Metilēnzilais un skeleta novecošana: kāpēc šūnu pētījumu rezultāti neparedzēja iznākumus peļu kaulos

Iedomājieties savienojumu, kas apslāpē tieši tās šūnas, kuras noārda kaulus, un laboratorijas traukā darbojas tieši tā, kā cerēts. Mazāk daudzkodolainu osteoklastu, skaidra atbildes reakcija uz devu un ticams ar mitohondrijiem saistīts skaidrojums. Tad to pašu savienojumu dod pelēm lielāko daļu to pieaugušā mūža, to skeletus skenē trīs dimensijās, un nekādas atšķirības nav. Novecojušie kauli izskatās novecojuši neatkarīgi no tā, vai savienojums ir saņemts.

Tāda ir godīga viena 2024. gada pētījuma aina, un to ir vērts izprast precīzi, jo tā atrodas tieši uz robežas, pie kuras sabrūk vairums apgalvojumu par uztura bagātinātāju ietekmi uz kauliem. Tas ir Poudel un kolēģu raksts, kas publicēts žurnālā Aging 2024. gada martā, un tas ir brīvi pieejams, tāpēc katru tālāk minēto mērījumu var pārbaudīt avotā. Tā galvenais rezultāts ir efekta neesamība. Rezultāti, kas neuzrāda efektu, nav neveiksmes. Tās ir atbildes, un šis pētījums labi atbild uz šauru jautājumu: vai ilgstoša sistēmiska antioksidantu lietošana — metilēnzilā vai mitohinona veidā — saglabā novecojošu peļu skeletu? Nē.

Kā kaulu novecošana izskatās skaitļos

Kaulu zudums līdz ar vecumu nav viena parādība, tāpēc pētījumā nemērīja tikai vienu rādītāju. Izmantojot mikrodatortomogrāfiju, pētnieki skenēja trīs skeleta vietas: kortikālo kaulu augšstilba kaula diafīzes vidusdaļā jeb blīvajā kaula stobrā, trabekulāro kaulu augšstilba kaula distālajā metafīzē jeb porainajā tīklā pie locītavas un trabekulāro kaulu piektajā jostas skriemelī. Katrā vietā viņi reģistrēja standarta mikroarhitektūras rādītājus. BV/TV ir tilpuma daļa, ko aizņem kauls, nevis kaulu smadzeņu telpa. BMD ir minerālais blīvums. Tb.Th, Tb.N un Tb.Sp raksturo trabekulu biezumu, skaitu un attālumu starp tām. Kortikālā slāņa biezums un šķērsgriezuma laukumi raksturo kaula stobru.

Iztēlojieties trabekulāro kaulu kā balstu konstrukciju noliktavas iekšpusē. Novecošana dažus balstus izņem pilnībā un pārējos padara plānākus, tāpēc samazinās telpas daļa, ko aizņem konstrukcija, atlikušie balsti atrodas tālāk cits no cita un viss karkass spēj nest mazāku slodzi. Kortikālais kauls ir pati noliktavas siena, kas kļūst plānāka. Iedarbībai, kas aizsargā skeletu, būtu jāatspoguļojas šajos skaitļos. Tieši šādu pārbaudi veica pētījumā.

Kas notika laboratorijas traukā

Šūnu eksperimentos izmantoja kaulu smadzenes, kas iegūtas no 6 līdz 7 mēnešus vecu UM-HET3 peļu augšstilba un lielajiem lielakauliem. UM-HET3 ir ģenētiski daudzveidīga līnija, kas izveidota novecošanas pētījumiem. Tika iegūti četri rezultāti, un tie norāda dažādos virzienos, tāpēc katrs jāaplūko atsevišķi.

Pirmkārt, mezenhimālās cilmes šūnas — šūnu kopums, kurā ietilpst arī nākamās kaulu veidojošās šūnas — saglabāja dzīvotspēju 48 stundas metilēnzilā un mitohinona koncentrācijās no 0.125 līdz 0.5 mikromolāriem. Nebija ne toksicitātes, ne dzīvotspējas uzlabojuma. Otrkārt, kad šīs cilmes šūnas osteogēnā barotnē rosināja kļūt par osteoblastiem un 18. dienā iekrāsoja sārmainās fosfatāzes noteikšanai, neviens savienojums nemainīja rezultātu nevienā pārbaudītajā koncentrācijā. Kaulu veidojošās šūnas traukā nereaģēja.

Treškārt, kaulu noārdošās šūnas gan reaģēja. Kaulu smadzeņu prekursoršūnas, kas stimulētas ar M-CSF un RANKL — standarta kombināciju osteoklastu veidošanai —, koncentrācijai pieaugot, veidoja mazāk TRAP pozitīvu daudzkodolainu šūnu. Skaidrs samazinājums parādījās virs 0.25 mikromolāriem, praktiski pie augstākās pārbaudītās koncentrācijas — 0.5. Tieši šis rezultāts rosina neskaitāmus optimistiskus kopsavilkumus, un savās robežās tas ir patiess: tieša, nepārtraukta iedarbība kultūrā nomāca osteoklastu veidošanos atkarībā no devas.

Ceturtkārt, nobriedušiem osteoblastiem, kas 48 stundas pakļauti savienojumu iedarbībai un pārbaudīti mitohondriju stresa testā, neviens savienojums būtiski nemainīja ne bazālo, ne maksimālo skābekļa patēriņu. Pie 0.5 mikromolāriem abi šķietami nedaudz samazināja šūnu elpošanu, taču izmaiņa nesasniedza statistisko nozīmīgumu. Tātad kaulu veidojošajās šūnās laboratorijas traukā netika konstatēts mitohondriju darbības uzlabojums, ko varētu nostatīt līdzās osteoklastu nomākšanas efektam. Ierosinātais mehānisms — enerģētikas uzlabošana ar mitohondriju elektronu transporta ķēdes starpniecību — neradīja izmērāmu šūnu elpošanas uzlabojumu tur, kur pētnieki to meklēja.

Kas notika pelēs

Sekoja divi dzīvnieku eksperimenti ļoti atšķirīgā mērogā.

Mazākajā izmantoja inbrīdās C57BL/6J mātītes — biomedicīnas pētījumos plaši izmantotu peļu līniju. Sākot no 18 mēnešu vecuma, kas pelēm aptuveni atbilst vēlīnam pusmūžam, puse dzēra ūdeni ar 250 mikromolāru metilēnzilā koncentrāciju 6 vai 12 mēnešus, līdz 24 vai 30 mēnešu vecumam. Neārstētas 18 mēnešus vecas mātītes kalpoja par sākuma atskaites punktu, savukārt 5 mēnešus vecas mātītes parādīja, kā izskatās jauni kauli. Novecošana darīja tieši to, ko novecošana dara. L5 skriemelī kaula tilpuma daļa samazinājās aptuveni par 35 procentiem, minerālais blīvums — aptuveni par 18 procentiem, bet trabekulu skaits samazinājās apmēram uz pusi neatkarīgi no metilēnzilā saņemšanas. Kortikālā slāņa biezums starp 18 un 24 mēnešiem samazinājās aptuveni par 10 procentiem, bet līdz 30 mēnešiem — aptuveni par 30 procentiem. Metilēnzilais nemainīja nevienu no šīm līknēm.

Lielākais eksperiments notika ASV Nacionālā novecošanas institūta Intervenču testēšanas programmas ietvaros, kurā iespējamos iedarbīgos savienojumus pārbauda abu dzimumu UM-HET3 pelēm trīs pētniecības centros. Metilēnzilo barībā 28 daļu uz miljonu koncentrācijā un mitohinonu 100 daļu uz miljonu koncentrācijā sāka dot agrīnā pieaugušā vecumā un turpināja līdz aptuveni 22–24 mēnešu vecumam. Tās pašas trīs skeleta vietas pārbaudīja ar mikro-CT. Publicētajā tabulā katrs rādītājs norādīts pēc dzimuma un saņemtā savienojuma, izmantojot koriģētu statistisko analīzi, un iedarbības ailē visur ir viens un tas pats: nekur nav būtiska efekta vai mijiedarbības starp savienojuma saņemšanu un dzimumu. Kortikālais vai trabekulārais kauls, augšstilba kauls vai mugurkauls, tēviņš vai mātīte, metilēnzilais vai mitohinons. Skelets novecoja ierastajā gaitā.

Abu pētījuma daļu salīdzinājuma tabula

Šī tabula ir visa raksta pamats. Katrā rindā savienots tas, ko laboratorijas trauks parādīja par konkrētu bioloģisko procesu, ar to, ko parādīja dzīvnieks, izmantojot paša pētījuma mērījumus.

Lasot tabulu rindu pa rindai, paradokss izzūd. Reaģēja tikai viens no četriem šūnu procesiem, turklāt tikai tuvu pārbaudītā diapazona augšējai robežai nepārtrauktas tiešas iedarbības apstākļos. Visos pārējos šūnu eksperimentos efekta jau nebija. Dzīvnieku rezultāts tad mazāk izskatās pēc pretrunas un vairāk pēc apstiprinājuma: trīs rezultāti bez efekta un viens nosacīts efekts kultūrā pārtapa visaptverošā efekta neesamībā dzīvniekā.

Kaulu struktūra nav mūža ilgums

Vienam pārpratumam pienākas atsevišķa sadaļa, jo metilēnzilajam patiešām ir dati par mūža ilgumu, un tos ir viegli kļūdaini uztvert kā datus par kauliem. Agrākā Intervenču testēšanas programmas kohortā metilēnzilais tajā pašā devā barībā palielināja UM-HET3 mātīšu mūža ilguma 90. procentili aptuveni par 6 procentiem. Tas bija izdzīvotības efekts vēlīnā dzīves posmā bez mediānā mūža ilguma izmaiņām un bez efekta tēviņiem. Mitohinons neietekmēja mūža ilgumu nevienam dzimumam. Šie izdzīvotības skaitļi nāk no programmas publicētajiem ilgmūžības datiem, nevis no kaulu pētījuma.

Kaulu pētījuma ieguldījums ir šo datu nošķiršana. Savienojums var mainīt izdzīvotību vēlīnā dzīves posmā vienam dzimumam, nesaglabājot nevienu izmērīto skeleta īpašību. Izdzīvotības datos uzskaita nāves gadījumus visu cēloņu dēļ; mikro-CT uzskaita balstus skriemelī. Nav noteikuma, ka intervencei jāpagarina mūžs, iedarbojoties uz kauliem, un šis pētījums tieši pierāda, ka metilēnzilā efekts mātītēm vēlīnā dzīves posmā īstenojās pa citu ceļu. Ikviens, kurš atsaucas uz mūža ilguma rezultātu kā pamatojumu metilēnzilā lietošanai osteoporozes gadījumā, tērē līdzekļus no nepareizā konta. Vispārīgā pieeja šo datu nošķiršanai aplūkota rakstā par to, kā lasīt metilēnzilā pētījumus.

Kāpēc laboratorijas trauks neparedzēja peles rezultātu

Datiem atbilst pieci skaidrojumi, un tie cits citu neizslēdz.

Pirmais ir iedarbības apstākļi. Šūnas kultūrā pastāvīgi atradās vidē ar zināmām koncentrācijām. Peles mēnešiem ēda barību ar pievienotiem savienojumiem, bet pētījumā nemērīja ne šo vielu līmeni kaulu smadzenēs, ne kādu oksidatīvā bojājuma marķieri kaulos. Koncentrācija, kas nomāc osteoklastus, tieši iedarbojoties uz šūnām, kaulu smadzeņu prekursoršūnās var nekad netikt sasniegta. Pētījumā in vivo pārbaudīja vienu katra savienojuma devu, tāpēc atbildes reakcija uz devu dzīvniekā paliek nezināma.

Otrais ir ķīmija. Reaktīvās skābekļa formas šūnā neveido vienu labi sajauktu kopumu. Tās darbojas mazos nodalījumos īsos laika intervālos, un mitohondriju, citosola un membrānu oksidēšanās–reducēšanās sistēmas darbojas daļēji neatkarīgi. Mitohinons ir veidots tā, lai koncentrētos mitohondrijos, savukārt oksidatīvie signāli, kas virza osteoklastu veidošanos, var rasties citur. Viena kopuma samazināšana ne vienmēr atkārto to, ko panāk nepārtraukta iedarbība uz visu šūnu.

Trešais ir procesu sasaistījums. Dzīvā kaulā rezorbcija un veidošanās ir saistītas: osteoklasti un to kaimiņšūnas izdala signālus, kas piesaista kaulu veidojošās šūnas tikko rezorbētajai vietai. Osteoklastu veidošanās nomākšana nerada līdzvērtīgu kaula pieaugumu, jo tā var arī novērst signālus, kas piesaista būvētājus. Trauks, kurā ir tikai prekursoršūnas, šo atgriezenisko saiti nevar parādīt. Skelets to nevar noslēpt.

Ceturtais ir slodze. Osteocīti uztver mehānisko deformāciju un nosaka pārbūves līdzsvaru visam kaulam. Dzīvniekiem novecojot un kustoties mazāk, mehāniskais signāls vājinās, un kaulu zudums seko neatkarīgi no mērenas farmakoloģiskas ietekmes uz vienu šūnu tipu. Paši autori fiziskās aktivitātes un kaulu veidošanos veicinošu slodzi nosauc par ticamāku ietekmes sviru — tas ir pieklājīgs veids, kā pateikt, ka skelets vairāk klausās fizikā nekā oksidēšanās–reducēšanās ķīmijā.

Piektais ir uzsākšanas laiks, taču ar atrunu. C57BL/6J eksperimentā savienojuma lietošanu sāka 18 mēnešu vecumā, kad jau bija noticis būtisks struktūras zudums, un neviens rezorbciju nomācošs līdzeklis nevar atjaunot trabekulas, kas ir perforētas un zudušas, bez atbilstoša kaulu veidošanās stimula. Taču uzsākšanas laiks nevar izskaidrot visu, jo Intervenču testēšanas programmā savienojumus sāka dot agrīnā pieaugušā vecumā un arī tad nekas nemainījās. Vēlīns sākums izskaidro daļu no viena eksperimenta. Tas neizskaidro neko no otra.

Ko tas nozīmē apgalvojumiem par metilēnzilo un osteoporozi

Lasītājam, kurš vērtē metilēnzilo kaulu veselības vai skeleta novecošanas kontekstā, praktiskais secinājums ir īss. Labākie pieejamie ilgtermiņa pierādījumi no peļu pētījumiem neuzrāda ieguvumu skeletam no ilgstošas metilēnzilā vai mitohinona lietošanas, neraugoties uz patiesu osteoklastu nomākšanas efektu kultūrā. Mūža ilguma literatūrā metilēnzilajam konstatēts neliels efekts vēlīnā dzīves posmā tikai mātītēm, un šis pētījums rāda, ka tas neīstenojās ar kaulu starpniecību. Neviena no šīm datu kopām nepamato lietošanu cilvēkiem osteoporozes gadījumā, un datos vispār nav pētījumu par cilvēku kauliem. Jautājumi par devām un produktu drošumu cilvēkiem attiecas uz metilēnzilā drošumu un blakusparādībām, nevis uz šo peļu skeleta pētījumu.

Dziļākā atziņa ir par pierādījumu secību. Šūnu rezultāts ir apgalvojums par to, ko savienojums var darīt vienam šūnu tipam kontrolētas iedarbības apstākļos. Kaulu rezultāts ir apgalvojums par to, ko mēnešiem ilga sistēmiska iedarbība dara orgānam, kurā divi šūnu tipi ir sasaistīti mehāniskās kontroles apstākļos. Pirmajā posmā dzimst hipotēzes. Otrajā posmā šī hipotēze par skeleta novecošanu un šiem diviem antioksidantiem tika noraidīta.