Metilēnzilais, tau un amiloīds: kāpēc proteīnu eliminācijas mehānismi atšķiras

Pajautājiet, kā metilēnzilais ietekmē Alcheimera slimībai raksturīgos proteīnus, un dzirdēsiet vienu pārliecinošu atbildi tur, kur vajadzētu dzirdēt trīs atbildes ar atrunām. Mēģenē tas traucē tau molekulām salipt savā starpā. Vienā peļu modelī tas samazina šķīstošā amiloīda daudzumu, neietekmējot tau. Citā tas samazina tā enzīma aktivitāti, kas sākotnēji veido amiloīdu. Katrs no šiem atradumiem ir reāls. Neviens no tiem neatklāj visu ainu, un tie visi nenovērojas vienā un tajā pašā dzīvniekā vienlaikus. Šajā rakstā šie trīs atradumi aplūkoti atsevišķi, lai viena eksperimenta rezultātu vairs necitētu kā pierādījumu citam.

Lasītājiem, kuri vēlas plašāku priekšstatu par to, kā metilēnzilais darbojas šūnās, vajadzētu sākt ar šo rakstu. Lasītājiem, kuri vēlas zināt, vai kaut kas no tā palīdzēja pacientiem, jālasa Alcheimera slimības klīnisko pētījumu pārskats, jo tieši tur ir vieta cilvēku pētījumu iznākumiem. Šajā rakstā šis pārskats netiek atkārtots.

Atradums par tau attiecas uz agregācijas testiem

Senākais no šiem trim stāstiem sākas ar bezšūnu pētījumiem par tau — proteīnu, kas veido neirofibrilāros kamolus. Tau–tau saistīšanās testā tau fragmenti sakārtojas pārotos spirālveida filamentos, un fenotiazīna krāsvielas, tostarp metilēnzilais, bloķē šo veidošanos zemā mikromolārā koncentrācijā. Vēlāki bioķīmiskie pētījumi tam sniedza ķīmisku skaidrojumu: krāsviela oksidē cisteīna atlikumus tau proteīnā, stabilizējot monomēro formu un nomācot fibrilu veidošanos, kas citādi turpinātos. Ziņotās tau agregāciju inhibējošās koncentrācijas ir aptuveni no dažiem līdz dažiem desmitiem mikromolu litrā — diapazons, kas ir svarīgs visam turpmākajam.

Ievērojiet, kāda veida apgalvojums tas ir. Tas neko nesaka par tau veidošanos, tau fosforilēšanu dzīvās smadzenēs vai tau elimināciju. Tas norāda, ka noteiktos apstākļos mēģenē oksidēta krāsviela neļauj tau molekulām sakārtoties kopā. Tas ir precīzs, šauri definēts un noderīgs rezultāts. Problēmas sākas, kad to paplašina līdz vispārīgam apgalvojumam, ka metilēnzilais novērš tau patoloģiju, jo dzīvnieku pētījumu dati šo versiju neatbalsta.

Atradums par proteasomu attiecas uz 3xTg-AD pelēm un parādīja atšķirīgu ietekmi uz amiloīdu un tau

Visskaidrāk šo iznākuma rādītāju atšķirību parāda 16 nedēļu ilgs barošanas pētījums pelēm ar trim ar Alcheimera slimību saistītām mutācijām. No sešu mēnešu vecuma dzīvnieki ēda barību, kas saturēja metilēnzilo, un pētnieki vienlaikus mērīja trīs lietas: proteasomu, amiloīda līmeni un tau.

Proteasomas aktivitāte mainījās. Himotripsīnam līdzīgā aktivitāte pieauga aptuveni par ceturtdaļu, bet tripsīnam līdzīgā aktivitāte — aptuveni par pusi, savukārt trešā katalītiskā aktivitāte būtiski nemainījās. Šķīstošā beta-amiloīda 40 un 42 daudzums katram samazinājās aptuveni par ceturtdaļu. Autori to interpretēja kā pastiprinātu elimināciju, nevis samazinātu veidošanos, jo prekursorproteīns un tā apstrādes fragmenti nemainījās, bet ūdens labirinta pārbaudes testā uzlabojās mācīšanās un atmiņa.

Taču pārējie rādītāji šīm izmaiņām nesekoja. Nešķīstošais amiloīds nemainījās. Plāksnīšu krāsojums nemainījās. Kopējais cilvēka tau un treonīna 181 pozīcijā fosforilētais tau nemainījās, un arī tau neatbilstošā lokalizācija nemainījās. Nemainījās arī mitohondriju rādītāji: nebija būtiskas ietekmes uz citohroma c oksidāzes aktivitāti, oksidāzes proteīnu vai ATP. Tātad šajā modelī un ar šo lietošanas režīmu metilēnzilais palielināja divas no trim proteasomas aktivitātēm, samazināja šķīstošā amiloīda daudzumu un normalizēja vienu uzvedības rādītāju, taču tau rādītāji, nešķīstošais amiloīds un pārbaudītie mitohondriju rādītāji palika nemainīgi.

Viena atruna šo secinājumu precizē, nevis vājina. Pētītajā vecumā šīm pelēm vēl nebija izveidojušies tau agregāti, tāpēc eksperiments nevar parādīt, ka metilēnzilais neiedarbojas uz tau kamoliem. Tas parāda, ka šķīstošā amiloīda daudzums var samazināties, kamēr mērītie tau rādītāji nemainās. Tieši šāds rezultāts — viens proteīns mainās, otrs ne — ir vajadzīgs šīs tēmas izpratnei. Ja līdz šim uzskatījāt, ka metilēnzilā izraisīta proteasomas aktivācija vienlaikus izvada abus slimībai raksturīgos proteīnus, šis pētījums šo priekšstatu labo.

Atradums par amiloīda veidošanos attiecas uz vecām PSAPP pelēm un ir pretrunā iepriekšējam mehānismam

Cita pētnieku grupa, cits modelis un pretējs skaidrojums par procesa sākumposmu. Trīs mēnešu pētījumā ar ievadīšanu caur zondi 15 mēnešus vecām PSAPP pelēm ikdienas perorāla 3 mg/kg deva samazināja plāksnīšu daudzumu dažādos smadzeņu reģionos aptuveni par trešdaļu līdz pusi un samazināja vairākas amiloīda frakcijas, tostarp oligomērus, kas tika mērīti ar īpašu testu. Taču šeit piedāvātais mehānisms bija samazināta veidošanās, nevis ātrāka eliminācija: smadzenēs samazinājās BACE1 proteīna daudzums un tā produkta C99 daudzums, bet matricas RNS daudzums nemainījās. Tas norāda uz ietekmi proteīna līmenī, nevis samazinātu gēna ekspresiju.

Pētījumi ar šūnām šo skaidrojumu nostiprināja. Bezšūnu testā ar rekombinantu enzīmu metilēnzilais tieši inhibēja BACE1, savukārt kāmja olnīcu šūnās, kas ekspresēja cilvēka amiloīda prekursorproteīnu, izdalītā amiloīda 40 un 42 daudzums samazinājās jau 1.56 mikromolārā koncentrācijā, kamēr pats prekursors nemainījās. Salīdziniet to ar iepriekšējo pētījumu, kurā prekursora apstrādes fragmenti nemainījās un rezultātu skaidroja ar elimināciju. Abi nevar aprakstīt vienu un to pašu universālo mehānismu, jo atšķiras modeļi, vecums, devas, ievadīšanas ceļi un ilgums. Tieši tā ir galvenā doma. Metilēnzilā ietekme uz amiloīdu vienā eksperimenta sistēmā izpaužas caur veidošanos, bet citā — caur elimināciju, un jebkura no šiem atradumiem citēšana bez tā eksperimentālā konteksta ir maldinoša.

Viena ķīmiskā reakcija, vairāki mērķi: cisteīna oksidēšana kā saikne

Trešais pētījumu virziens skaidro, kā viena oksidēšanās–reducēšanās reakcija var parādīties šķietami nesaistītos proteīnu pētījumos. Bioķīmiskā pētījumā par kaspāžu inhibīciju metilēnzilais inaktivēja kaspāzi-6, oksidējot tās katalītisko cisteīnu līdz sulfēnskābei; to apstiprināja masas spektrometrija, un pusei maksimālās inhibīcijas nepieciešamā koncentrācija bija aptuveni 10.6 mikromolāri. Kaspāze-3 tika inhibēta līdzīgā koncentrācijā. Autori to tieši sasaistīja ar literatūru par tau: tā pati cisteīnu oksidējošā reakcija, kas, iespējams, saglabā tau monomērā formā, var inaktivēt cisteīna proteāzi, un efektīvās koncentrācijas pārklājas.

Tas ir elegants skaidrojums, bet arī brīdinājums. Redoksaktīvai molekulai, kas oksidē atsegtus cisteīna atlikumus, jebkurā aktīvā koncentrācijā būs vairāk nekā viens mērķis. Tau agregātu izjaukšanas, kaspāžu un, iespējams, arī citu procesu pamatā ir viena un tā pati ķīmiskā darbība, bet atšķirīgi tās objekti. Šī kopīgā darbība nepadara atradumus savstarpēji aizstājamus. Tas nozīmē, ka deva un konteksts nosaka, kurš mērķis ir nozīmīgs, un ka ilgstoša lietošana, kas vērsta uz vienu no cisteīna atkarīgu procesu, var ietekmēt arī citus — uz šo apsvērumu kaspāžu pētījuma autori norādīja tieši. Saistītie jautājumi par to, kā metilēnzilā oksidēšanās–reducēšanās reakcijas nosaka tā mērķus, ko proteasomas aktivācija nozīmē citiem agregētiem proteīniem un vai ilgstoša lietošana maina mērķu profilu, katrs ir pelnījis atsevišķu apskatu.

Mehānismi pēc iznākuma rādītājiem: kurš atradums attiecas uz kuru modeli

Lasiet tabulu rindu pa rindai, un secinājums ir skaidrs. Nevienā rindā izmaiņas nav novērotas visās kolonnās. Spēcīgākais rezultāts par amiloīda veidošanos nāk no pētījuma, kurā proteasoma vispār netika pārbaudīta. Spēcīgākais rezultāts par proteasomu nāk no pētījuma, kurā prekursora apstrāde nemainījās. Atradums par tau galvenokārt attiecas uz mēģenēm un ķīmiskām reakcijām, kas skar arī citus, nemērķa enzīmus. Ikviens, kurš šīs kolonnas apvieno vienā apgalvojumā, ka metilēnzilais izvada patoloģiskos proteīnus kā vienotu grupu, raksta pārskatu par eksperimentu, kas nekad nav veikts.

Šī precizitāte jāievēro arī attiecībā uz pacientiem. Tas, vai šie mehānismi kopā nodrošina klīnisku ieguvumu, ir atsevišķs jautājums ar saviem pētījumiem un secinājumiem, un atbilde uz to ir sniegta Alcheimera slimības klīnisko pierādījumu apskatā, nevis šeit.