Lahatsoratra
Safidy hafa ankoatra ny methylene blue ho an’ny mikraoskaopy: fidio araka ny asa
Ho an’ny smear bakteria tsotra, ny crystal violet dia afaka misolo ny methylene blue raha ny tanjona dia ny hahita ny endriky ny sela. Ho an’ny sela velona, mety ho phase contrast tsy misy fandokoana mihitsy no safidy tsara kokoa. Miankina amin’ny zavatra ilainao hojerena ny safidy.
Aoka hatao hoe olona roa no mandinika kolontsaina bakteria iray ihany. Ny iray te hanavaka bakteria miendrika tsorakazo amin’ny sela boribory. Ny iray kosa te hahafantatra raha nahafaty ny bakteria ny fitsaboana iray. Ny loko iray izay manome sary mazava ho an’ny olona voalohany dia mety tsy hanome valiny azo ampiasaina ho an’ny faharoa.
Alohan’ny hisafidianana solony, fenoy ity fehezanteny ity: “Mila mandinika ___ ao amin’ny ___ aho, ary tsy maintsy / tsy voatery hijanona ho velona ny sela.” Io fehezanteny io no mamaritra ny asa tokony hotanterahin’ilay loko.
Atombohy amin’ny santionany sy ny fanontaniana
Fantaro aloha raha tsy maintsy mijanona ho velona ny sela, avy eo fantaro ny toetra ilainao hojerena:
- Tsy maintsy mijanona ho velona ny sela: ho an’ny fihetsika na endrika, diniho ny phase contrast na DIC tsy misy fandokoana; ho an’ny ADN nokleary, diniho ny Hoechst 33342 miaraka amin’ny fluorescence; ho an’ny fahamendrehan’ny membrane, mifidiana assay voamarina toy ny SYTO 9 miaraka amin’ny propidium iodide.
- Tsy voatery hijanona ho velona ny sela: ho an’ny morfolojian’ny bakteria, diniho ny fandokoana tsotra amin’ny crystal violet na fandokoana négatif amin’ny nigrosin; ho an’ny Gram reaction, ampiasao ny fomba Gram-stain feno; ho an’ny ADN nokleary amin’ny sela voafikitra, diniho ny fluorescence DAPI.
Ampiasao ity tabilao ity hampitahana ny fetran’ny safidy tsirairay. Safidy momba ny fomba ireo, fa tsy toromarika hanoloana tavoahangy iray amin’ny iray hafa ao anatin’ny protocole efa misy.
| Izay ilainao hojerena | Santionany sy fitaovana | Safidy azo ampiasaina | Fetra lehibe |
|---|---|---|---|
| Endrika sy fandaminan’ny bakteria | Smear bakteria voaomana; brightfield | Fandokoana tsotra amin’ny crystal violet | Mampiseho morfolojia; tsy manamarina Gram reaction na viability. |
| Sisintanin’ny sela manoloana ambadika maizina | Fanomanana bakteriolojika; brightfield | Fandokoana négatif amin’ny nigrosin | Zava-dehibe ny fanomanana sy ny formulation; ny sela tsy voasolo loko dia tsy voatery ho velona. |
| Gram reaction | Smear bakteria voaomana; brightfield | Fomba Gram-stain feno | Mitaky ny filaharan’ny reagent feno sy ny controls. |
| Fihetsika na fiovana amin’ny sela velona | Fanomanana mando mifanaraka; phase contrast na DIC | Tsy misy loko | Mitaky optika mifanaraka; tsy mamantatra molekiola iray ny contrast. |
| ADN nokleary | Sela voafikitra; fluorescence | DAPI | Mitaky filtre excitation sy emission mifanaraka. |
| ADN nokleary amin’ny sela velona | Sela velona; fluorescence | Hoechst 33342 | Ny fidiran’ilay loko ao amin’ny sela dia tsy manaporofo fa tsy manimba ny fepetra fakana sary. |
| Fahamendrehan’ny membrane bakteria | Bakteria tsy voafikitra; fluorescence | SYTO 9 miaraka amin’ny propidium iodide | Ny fandokoana membrane dia fandrefesana ankolaka ny viability. |
Ho an’ny smear tsotra, soloy amim-pitandremana ny fomba
Ny crystal violet dia safidy azo ampiharina rehefa ny asa dia ny hahazo fijery miloko tokana momba ny morfolojian’ny bakteria. Ny Bacteriological Analytical Manual an’ny FDA dia mitanisa formulation crystal violet roa mety amin’ny fandokoana tsotra. Mampiasà formulation voarakitra an-tsoratra sy ny fomba fanomanana azy; ny anaran’ilay loko fotsiny dia tsy mamaritra reagent iray vonona hampiasaina.
Ampiasaina amin’ny Gram staining koa ny crystal violet, saingy tsy midika izany fa Gram stain ny fandokoana tsotra amin’ny crystal violet. Ao amin’ny protocole Gram-stain an’ny ASM, ny vokatra mampiavaka dia miankina amin’ny crystal violet, iodine, decolorization, ary counterstaining izay ampiharina misesy. Raha esorina ireo dingana ireo dia miova izay azo hamarinina amin’ilay sary. Jereo ny fandokoana tsotra raha oharina amin’ny Gram staining ho an’io fahasamihafana io.
Ny nigrosin dia manolotra fomba hafa hampisehoana ny sisintany: maizina ny ambadika raha mbola mazava kokoa raha ampitahaina aminy ny sela bakteria. Misy antsipiriany ilaina ao amin’ny toromarika nigrosin an’i Merck izay mety tsy ho hita ao amin’ny lisitra ankapobeny momba ny solony. Ahitana formaldehyde ny formulation ampiasaina voafaritra ao. Noho izany, tsy azo tsoahina avy amin’ny teny hoe “negative stain” fa mifanaraka amin’ny sela velona ilay izy, na dia miseho ho tsy voasolo loko aza ny sela. Jereo ny formulation feno sy ny fanomanana ny santionany.
Ho an’ny santionany velona, diniho ny fanovana ny optika
Raha te hijery sela mihetsika na mizara ianao, mety hanasarotra ny fandinihana ny fampidirana loko hafa. Araka ny hazavain’i Nikon ao amin’ny torolalany momba ny contrast amin’ny santionany mangarahara, ny phase contrast sy ny differential interference contrast, na DIC, dia mampiseho ny santionany amin’ny alalan’ny fahasamihafana amin’ny toetra optikany. Afaka mampiseho sela velona tsy voasolo loko ireo, raha manana ireo singa ilaina ny mikraoskaopy.
Mitazona fanomanana tsy misy fandokoana io safidy io, saingy manova ny karazam-baovao azo. Afaka manaraka sisintany na fihetsika ianao nefa tsy mahalala hoe molekiola iza no niteraka ilay contrast. Raha ny toerana misy molekiola no fanontaniana, mifidiana fomba labeling mifanaraka amin’izany.
Ho an’ny ADN nokleary, ny fampitahana ny DAPI sy Hoechst stains nataon’i Invitrogen dia manavaka ny fampiasana mahazatra ny DAPI amin’ny sela voafikitra sy ny Hoechst 33342, izay mora miditra kokoa ao amin’ny sela ary tiana kokoa amin’ny labeling sela velona. Samy mitaky fitaovana fluorescence izy roa. Tsy misy amin’izy ireo no solony mivantana ny loko hita amin’ny brightfield.
Raiso ho fepetra andrana ny fiparitahan’ny loko sy ny illumination. Ampitahao ny fanomanana voasolo loko sy tsy voasolo loko rehefa ny fihetsiky ny sela no refesinao.
Ny sela mena dia tsy midika ho azy fa sela maty
Matetika ny SYTO 9 sy propidium iodide no ampiasaina miaraka hanombanana ny fahamendrehan’ny membrane bakteria. Ny boky torolalana BacLight dia mampifandray membrane tsy simba amin’ny fandokoana maitso ary membrane simba amin’ny fandokoana mena. Mila fanamarinana amin’ilay santionany izany fandikana izany.
Ny fandalinana 2019 nataon’i Rosenberg sy ireo mpiara-miasa aminy dia mampiseho ilay olana. Tao amin’ny biofilm E. coli 24-hour teo ambonin’ny fitaratra tao anaty phosphate-buffered saline, manodidina ny 96% amin’ny sela no toa propidium-iodide-positive in situ. Kanefa tombanan’ny mpanoratra fa 82% no azo nokolokoloina taorian’ny fanangonana. Ny sary confocal dia nampiseho sela manana atiny maitso teo ambanin’ny akora voasolo mena, izay manondro fa ny asidra nokleika ivelan’ny sela no nandray anjara tamin’ilay signal mamitaka.
Ireo isan-jato ireo dia mamaritra fandrefesana samihafa natao tamin’ny fanomanana tao amin’ilay fandalinana, fa tsy correction factor azo ampiharina amin’ny rehetra. Ny lesona ilaina dia ny manamarina izay niteraka ilay signal. Ao amin’ny biofilm, ny loko mamantatra asidra nokleika dia afaka mahita akora ivelan’ny sela ary koa ao anatin’ny sela simba. Ho an’ny fehin-kevitra momba ny viability, manoro fandrefesana mifameno ny mpikaroka, toy ny cultivation na metabolic activity, sady manaiky fa samy manana fetrany ireo.
Hamarino izay tena ao anatin’ilay safidy hafa
Mety mbola ahitana methylene blue ny fomba fandokoana hafa. Ohatra iray ny Giemsa: lazain’i Merck ho azure-eosin-methylene-blue solution ny vokatra, natao ho an’ny fampiharana ahitana smear ra sy tsokan-taolana. Mety ho fomba hafa ho an’ny santionany hafa izy io, saingy tsy mahafeno fepetra mitaky ny fanesorana methylene blue.
Raha anisan’ny andrana ny fanilihana compound iray, hamarino ny maha-izy ny reagent sy ny formulation alohan’ny hampitahana sary. Ny torolalana momba ny methyl blue, methylene blue, ary loko manana anarana mitovitovy dia manazava ny fahasamihafan’ny anarana.
Hamarino ny fanoloana alohan’ny hampiasana ny vokatra
Ho an’ny fomba vaovao, manaova fampitahana kely amin’ny santionany maneho tsara ny tena toe-javatra sy control mifanaraka. Ataovy azo ampitahaina araka izay azo atao ny réglage mikraoskaopy. Raketo ny formulation reagent, fanomanana santionany, exposure, ary fepetra fakana sary mba hahafahana mamotopototra ny antony maha-tsara kokoa ny sary iray fa tsy misafidy azy fotsiny noho ny endriny.
Tombano araka ilay fanontaniana tany am-boalohany ny fahombiazana. Ho an’ny morfolojia, diniho raha mbola azo adika tsara ny sisintanin’ny sela sy ny fandaminany. Ho an’ny labeling nokleary, diniho ny toerana misy ny signal sy ny background. Ho an’ny viability, mitadiava porofo mihoatra noho ny fisarahan-loko manintona. Ny torolalana mivelatra kokoa momba ny fandokoana amin’ny methylene blue sy ny fampiharana azy ao amin’ny laboratoara dia manazava ny fomba ifandraisan’ny fandinihana sy ny fanomanana.
Fidio ilay safidy hafa izay mitahiry ny fandrefesana ilainao. Toetra iray monja amin’ny sary vokarina ny loko.