Pauls Ērlihs un metilēnzilais: kā krāsviela palīdzēja veidot zāļu atklāšanas pieeju

Paula Ērliha ieguldījums medicīnā nebija zāles. Tas bija pamatojums tam, kā uz zālēm raudzīties.

1878. gadā viņš iesniedza doktora disertāciju, kuras pirmā sadaļa bija nosaukta par "Krāsošanas ķīmisko izpratni". Tajā viņš apgalvoja, ka audu griezuma iekrāsošana un auduma gabala krāsošana notiek pēc vienas un tās pašas loģikas. Abos gadījumos krāsviela piesaistās materiālam ķīmiskas afinitātes dēļ, nevis tāpēc, ka audi būtu uzsūcoši, taukaini vai veidoti tā, lai aizturētu pigmentu. Ērlihs bija uzaudzis, vērojot, kā viņa brālēns, patologs Karls Veigerts, gatavo iekrāsotus audu griezumus, un viņa uzmanību saistīja nevis attēli, bet gan tas, ka krāsviela izvēlējās, kur nonākt.

Šis apgalvojums šķiet pieticīgs. Taču tā nav. Ja krāsviela saistās ar audiem ķīmisku iemeslu dēļ, tad krāsojuma izvietojums sniedz ziņas par šo audu ķīmisko sastāvu. Iekrāsots preparāts uz priekšmetstikliņa vairs nav ilustrācija — tas kļūst par mērījumu.

Viņš uzreiz turpināja šo darbu. 1880. gadā viņš apvienoja metilēnzilo ar skābo fuksīnu un nosauca maisījumu par neitrālu krāsvielu — neitrālu krāsojošu vielu. Tā ļāva atšķirt dažādus balto asinsķermenīšu veidus, ko tolaik lietotās atsevišķās krāsvielas nespēja. Divus gadus vēlāk viņš iepazīstināja ar metilvioleta metodi tuberkulozes nūjiņu iekrāsošanai, un Kohs pārņēma šo procedūru savā darbā.

Teorija, kas vēlāk šīm metodēm deva kopīgu pamatu, ir atsevišķs jautājums, un tās rašanās laiks bieži tiek nepamatoti vienkāršots. Ērliha sānu ķēžu teorija — doma, ka viela iedarbojas uz šūnu, jo abas ir ķīmiski saderīgas, — attiecas uz 1890. gadiem, nevis uz krāsvielu pētījumu gadiem. Agrākie darbi deva sākotnējo pārliecību: selektivitāte ir ķīmiska, tāpēc to var mērķtiecīgi meklēt, nevis tikai nejauši atklāt.

Eksperiments, kas pārvērta krāsvielu par karti

1885. gadā Ērlihs publicēja monogrāfiju par organisma vajadzību pēc skābekļa ar apakšvirsrakstu, kas to raksturoja kā krāsu analīzē balstītu pētījumu. Metode paredzēja injicēt krāsvielas, kuru krāsa ir atkarīga no oksidācijas pakāpes, un pēc tam salīdzināt, kā dažādi orgāni tās reducē vai saglabā. Krāsviela tika izmantota kā instruments, gluži kā termometrs: tā sniedza ziņas par apstākļiem audos, kurus nevarēja novērot tieši. Ērlihs pats mērķi formulēja kā dzīvu orgānu reducējošās spējas noteikšanu ar konkrētu krāsvielu palīdzību.

Metilēnzilā rezultāts parādījās 1886. gadā rakstā par krāsvielas reakciju ar dzīviem nervu audiem, kas iepriekšējā decembrī bija nolasīts ārstu biedrībā. Metilēnzilo ievadīja dzīva dzīvnieka asinsritē, pēc tam izņēma plānus audu griezumus un pakļāva tos gaisa iedarbībai, lai uzkrājusies bezkrāsainā krāsviela oksidētos, atkal kļūtu zila un parādītu, kur tā bija sakrājusies. Nervu šūnas un nervu šķiedras iekrāsojās, turklāt pietiekami selektīvi, lai šī tehnika kļūtu par standarta metodi nervu audu attēlošanai. Savienojums vairs nebija tikai krāsojoša viela, ko uzklāj nedzīvam audu griezumam uz laboratorijas galda. Tas bija marķieris, kas izplatījās dzīvā organismā, un šo izplatību varēja nolasīt.

Abu eksperimentu pamatā esošā īpašība jāpasaka skaidri, jo no tās ir atkarīgs viss pārējais šajā stāstā. Metilēnzilā pārvērtība ir atgriezeniska. Tā reducētā forma, leikometilēnzilais, ir bezkrāsaina, un saskarē ar skābekli tā atkal pārvēršas par zilo katjonu. Krāsvielas šķīdums glikozē noslēgtā burkā ir bezkrāsains; atverot burku, tas kļūst zils. Tiek ziņots, ka Ērlihs to demonstrējis tieši, apstrādājot iekrāsotus audu griezumus gan ar dzelzs hlorīdu, gan ar gaisu un vērojot krāsas atgriešanos. Krāsviela, kas maina krāsu līdz ar apkārtējās vides oksidēšanās–reducēšanās stāvokli, kalpo par šīs vides zondi.

Tātad līdzās pastāvēja divas īpašības. Krāsviela varēja atšķirt vienus audus no citiem. Un krāsvielu varēja ieslēgt un izslēgt, mainot oksidācijas pakāpi.

Raugoties atpakaļ, otrā īpašība iezīmē ķīmijterapijas sākumu. Ja savienojums saistās ar viena veida audiem, bet ne ar cita veida audiem, tas pats savienojums varētu sasniegt viena veida organismu, bet ne citu. Ērlihs šo secinājumu formulēja tieši: ja patogēnu var iekrāsot selektīvi, krāsojums varētu norādīt uz specifisku kaitējumu šim patogēnam. Tāpēc krāsviela varētu būt izmantojama kā zāles, kas vērstas pret iebrucēju, nevis pacientu.

Pirmais izmēģinājums pacientam nebija saistīts ar malāriju. 1890. gadā Ērlihs kopā ar psihiatru Arturu Lepmanu ziņoja, ka metilēnzilais mazinājis sāpes neiralģisku un reimatisku muskuļu, locītavu un cīpslu stāvokļu gadījumā. Abi apsprieda, vai zāles varētu iedarboties uz psihiskām slimībām, un nolēma to neizmēģināt. Itāļu ārsts Pjetro Bodoni no Dženovas tomēr to darīja. Viņa 1899. gada raksta nosaukums attiecas uz nomierinošu iedarbību dažādu psihozes formu gadījumā: viņš aprakstīja nomierināšanos četrpadsmit uzbudinātiem pacientiem un norādīja, ka citi Dženovas ārsti jau izmantoja krāsvielu tam pašam nolūkam. Sedācija nav iedarbība uz pašu slimību, un šī atšķirība šajā vēsturē parādās atkārtoti.

Darbs ar malāriju sākās 1891. gadā kopā ar patologu Paulu Gutmanu Moabitas slimnīcā Berlīnē. Metilēnzilo deva diviem pacientiem, un ziņojums tika publicēts Berliner klinische Wochenschrift 1891. gada 28. septembra numurā. Pirmajā gadījumā pacients 29. jūnija vakarā vienā reizē lietoja 0.5 g krāsvielas; gaidītā lēkme pilnībā neiestājās, un vienīgā vēlāk reģistrētā sūdzība bija viegla strangūrija ar zilu urīnu. Drudža lēkmes izzuda pirmajās dienās, un parazīti no asinīm bija pazuduši vēlākais astotajā dienā. Pašu autoru kopsavilkums bija tāds, ka viņu cerības pilnībā piepildījušās. Divi gadījumi bez kontroles grupas nav pierādījums. Plašāks apraksts par metilēnzilo un malāriju, tostarp mūsdienu pētījumiem, ir atsevišķā lapā, bet šeit interesējošais jautājums ir šaurāks: cik daudz no Ērliha pamatojuma izturēja saskari ar parazītu.

Kur pamatojums izturēja pārbaudi un kur tas izgāzās

No ierosinātā mehānisma saglabājās maz, vismaz ne Ērliha piedāvātajā formā. Vienkāršotais skaidrojums, kurā plakans triciklisks katjons ieslīd starp parazīta DNS bāzu pāriem, neiztur pārbaudi attiecībā uz Plasmodium. Inficēts eritrocīts metilēnzilo reducē tik viegli, ka tas vispār nesasniedz parazītu plakana katjona veidā, un interkalācijas skaidrojums, kas der akridīna krāsvielām, šai krāsvielai neder.

Pierādījumu atbalstītais skaidrojums ir mazāk vienkāršs. Metilēnzilais inhibē parazīta glutationa reduktāzi koncentrācijās, ko iespējams sasniegt pacienta organismā. Tas bloķē hēma pārvēršanu hemozoīnā — inertā pigmentā, ko parazīts veido, lai izvairītos no saindēšanās ar paša hemoglobīna šķelšanas produktiem — aptuveni tikpat efektīvi kā hlorohīns un daudz efektīvāk nekā hinīns. Tā oksidēšanās–reducēšanās cikli arī rada reaktīvās skābekļa formas šūnā, kas tās jau ražo. Kurš no šiem ir īstais mehānisms vai arī savu ieguldījumu dod visi, joprojām nav noskaidrots.

Ir vēl viens sarežģījums, un tam būtu jāietekmē jebkura vēsturiska apgalvojuma par šo savienojumu interpretācija. Tā laika komerciāli pieejamais metilēnzilais nebija viena viela. Paraugi saturēja Azure B — radniecīgu savienojumu ar vienu nošķeltu metilgrupu —, un vecākos šķīdumos tā uzkrājās vairāk. Azure B ir metahromatiska krāsviela ar citiem mērķiem: tā iekrāso divpavedienu DNS tumši zilā, bet RNS — zaļā krāsā. Divu krāsvielu maisījums, kurā katra nonāk citur un kura proporcijas neviens nav reģistrējis, nevar pamatot nepārprotamu apgalvojumu par to, ko paveicis tajā esošais metilēnzilais.

Pati krāsviela nekad neaizstāja hinīnu. Metodei klājās labāk. Ērliha skolnieks Vilhelms Rēls, strādājot krāsvielu un zāļu koncernā IG Farben, turpināja virzīt krāsvielu atvasinājumus kā zāles tropu slimībām un ieviesa trūkstošo instrumentu: ar putnu malāriju inficētu kanārijputniņu kā standarta pārbaudes modeli potenciāliem savienojumiem. Pēc tam Verners Šūlemans mainīja sānu ķēdi, un iegūtais fenotiazīnija sāls izārstēja eksperimentālo infekciju. Tas joprojām padarīja pacientus zilus.

Ilgmūžīgais rezultāts izrādījās nevis krāsviela vai gredzenu sistēma, bet gan sānu ķēde. Dialkilaminoalkilamino grupas pievienošana mainīja molekulas uzvedību, un šis fragments saglabājās visās turpmākajās pārveidēs. Saglabājot šo grupu un aizstājot fenotiazīnija gredzenu ar akridīna gredzenu, iegūst hinakrīnu. Aizstājot to ar hinolīna gredzenu, iegūst hlorohīnu. Pamahīns, primahīns un amodiahīns, kas visi joprojām ietilpst pretmalārijas līdzekļu klāstā, satur to pašu grupu. Savienojums, kas neizdevās kā ārstēšanas līdzeklis, deva fragmentu, kas izrādījās veiksmīgs.

Saikne ar antipsihotiskajiem līdzekļiem veidojas caur gredzenu, nevis caur zālēm. Tieši metilēnzilā struktūras noskaidrošana 1883. gadā aizveda Heinrihu Augustu Berntsenu pie fenotiazīna pamatkodola, un pie šā molekulārā karkasa ar dažādiem aizvietotājiem 1940. gados strādāja Rhône-Poulenc ķīmiķi, meklējot antihistamīnus. Viens no šiem savienojumiem tika sintezēts ap 1950. gada beigām, un to pārbaudīja ķirurgs Anrī Laborī, kurš ievēroja, ka tas padara pacientus mierīgus un vienaldzīgus. Pirmais publicētais lietojums psihiatrijā pacientam ar māniju bija 1952. gada janvārī. Pirmais antipsihotiskais līdzeklis drīzāk ir tāls radinieks krāsvielai, ar kuru Ērlihs sāka, nevis viņa pretmalārijas līdzekļa pēctecis.

Trīs ieradumi, ko vērts pārņemt no šīs epizodes

1. Apzīmējums "pirmās sintētiskās zāles, ko izmantoja medicīnā" raksturo kategoriju, un nepieciešamās atrunas ir plašākas, nekā šī frāze liek domāt. Frāze ir iesakņojusies; bieži citēts Širmera un kolēģu pārskats žurnālā Neurobiology of Aging sauc metilēnzilo par pašām pirmajām pilnīgi sintētiskajām zālēm, kas izmantotas medicīnā. Hlorālhidrāts kā sintētisks nomierinošs līdzeklis tika ieviests 1869. gadā, vairāk nekā divdesmit gadus agrāk. Pats 1891. gada raksts sniedz daļu atbildes, jo tā autori nosauc sintētiskos pretdrudža līdzekļus, kas jau bija izrādījušies neveiksmīgi pret malāriju, tostarp hinolīnu, antipirīnu un antifebrīnu. Paša Ērliha arsēna preparāts sifilisa ārstēšanai parādījās vēl vēlāk. Aizstāvamā apgalvojuma versija attiecas uz metodi, nevis pirmtiesībām: metilēnzilais ir viens no agrīnākajiem sintētiskajiem savienojumiem, kas izvēlēti iedarbībai pret konkrētu organismu, balstoties uz ķīmisku selektivitātes teoriju.
2. Selektīva izplatība nenozīmē selektīvu labumu. Ērliha 1886. gada rezultāts bija tas, ka krāsviela nonāk nervu audos. Kur savienojums nonāk un ko tas tur dara, ir divi atšķirīgi mērījumi, un pirmo veikt ir daudz vieglāk. Šajā plaisā kopš tā laika ir mājojusi lielākā daļa apgalvojumu par metilēnzilo un smadzenēm.
3. Tīrība ir daļa no pierādījumiem, nevis mārketinga. Vēsturiskie dati ir neviennozīmīgi tieši šā iemesla dēļ. Nelielas strukturālas atšķirības maina to, kur šis savienojums nonāk, tāpēc analīzes sertifikātam jābūt saistītam ar konkrētu partiju, nevis jākalpo par vispārīgu apliecinājumu, ka produkts ir pārbaudīts. Pārdevējs, kurš apgalvo atbilstību farmakopejas monogrāfijai, bet pārbauda tikai smagos metālus, apgalvo vairāk, nekā ziņojums pamato. Blupreme iegādājas metilēnzilo no farmaceitiskā ražotāja un pārbauda visu monogrāfijā noteikto specifikāciju: identitāti, tīrību, organiskos piemaisījumus, atlikušo šķīdinātāju saturu, elementu piemaisījumus, atlikumu pēc izdedzināšanas, mikrobioloģiskās robežvērtības un baktēriju endotoksīnus. Ziņojums tiek publicēts līdzās produktam, un lapā par USP kvalitātes metilēnzilo ir skaidrotas šīs robežvērtības un tas, kāpēc Azure B rezultāts ir pirmais, kam pievērst uzmanību.

Avotu hronoloģija

Nozīmīgāko notikumu hronoloģija, tostarp krāsvielu ķīmija pirms Ērliha un kvalitātes pakāpes un specifikācijas pēc viņa, ir izklāstīta atsevišķi metilēnzilā vēsturē, bet paša savienojuma identitāte aplūkota rakstā par to, kas ir metilēnzilais.

Šā apraksta pamatā esošās ilustrācijas, kas reproducētas Kraftsas, Hpelmaņa un Skurskas-Staņas 2012. gada pārskatā, nav līdzvērtīgas, un viens piemērs parāda, kāpēc. 1891. gada ilustrācija ir izmēģinājuma primārā liecība; līdzās esošais 1910. gada portrets datē tikai reputāciju un neko vairāk. Andersāga 1934. gada piezīmju grāmatiņas lappuses ir tieša liecība par aizvietošanu ar hinolīnu, rakstīta paša ķīmiķa rokā.

Godīgs Ērliha krāsvielu eksperimentu kopsavilkums ir šāds: viņš pareizi noteica selektivitāti un mērķi, bet kļūdījās par mehānismu. Metilēnzilais patiešām koncentrējas nervu audos un patiešām kaitē malārijas parazītam. Tas nedara otro pirmā dēļ, un viņa piedāvātais ķīmiskais skaidrojums abiem bija nepareizs. Tas, ko viņš pierādīja neapstrīdami, bija ilgmūžīgāks par pareizu mehānismu: savienojumu var izvēlēties, nevis nejauši atrast, un izvēli var balstīt pierādījumos, kas iegūti, pirms kāds to dod pacientam.