Metilēnzilais smadzeņu bojājumu gadījumā: izpratne par preklīniskajiem pierādījumiem

Sitiens pa galvu, nosprostota artērija un lēni progresējoša neirodeģeneratīva slimība var novest pie vienas un tās pašas problēmas: smadzenēm vairs nepietiek enerģijas sava darba veikšanai. Šis kopīgais iznākums izskaidro, kāpēc viens savienojums atkal un atkal parādās visu triju jomu zinātniskajā literatūrā. Taču kopīgs iznākums nenozīmē kopīgu pieeju. Ārstēšana pirms bojājuma, ārstēšana stundas laikā pēc tā un ārstēšana, kuras rezultātus novērtē mēnešus vēlāk, pārbauda atšķirīgas idejas, pat ja šļircē ir viens un tas pats zilais šķidrums.

Šis raksts aplūko to literatūras daļu, kas veltīta bojājumiem. Tajā pārskatīts, ko metilēnzilā lietošana smadzeņu bojājumu gadījumā nozīmē eksperimentos ar dzīvniekiem, traumatisks bojājums nošķirts no insulta un hroniskas neirodeģenerācijas, kā arī parādīts, kāpēc devas ievadīšanas laiks izskaidro lielāko daļu atšķirību starp pētījumiem.

Trīs bojājumi, viens enerģijas ražošanas traucējums

Mehānisms, kas saista šos modeļus, atrodas mitohondrijos. Parasti elektroni virzās pa elektronu transporta ķēdi, lai ražotu ATP, un veselīga ķēde ierobežo reaktīvo skābekļa formu veidošanos. Pēc bojājuma atsevišķi ķēdes posmi sāk darboties nepilnīgi, ATP ražošana samazinās un brīvo radikāļu veidošanās pieaug. 2018. gada pārskatā žurnālā Molecular Neurobiology metilēnzilais aprakstīts kā alternatīvs elektronu pārnesējs: tas pieņem elektronus no NADH un nodod tos citohromam c, palielinot IV kompleksa aktivitāti un atjaunojot ATP sintēzi pat tad, ja ķēdes sākuma daļa ir bojāta.

Ziņotie skaitļi ir konkrēti. Šūnu un audu griezumu preparātos IV kompleksa aktivitāte pieauga par 30 līdz 100 procentiem, un skābekļa patēriņš palielinājās līdztekus. Tas norāda, ka papildu elektroni veica lietderīgu darbu, nevis noplūda, veidojot radikāļus. Žurku insulta modelī ATP ražošana skartajā apvidū 24 stundas pēc ārstēšanas bija aptuveni par 30 procentiem augstāka nekā neārstētiem dzīvniekiem. 2022. gada pārskats žurnālā Biochemistry (Moscow) papildina ainu ar tālākajām sekām: mazāks oksidatīvais stress, mazāks neiroiekaisums, mazāka apoptoze, kā arī ietekme uz monoamīnoksidāzi, slāpekļa monoksīda sintāzi, mitohondriju bioģenēzi, autofāgiju un nepareizi salocītu olbaltumvielu agregāciju.

Tātad ideja ir vienkārša. Bojājums kavē elektronu parasto ceļu, bet metilēnzilais piedāvā apvedceļu. Viss turpmākais ir atkarīgs no tā, kāds ir bojājums, kad savienojums ievadīts un kā rezultāti mērīti.

Traumatisks bojājums nav insults

Traumatiska smadzeņu bojājuma modelī spēks iedarbojas pēkšņi. Primārais bojājums ir mehānisks: audi plīst, asinsvadi pārtrūkst un hematoencefāliskā barjera dažu minūšu laikā kļūst caurlaidīga. Metilēnzilais, iespējams, var ietekmēt sekundāro procesu vilni, kas seko turpmākajās stundās un dienās, kad izdzīvojušo audu mitohondriju darbība pasliktinās, iekaisums izplatās un pieaug tūska. Šo pētījumu vērtēšanas rādītāji atspoguļo šo secību: bojājuma apjoms, ūdens saturs smadzenēs, neironu izdzīvošana trieciena vietas tuvumā un vēlākā uzvedība, piemēram, motorisko funkciju atjaunošanās vai mācīšanās labirintā.

Insulta vai globālas išēmijas modelī bojājošā iedarbība noris pretēji. Asins plūsma apstājas, dažu minūšu laikā rodas enerģijas ražošanas traucējumi, un plūsmas atjaunošana izraisa arī reperfūzijas bojājumu. Šeit devas ievadīšana tiek saskaņota ar notikumu asinsvadā, bieži dažu minūšu laikā pēc oklūzijas vai reperfūzijas, un vērtēšanas rādītāji kvantitatīvi raksturo akūto audu iznākumu dažu stundu līdz vienas vai divu dienu laikā: infarkta apjomu, asins plūsmu un agrīnu funkcionālo atjaunošanos. Viena no pieejām insulta literatūrā ir iepriekšēja ievadīšana — dzīvnieki saņem devu pirms asinsvada oklūzijas. Tā pārbauda profilaksi veidā, ko galvas traumas eksperimentā ar cilvēkiem ētiski nevarētu atkārtot.

Insulta rezultāti ir pārliecinošākie literatūrā par bojājumiem, un tie ietver arī skaidrāko rezultātu bez ietekmes. Žurkām, kuras saņēma metilēnzilo reperfūzijas laikā pēc vienu stundu ilgas vidējās smadzeņu artērijas oklūzijas, 2. dienā infarkti bija par 30 procentiem mazāki, un bija saglabājusies lielāka daļa apdraudētā kodola un penumbras (Shen, 2013). Pastāvīgas oklūzijas pētījumā konstatēja lēnāku apdraudēto audu pāreju infarktā, bet neviena no abām pārbaudītajām devām nesamazināja galīgo infarkta apjomu pēc 24 stundām (Rodriguez, 2014). Trešajā oklūzijas pētījumā vidējā deva samazināja infarkta apjomu aptuveni uz pusi; tajā tieši išēmiskajās smadzenēs dokumentēja mitohondriju ultrastruktūru un mitofāgiju, vienlaikus ziņojot par šķietami pretrunīgu detaļu: izmērītā apoptoze pieauga, kamēr nekroze samazinājās (Di, 2015). Savukārt globālas išēmijas gadījumā nepārtraukta mazas devas infūzija atjaunoja citohroma c oksidāzes aktivitāti, ATP līmeni un mitohondriju membrānas potenciālu ievainojamajā hipokampa CA1 apvidū, saglabāja šos neironus un aizsargāja telpisko atmiņu (Lu, 2016). Pie šī CA1 mērījuma ir vērts pakavēties: tie ir tieši ATP un elpošanas ķēdes dati no bojātām smadzenēm, savukārt TBI literatūrā par tiem lielākoties spriež netieši, nevis tos mēra.

Hroniska neirodeģenerācija atšķiras no abiem. Alcheimera, Parkinsona un Hantingtona slimības modeļos dzīvniekiem ievada devas nedēļām vai mēnešiem ilgi un mēra olbaltumvielu agregāciju, dopamīna apriti vai pakāpenisku kognitīvo spēju pasliktināšanos. Šiem vērtēšanas rādītājiem gandrīz nav nekā kopīga ar bojājumu, kas izmērīts dažas dienas pēc trieciena. Lasītāji, kuri pārnes rezultātu no vienas kategorijas uz citu, pārceļ atziņu pāri robežai, kuru eksperimenti nekad nav šķērsojuši. Mūsu ceļvedī par neirodeģenerācijas literatūru šie ilgtermiņa pētījumi aplūkoti tiem atbilstošā kontekstā, bet salīdzinājumā ar pierādījumiem tikai par insultu detalizēti nošķirti asinsvadu nosprostojuma un trieciena pētījumu modeļi.

Kas patiesībā tika darīts TBI modeļos

Nav publicēts neviens metilēnzilā klīniskais pētījums ar cilvēkiem traumatiska smadzeņu bojājuma gadījumā. Visi TBI dati iegūti darbā ar dzīvniekiem, galvenokārt žurkām un pelēm, un tie koncentrējas ap nelielu eksperimentu kopumu, kurus ir vērts nosaukt, jo to detaļas atšķiras veidos, kas kopsavilkumos pazūd.

Agrākajā kontrolēta kortikāla trieciena pētījumā žurkām intravenozi ievadīja 1 mg/kg vienu stundu pēc viegla trieciena, pēc tam 0.5 mg/kg pēc trim stundām (Watts, 2014). Ar MRI noteiktais bojājuma apjoms ārstētajiem dzīvniekiem saglabājās mazāks visu divu nedēļu novērošanas laiku. Kļūdainu ķepas novietojumu skaits iešanas testā būtiski samazinājās 1., 2. un 7. dienā, bet ne 14. dienā. Mikroskopiskajā izmeklējumā 14. dienā deģenerējošo neironu skaits bojātajā garozā bija 270 pret 368 vienā redzes laukā, bet patoloģiska Nisla krāsojuma gadījumu skaits — 41 pret 73. Citiem vārdiem sakot, tika novērota agrīna aizsardzība, taču priekšrocība uzvedības rādītājos otrajā nedēļā izzuda.

Difūza bojājuma modelī pelēm izmantoja šķidruma perkusiju viduslīnijā un pusstundas laikā intravenozi ievadīja vienu 2 mg/kg devu (Fenn, 2015). Ārstētajiem dzīvniekiem novēroja vājāk izteiktu ar iekaisumu saistīto gēnu ekspresiju, mazāk iekaisuma mikroglijas šūnu, mazāk izteiktu tūsku un depresijai līdzīgas uzvedības neesamību 7. dienā. Tikpat svarīgi ir rezultāti bez ietekmes: pats bojājums tikai nedaudz palielināja ūdens saturu smadzenēs, un metilēnzilais nenovērsa ķermeņa masas zudumu vai motoriskās koordinācijas traucējumus. Pretiekaisuma iedarbība nav tas pats, kas pilnīga aizsardzība.

Divos pētījumos ar pelēm izmantoja vienādu shēmu — 1 mg/kg pēc vienas stundas, 0.5 mg/kg pēc sešām stundām un pēc tam ikdienas devas trīs dienas — un paplašināja mehānisma izpēti. Kortikāla trieciena modelī ārstēšana samazināja bojājuma apjomu pēc 24 stundām, 72 stundām un 14. dienā, vienlaikus saglabājot neironus un paaugstinot autofāgijas marķieru līmeni (Zhao, 2016). Šķidruma perkusijas modelī tā samazināja neironu apoptozi, mazināja paaugstināto hematoencefāliskās barjeras caurlaidību un uzlaboja neiroloģiskā novērtējuma rādītājus divu nedēļu laikā (Shen, 2019). Tomēr Zhao pētījumā pēc 72 stundām ūdens saturā smadzenēs atšķirību nebija, un Shen pētījumā 1. un 3. dienā nebija atšķirību rotarod testa rezultātos. Bojājuma un šūnu izdzīvošanas rādītāji mainījās, bet tūska un agrīnie motoriskie rādītāji ne vienmēr tiem sekoja.

Lietošanas laika ziņā izceļas eksperiments ar novēlotu devas ievadīšanu (Watts, 2016). Izmantojot to pašu trieciena modeli, pirmo devu ievadīja tikai 24 stundas pēc bojājuma. Līdz 2. dienai novēlotās ievadīšanas grupā bojājuma samazinājums bija līdzīgs dzīvniekiem, kuri saņēma ārstēšanu pirmajās stundās, un tas saglabājās 7. un 14. dienā. Uzvedības signāls bija vājāks: kļūdainu ķepas novietojumu samazināšanās novēlotās ievadīšanas grupā bija statistiski nenozīmīga tendence. Viena laboratorija, viens modelis, viens 24 stundu logs. Tas ir reāls pierādījums, ka iespēju logs sniedzas tālāk par pirmajām stundām, un vienlaikus tas ir viss šī apgalvojuma pierādījumu kopums. Jāņem vērā citur lietotā vārda «novēlots» slazds: Krievijas pētījumu sērijā, kuras nosaukumi atsaucās uz novēlotu neiroprotekciju, devas ievadīja pēc 30 minūtēm, un ar «novēlotu» apzīmēja ilgstošus rezultātus, nevis vēlu ārstēšanas sākšanu.

Mazāks fokāla bojājuma pētījums ar žurkām papildina lietošanas laika ainu no otras puses: gan devas ievadīšana tieši pirms bojājuma, gan tās ievadīšana 30 minūtes pēc tā samazināja ekstremitāšu funkciju traucējumus (Stelmashook, 2019). Iepriekšēja ievadīšana laboratorijā darbojas tieši tāpēc, ka laboratorija ieplāno bojājumu.

Šeit svarīga ir precīza devas izvēle. Pārskatos mazas devas raksturotas kā mitohondriju elpošanu stimulējošas, bet lielas — kā to kavējošas; tā ir tā pati divfāžu reakcija, kas novērojama metilēnzilā farmakoloģijā kopumā. Tāpēc rezultātus nevar interpretēt kā «vairāk zilā — labāka atveseļošanās». Katrs pētījums pārbauda vienu punktu uz līknes. Devas un atbildes reakcijas skaidrojumā šī līkne aplūkota dažādos modeļos, bet drošuma un blakusparādību profilā aprakstīts, ko tā vietā dara lielākas devas.

Salīdziniet šo tabulu: viens un tas pats savienojums, trīs atšķirīgas laika skalas. Profilakse attiecas uz vidējo rindu, tūlītēja ārstēšana — uz pirmajām divām, bet vēlākie rezultāti — uz pirmo un trešo.

Profilakse, tūlītēja ārstēšana, vēlākie rezultāti

Apgalvojumu par profilaksi ir visvieglāk pārprast. Išēmijas modeļos dzīvniekiem, kuri saņēmuši devu pirms asinsvada oklūzijas, iznākums ir labāks, un šo rezultātu dažkārt citē tā, it kā metilēnzilais aizsargātu jebkuras smadzenes pret jebkādu turpmāku bojājošu iedarbību. Tas neko tādu neparāda. Tas parāda, ka mitohondriji, kuriem iepriekš nodrošināts alternatīvs elektronu ceļš, labāk panes ieplānotu asins plūsmas zudumu. Neviens neieplāno galvas traumu.

Tūlītēja ārstēšana ir joma, kurā koncentrējas TBI pierādījumi. Devas ievadīšana stundās pēc trieciena ir vērsta uz sekundārā bojājuma kaskādi, kamēr tā vēl attīstās: enerģijas ražošanas traucējumiem, oksidatīvo stresu, iekaisumu un tūsku. Bojājuma un tūskas rādītāju uzlabošanās šeit ir reāla ārstēšanas ietekme, taču tā ir iedarbība uz procesu, nevis saplēstu audu atjaunošana.

Vēlākie rezultāti ir trešā pieeja. Uzvedība, ko novērtē nedēļas pēc bojājuma, vai olbaltumvielu aprite, ko mēra pēc mēnešiem deģenerācijas modelī, atbild uz jautājumu, vai agrīnā aizsardzība saglabājās vai lēnie procesi mainīja savu gaitu. Mazāks bojājums pēc 24 stundām, statistiski nenozīmīga uzvedības uzlabošanās tendence pēc devas, kuras ievadīšana atlikta par 24 stundām, un labāki rezultāti labirintā pēc mēnešiem ilgas devu ievadīšanas ir trīs atšķirīgi apgalvojumi ar trim atšķirīgām pierādījumu prasībām. Pašlaik tikai pirmais ir izpildījis šīs prasības vairāk nekā vienu reizi.

Ko šie pierādījumi nevar parādīt

Uz visiem iepriekš minētajiem rezultātiem attiecas viens un tas pats ierobežojums. Grauzēju mitohondriji reaģē uz metilēnzilo veidos, kas var būt kopīgi arī cilvēku mitohondrijiem, taču žurka, kurai intravenozu devu ievada dažas minūtes pēc precīzi kontrolēta trieciena, nav cilvēks, kurš vairākas stundas pēc kritiena ierodas neatliekamās palīdzības nodaļā. Anestēzija, kontrolēta bojājuma smaguma pakāpe, jauni un veseli dzīvnieki un īss novērošanas laiks ierobežo rezultātu pārnesamību. Nav neviena metilēnzilā pētījuma par sprādziena radītu bojājumu, tāpēc militārajiem lasītājiem visbūtiskākais bojājuma veids ir tas, par kuru pierādījumu ir vismazāk.

Nav arī pamata pārrēķināt devas cilvēkiem. Dzīvnieku pētījumos izmanto intravenozu un intraperitoneālu ievadīšanu devās, kas izvēlētas eksperimenta kontrolei, nevis mazumtirdzniecībā pārdotos iekšķīgi lietojamos pilienus. Nekas šajos pētījumos nenosaka lietošanas shēmu cilvēkam, un neviens no tiem nepārbauda metilēnzilo līdztekus standarta aprūpei galvas traumas gadījumā.

Tāpēc godīgs kopsavilkums ietilpst vienā rindkopā. Grauzējiem metilēnzilais, kas ievadīts ap traumatiska vai išēmiska smadzeņu bojājuma rašanās laiku, saglabā mitohondriju enerģijas ražošanu, un tai seko mazāki bojājumi un labāki atveseļošanās rādītāji. Vienā trieciena pētījumā daļa no ietekmes uz bojājumu saglabājās, pirmo devu ievadot ar 24 stundu aizkavēšanos. Vai kaut kas no tā notiek bojātās cilvēka smadzenēs, nav pārbaudīts, un TBI un insulta literatūrā pārbaudīti atšķirīgi ievadīšanas laiki un atšķirīgi vērtēšanas rādītāji. Ikviens, kurš uz šo pierādījumu pamata pārdod pārliecību, pievieno sastāvdaļu, kuras eksperimentos nekad nav bijis.