте ја плочата под одбиена или коса светлина и навалете ја: металниот сјај е иридесцентен и може да се појави или да исчезне зависно од аголот на гледање. Потоа прегледајте ја со пропуштена светлина за да ја процените бојата на колониите и темните центри. Работете со добро изолирани колонии, бидејќи густината и соседните колонии го менуваат локалното акумулирање киселина и може да ја ослабат или засилат бојата. Збирката слики на ASM го покажува ова директно: E. coli во мешана култура може да го изгуби очекуваниот сјај бидејќи околните организми ја менуваат киселоста на средината.

Вклучете контроли секогаш кога вежбата го дозволува тоа. Вообичаен сет за настава вклучува E. coli ATCC 25922 за фенотипот со сино-црна боја и метален сјај, неферментатор како Salmonella Typhimurium ATCC 14028 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 за безбојниот фенотип и грам-позитивен организам како Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus како контрола на инхибицијата, како што е наведено во стандардните табели за контрола на квалитетот на EMB подлоги. Ако позитивната контрола нема сјај, прво посомневајте се во инкубацијата, густината на колониите или формулацијата, пред да се посомневате во непознатиот примерок.

Илустративен атлас на плочи

Плочите подолу се генерирани илустрации, а не фотографии од вистински култури. Тие го покажуваат образецот што треба да го барате, а не точната нијанса на некој поединечен сој. Споредете ги со референтните фотографии на ASM и со вистински плочи од наставната лабораторија.

Плоча 1: Escherichia coli на EMB агар, интензивен ферментатор на лактоза

E. coli на EMB агар обично има темновиолетова до сино-црна боја, често со темен центар и металнозелен сјај поради интензивното создавање киселина. Сјајот е познатиот наод што студентите го бараат, но сметајте го за поткрепувачки доказ, а не за дефиниција. Интензитетот на сјајот варира зависно од сојот, времето на инкубација, густината на колониите и аголот на гледање. Отсуството на сјај не ја исклучува E. coli, а темна колонија без сјај упатува и на неколку други ферментатори. За секоја понатамошна работа изберете добро изолирана колонија, наместо да толкувате густо обраснат сектор.

Плоча 2: Klebsiella pneumoniae на EMB агар, мукоиден ферментатор

Klebsiella pneumoniae на EMB агар обично формира големи, сјајни, мукоидни колонии во розово-виолетови до кафеаво-виолетови нијанси, често со темни центри, но обично без силен метален сјај. Слична морфологија се јавува и кај сродни ферментатори како Enterobacter. Мукоидната текстура и големината на колонијата се дел од толкувањето: мала и рамна розова колонија има поинакво значење од голема, куполеста, мукоидна колонија. Како и кај E. coli, плочата укажува на фенотип на ферментација, а за именување на ниво на вид е потребно биохемиско потврдување, опишано подолу.

Плоча 3: Salmonella на EMB агар и други неферментатори, безбојни колонии

Salmonella на EMB агар и сродните организми што не ферментираат лактоза, вклучувајќи ги Shigella и многу изолати на Pseudomonas, обично растат како безбојни до полупроѕирни или бледокилибарни колонии. Некои формулации и услови даваат слаба розеникава нијанса, па бледорозова колонија не значи автоматски ферментатор. EMB не ја разликува Salmonella од Shigella или од други неферментатори; тоа разграничување се прави со подоцнежни тестови. Имајте предвид и дека се документирани лактоза-позитивни соеви на Salmonella со метално сјајни колонии налик на E. coli, што е уште една причина зошто една плоча не може да даде конечен заклучок.

Плоча 4: Serratia marcescens и замката со формулацијата

Serratia marcescens заслужува сопствен дел бидејќи студентите често очекуваат црвени колонии, а потоа погрешно ја толкуваат плочата. Повеќето клинички изолати не ферментираат лактоза, па на Levine EMB обично изгледаат бледо до слабо обоено. Бидејќи многу изолати ферментираат сахароза, формулација што содржи сахароза може да даде потемна реакција или реакција поизразено поврзана со создавање киселина. Не очекувајте го ниту класичниот црвен пигмент продигиозин на 35 до 37 C; создавањето пигмент не е сигурно на температурата на инкубаторот. Кога протоколот ја споменува Serratia marcescens на EMB агар, проверете која формулација ја подразбира тврдењето. Еден преглед на метаболизмот на Serratia го сумира лактоза-негативниот и сахароза-варијабилниот образец што стои зад оваа замка.

Плоча 5: контроли и инхибирани организми

Грам-позитивните организми како Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus и Bacillus генерално се инхибирани или значително потиснати на EMB агар, иако инхибицијата не е апсолутна за секој сој. Сетот контроли овозможува веродостојно толкување: контролата со E. coli треба да покаже добар раст со сино-црна боја и сјај, контролата со неферментатор треба да покаже безбоен раст, а контролата на инхибицијата треба да покаже слаб раст или воопшто да нема раст. Ако контролата на инхибицијата расте добро, селективниот чекор не успеал и секое друго толкување на таа серија е сомнително. Методите на боење одговараат на поинакво прашање од хранливите подлоги; за боењето на предметни стакла во лабораторијата, погледнете го атласот за боење со метиленско сино.

Споредба со јасни ограничувања

Три реченици ги сумираат изгледите што доведуваат во заблуда. Темната боја не значи E. coli, бидејќи Klebsiella, Enterobacter и други ферментатори развиваат темни центри без сјај. Розовата боја не значи Klebsiella, бидејќи умерените или бавните ферментатори и некои организми што вообичаено се сметаат за неферментатори изгледаат розово или светловиолетово. Сјајот не значи дефинитивно E. coli, бидејќи и други интензивни ферментатори може да го создадат. Наставниот протокол и неговите прикази на мешани култури ја илустрираат секоја од овие погрешни претпоставки.

Ограничувања на потврдувањето

EMB агарот покажува фенотип, а не вид. Различни организми може да имаат ист изглед на колониите, а еден организам може да отстапува од својот учебнички приказ зависно од сојот, староста, густината, формулацијата и инкубацијата. Затоа наставните и клиничките работни постапки ја третираат морфологијата на EMB како прелиминарен показател.

Оправдана студентска постапка е: опишете ја изолираната колонија (големина, боја, центар, сјај под коса светлина, мукоиден карактер), запишете ги формулацијата, времето и температурата на инкубација и контролите; потоа пресадете добро изолирана колонија за да добиете чиста култура пред каков било потврден тест. Вообичаените понатамошни испитувања вклучуваат боење по Грам и IMViC реакции за прелиминарна идентификација на E. coli и колиформни бактерии, TSI или KIA и биохемиски панели специфични за организмот за ентерични организми, со серолошка идентификација, MALDI TOF или друга валидирана идентификација кога задачата го бара тоа. За контекст за местото на EMB меѓу селективните и диференцијалните подлоги за ентерични организми, погледнете ги воведите во подлогите за култивирање ентерични организми и понатамошното испитување со боење по Грам. За сродното прашање што може и што не може да докаже синото боење на предметно стакло, атласот за боење со метиленско сино во истиот дух ги раздвојува набљудувањето и заклучокот.

Запишете го набљудувањето пред заклучокот. „Темни сино-црни колонии со зелен сјај зависен од аголот на гледање на Levine EMB по 24 часа, во согласност со интензивна ферментација на лактоза“ е оправдан опис. „E. coli, потврдено“ го бара чекорот за потврдување што самата плоча не може да го обезбеди.