Afaka mandalo ivelan’ny Kompleksa III ao amin’ny mitôkôndria ve ny manga metilena? Antony tsy itovian’ny fikarohana

Laboratoara roa no nanontany raha afaka mandalo ivelan’ny Kompleksa III voasakana ao amin’ny mitôkôndria ny manga metilena. Ny iray namaly hoe tsia. Ny iray kosa hoe eny. Samy nanana angon-drakitra izy ireo.

Ny fikarohana voalohany, natao tamin’ny mitôkôndrian’ny atidohan’ny totozy, dia nahita fa tsy afaka manao izany ilay akora fandokoana. Ny faharoa, natao tamin’ny mitôkôndrian’ny atidohan’ny karazana biby mpikiky telo, dia nahita fa afaka manao izany amin’ny ampahany izy. Matetika koa no tononina miaraka amin’ireo ny fikarohana fahatelo, natao tamin’ny atin’ny totozy, nefa zavatra hafa no notsapainy. Raha apetraka amin’ny toerany marina izy io, dia mazava ny antsasaky ny fifanjevoana.

Tsy misy mekanisma mihatra amin’ny toe-javatra rehetra azo ambara eto. Misy andrana telo samy hafa mpanakana, fatra ary fandrefesana. Vakio aloha ny fepetra nanaovana azy. Manaraka izany ny fehin-kevitra.

Ny dikan’ny fandalovana ivelan’ny sakana eto

Miditra ao amin’ny rojo amin’ny alalan’ny Kompleksa I ny elektrôna avy amin’ny NADH, na amin’ny alalan’ny Kompleksa II avy amin’ny succinate, mandalo ny Kompleksa III mankany amin’ny cytochrome c, ary avy eo mandalo ny Kompleksa IV mankany amin’ny ôksizena. Ny elanelan’ny fifantohana sy ny fiampangana miforona eny an-dalana no ampiasain’ny sela hamokarana ATP.

Ny filazana fa misy fandalovana ivelan’ny sakana dia midika fa mandray elektrôna alohan’ilay sakana ny manga metilena ary manatitra azy any aoriany. Mandray elektrôna avy amin’ny NADH na avy amin’ireo singa any am-piandohan’ny rojo ilay akora fandokoana voaoksida, ka lasa leucomethylene blue, ary ny endrika voaredio no manolotra azy amin’ny cytochrome c na mamerina azy ao amin’ny rojo. Raha any aorian’ilay sakana no iafaran’ny famindrana, dia miverina amin’ny ampahany ny fisefoana sy ny potansialin’ny fonona. Raha eo amin’ilay sakana na any alohany kosa, dia tsy misy miverina.

Tsipiriany iray momba ny Kompleksa III no tena mamaritra ity adihevitra ity. Manao tsingerina Q misy toerana roa ifikiran’ny mpanakana ilay kompleksa. Miraikitra amin’ny toerana Qi ny antimycin. Miraikitra amin’ny toerana Qo ny myxothiazol. Ny fikarohana mampiasa iray amin’ireo ihany dia tsy nitsapa afa-tsy ny antsasak’ilay kompleksa.

Fikarohana voalohany: tsy nisy fandalovana ivelan’ny sakana tao amin’ny mitôkôndrian’ny atidohan’ny totozy

Gureev sy ireo mpiara-miasa taminy dia nampiasa mitôkôndria avy amin’ny hoditry ny atidohan’ny totozy C57BL/6, natokana tamin’ny digitonin, ary nanaovana fitsapana tamin’ny proteinina 0.1 mg isaky ny ml. Nisy fepetra telo momba ny sôbstrà: pyruvate miaraka amin’ny malate, samy 5 mM; succinate 10 mM miaraka amin’ny glutamate 2 mM; ary L-proline 10 mM. Ny mpanakana dia rotenone 1 micromolar ho an’ny Kompleksa I sy antimycin 1 microgram per ml ho an’ny Kompleksa III. Ny fatran’ilay akora fandokoana dia 0.5, 1, ary 2 micromolar, ka 1 micromolar no fifantohana lehibe nampiasaina. Ao amin’ny lahatsoratra fohy ao amin’ny FEBS Letters ny fomba fiasa sy ny firaketana ny fandrefesana.

Nandeha ny fandalovana ivelan’ny Kompleksa I. Nampidina ny fisefoana nampirisihin’ny ADP avy amin’ny 121 teo ho eo ho amin’ny 2 nmol per minute per mg teo ho eo ny rotenone, ary nampiakatra izany ho amin’ny 21 teo ho eo ny akora fandokoana 1 micromolar. Niverina ny potansialin’ny fonona tamin’ny pyruvate miaraka amin’ny malate sy tamin’ny L-proline.

Tsy nandeha kosa ny fandalovana ivelan’ny Kompleksa III. Nampidina ny fisefoana ho amin’ny 16 teo ho eo ny antimycin, ary tsy nampiakatra izany afa-tsy ho amin’ny 20 teo ho eo ilay akora fandokoana. Tsy niverina ny potansialin’ny fonona tamin’ny sôbstrà rehetra, na dia hatramin’ny 5 micromolar aza ny fatran’ilay akora fandokoana. Nanondro izany koa ny angon-drakitra momba ny perôksida: ilay akora fandokoana irery dia nampiakatra ny famoahana perôksida avy amin’ny taha fototra manodidina ny 76 pmol per minute per mg ho amin’ny 1170, 1460, ary 1945 teo ho eo tamin’ireo fatra telo. Kanefa nampihena io famantarana aterak’ilay akora fandokoana io ho 25, 88, ary 96 isan-jato teo ho eo avy ny antimycin. Raha nifandray mivantana tamin’ny ôksizena ilay akora fandokoana voaredio, dia tsy tokony hampihena ilay famantarana ny fanakanana ny Kompleksa III. Nanatsoaka hevitra ireo mpanoratra fa voaoksida eo amin’ny toerana Qo ao amin’ny Kompleksa III ilay akora fandokoana voaredio, izany hoe alohan’ny sakana ateraky ny antimycin. Toy izao raha lazaina amin’ny teny ny tsingerina fohy: avy amin’ny mpanome elektrôna mankany amin’ilay akora fandokoana, avy eo mankany amin’ny Qo, ary mitohy amin’ny lalana mahazatra. Voalalovana ivelany ny rotenone. Tsy izany kosa ny antimycin.

Fikarohana faharoa: fandalovana amin’ny ampahany tamin’ny karazana telo, teo amin’ireo toerana roa ifikiran’ny mpanakana

Svab sy ireo mpiara-miasa taminy dia nanitatra ny fandrafetana ny andrana. Mitôkôndrian’ny atidohan’ny totozy, voalavo ary kisoa Ginea no nampiasaina, natokana tamin’ny Percoll, ary nanaovana fitsapana tamin’ny 0.1 mg isaky ny ml ihany, niaraka tamin’ny pyruvate sy malate na glutamate sy malate, samy 5 mM. Nampiasa mpanakana ny Kompleksa III roa izy ireo: antimycin A 0.3 micromolar sy myxothiazol 1 micromolar. Ny akora fandokoana dia 2 micromolar tamin’ny ankamaroan’ny fitsapana, ary 0.5 tamin’ny asa momba ny cytochrome c. Voarakitra ao amin’ny lahatsoratra azo vakina malalaka ireo karazana telo rehetra nampiasana fomba fiasa nitovy.

Voalalovana ivelany tamin’ny ampahany ireo sakana roa, tamin’ireo karazana telo rehetra. Tao amin’ny mitôkôndrian’ny totozy, nampihena ny fisefoana ny antimycin, ary nampiakatra izany 60 isan-jato teo ho eo ilay akora fandokoana, avy amin’ny 37 teo ho eo ho amin’ny 59 nmol per minute per mg. Nampihena izany 88 isan-jato ny myxothiazol, ho amin’ny 4.5 teo ho eo, ary nampiakatra azy avo dimy heny ho amin’ny 23 teo ho eo ilay akora fandokoana. Niverina tamin’ny ampahany ny polarisasionan’ny fonona rehefa nampiasaina ny mpanakana tsirairay. Akora fandokoana roa no nampiasaina handrefesana izany, safranin O sy TMRM ampitahana tahan’ny famantarana, mba hanilihana ny vokatra sandoka avy amin’ny fandrefesana optika.

Nitsapa mivantana ny famindrana elektrôna koa ity lahatsoratra ity, zavatra tsy nataon’ny fikarohana voalohany mihitsy. Tsy voaredio tamin’ny mitôkôndria manana angovo ny cytochrome c nasiana vondrona acetyl avy any ivelany, tamin’ny 25 micromolar, na nisy mpanakana na tsy nisy. Ny fanampiana ilay akora fandokoana anefa dia niteraka rediksiôna tamin’ireo toe-javatra roa ireo. Tao amin’ny ranoka buffer tsy misy sela, ny NADH niaraka tamin’ilay akora fandokoana dia namparedio ny cytochrome c tamin’ny taha nifandanja tamin’ny NADH. Toy izao raha lazaina amin’ny teny ny fitsambikinana lava kokoa: avy amin’ny ekivalenta mamparedio mankany amin’ilay akora fandokoana, avy eo mivantana mankany amin’ny cytochrome c, ary amin’ny alalan’ny Kompleksa IV mankany amin’ny ôksizena. Mandalo ivelan’ny Kompleksa III manontolo io lalana io, ka samy azo lalovana ivelany ireo mpanakana roa.

Fandrefesana fanampiny roa no manohana izany fandikana izany. Nihena ny floresansan’ny NAD(P)H rehefa nampiana ilay akora fandokoana tamin’ny mitôkôndria nasiana myxothiazol, izay midika fa nivoaka tamin’ilay lalana vaovao ny ekivalenta mamparedio. Nanaraka ny fanampiana tsirairay nifandimby koa ny fandraisan’ilay akora fandokoana hazavana tamin’ny 660 nm. Ny ranoka ambonin’ny antsanga taorian’ny fanodinkodinana kosa dia nampiseho fa niangona tao anatin’ny mitôkôndria manana angovo ilay akora fandokoana voaoksida, ka nitombo mihoatra ny avo zato heny, ary nivoaka rehefa nirodana ny potansialy. Mifanaraka amin’izany koa ny fifandanjan’ny protona: rehefa ialana ireo dingana mampamindra protona, dia protona 2 eo ho eo isaky ny elektrôna roa no tavela fa tsy 10. Noho izany, ny fampiasana ôksizena haingana kokoa miaraka amin’ny fiverenan’ny polarisasiona amin’ny ampahany ihany no endriky ny tena fandalovana ivelan’ny sakana, fa tsy porofo manohitra azy.

Io fanomanana io ihany dia namokatra valiny mety hampivily ny famakiana tsy lalina. Rehefa niaraka ny mpanakana sy ilay akora fandokoana, dia nampihena ny fisefoana ny ADP fa tsy nampitombo azy, ary nampirisika izany ny fanakanana ny fitaterana fa tsy nampiadana azy. Mbola niova tamin’ny lalana mahazatra ihany anefa ny potansialin’ny fonona. Mamitaka ny fijerena ny fanjifana ôksizena irery amin’ity rafitra ity.

Fikarohana fahatelo: ny fikarohana tamin’ny aty izay nitsapa ny Kompleksa I sy II, fa tsy III

Lee sy Boelsterli dia nampiasa mitôkôndrian’ny atin’ny totozy sy selan’aty nokolokoloina, izay nosimban’ny efavirenz (Kompleksa I, IC50 manodidina ny 30 micromolar) sy hydrazine, vokatra avy amin’ny metabolisman’ny isoniazid (Kompleksa II, IC50 manodidina ny 30 micromolar). Ny akora fandokoana tamin’ny 30 micromolar teo ho eo dia namerina ny ôksidasionan’ny NADH, ny potansialin’ny fonona ary ny ATP, sady nampihena ny akora mpanaoksida sy ny fahafatesan’ny sela tamin’ny nekrôzy. Ny lahatsoratra ao amin’ny Redox Biology dia manazava izany amin’ny môdely izay itondran’ilay akora fandokoana elektrôna mandalo ivelan’ny Kompleksa I sy II simba.

Io vokatra io dia manome toe-javatra efa ekena momba ny tapany mialoha amin’ny rojo. Tsy milaza na inona na inona momba ny Kompleksa III anefa izy, satria tsy nisy nosakanana teo. Tsy afaka manamarina na mandà ny iray amin’ireo fikarohana tamin’ny atidoha izy.

Ny tabilao fampitahana ny fepetra

Antony efatra ahafahan’ireo fikarohana roa momba ny Kompleksa III samy marina amin’ny fepetra nampiasainy

1. Tsy nitovy ny fanakanana natao. Antimycin irery tamin’ny 1 microgram per ml no ampitahaina amin’ny antimycin 0.3 micromolar sy mpanakana manokana ny toerana Qo. Ny lalana ampiasain’ilay akora fandokoana hampidirana elektrôna amin’ny toerana Qo dia tsy mandeha eo amin’ny toerana izay ahombiazan’ny lalana mivantana mankany amin’ny cytochrome c. Tsy afaka misolo ny toerana roa ny toerana iray.

2. Tsy nitovy ny fatran’ilay akora fandokoana sy ny fotoana. 1 sy 2 micromolar no fifantohana lehibe nampiasaina, tamin’ny akora manao tsingerina redôksa izay miankina amin’ny fifantohana sy ny fotoana ny fidirany sy ny famparedio mivantana ny cytochrome c ataony. Ny elanelana kely amin’ny fatra miaraka amin’ny fotoana fandrefesana samy hafa dia afaka mampiseho sampana samy hafa amin’ny tambajotra iray.

3. Tsy nitovy ny fanomanana. Ny fanokanana amin’ny digitonin sy ny fanokanana amin’ny gradient Percoll dia mifantina vondrona mitôkôndria mifanindry amin’ny ampahany fa tsy mitovy tanteraka. Nitovy ny fifantohan’ny proteinina, 0.1 mg isaky ny ml, ka tsy io no anton’ny fahasamihafana. Tsy toy izany kosa ny vondrona madinika voafantina sy ny fahatoavan’ny mitôkôndria. Ary voahilika ny ahiahy fa ny karazana biby no antony: nahavita namerina ilay vokatra tamin’ny totozy koa ny vondrona faharoa.

4. Ny toetry ny sôbstrà no mamaritra izay azon’ilay akora fandokoana atao. Fepetra telo momba ny sôbstrà no ampitahaina amin’ny tsiroaroa mifandray amin’ny NADH. Ny famatsiana NADH sy ny potansialin’ny fonona miaraka no mamaritra ny hafainganam-pamparedio ilay akora fandokoana sy ny toerana izarany. Miankina amin’io safidy io ny lalana izay mila akora fandokoana voaredio eo akaikin’ny cytochrome c voaoksida.

Fomba famakiana ny filazana manaraka momba ny fandalovana ivelan’ny sakana

Anontanio hoe iza amin’ireo kompleksa no nosakanana, tamin’ny mpanakana inona, teo amin’ny toerana iza ary tamin’ny fatra firy. Anontanio ny fifantohan’ilay akora fandokoana sy ny fotoana nanaovana ny fandrefesana. Anontanio ny sela nanaovana fikarohana, ny karazana biby, ny fomba fanokanana, ny fifantohan’ny proteinina ary ny sôbstrà. Ary anontanio raha mifanaraka ny potansialy, ny fisefoana, ny toetry ny redôksa ary ny fitsapana mivantana ny famindrana elektrôna, satria imbetsaka teto no nanondro lalana diso ny fanjifana ôksizena irery.

Mbola mitombina ilay famintinana voafetra. Ekena ny fandalovan’ilay akora fandokoana ivelan’ny Kompleksa I. Ho an’ny Kompleksa III, ny mitôkôndrian’ny totozy miaraka amin’ny antimycin 1 microgram per ml sy akora fandokoana 1 micromolar dia tsy mampiseho fandalovana mahavita mamerina ny fiasany. Ny karazana telo kosa, miaraka amin’ny antimycin 0.3 micromolar na myxothiazol 1 micromolar sy akora fandokoana 2 micromolar, dia mampiseho fandalovana amin’ny ampahany miaraka amin’ny famindrana mivantana avy amin’ilay akora fandokoana mankany amin’ny cytochrome c. Afaka miara-mitombina ireo fehezanteny ireo. Fanitarana mihoatra ny angon-drakitra ny filazana mivelatra kokoa.

Ireo vakiteny mifandraika dia mametraka ilay filazana iadian-kevitra ao anatin’ny simia tsy iadian-kevitra: ny fomba ampindran’ny manga metilena elektrôna ho an’ny fifandimbiasan’ny famindrana, ireo andrana momba ny fandalovana ivelan’ny Kompleksa I ho an’ilay tranga efa ekena any amin’ny tapany mialoha, ny fandrefesana ny potansialin’ny fonona sy ny vokatra sandoka mety haterany mba hahatakarana ny antony nilana akora fandokoana roa, ary ny fikarakarana akora manao tsingerina redôksa ao amin’ny laboratoara ho an’ireo fandrika mifandray amin’ny fatra sy ny fotoana.