Metilēnzilais un multiplā skleroze: kas tika pārbaudīts pētījumos ar dzīvniekiem

Meklējot informāciju par metilēnzilo MS gadījumā, var atrast publikācijas, kas šķietami atbild uz vienu un to pašu jautājumu. Taču tā nav. Vienā pētījumā slimām pelēm metilēnzilo deva kā ārstēšanas līdzekli. Otrā ar to neārstēja nevienu dzīvnieku. Metilēnzilo izmantoja kā zilu krāsvielu plānu muguras smadzeņu griezumu iekrāsošanai, lai patologs mikroskopā varētu saskatīt mielīnu.

Šī atšķirība ir visa raksta pamatā. Bioloģijā šai krāsvielai ir divas lomas, kurām nav nekā kopīga, izņemot pudeli. Kā potenciālu zāļu līdzekli to ievada dzīvam dzīvniekam, lai noskaidrotu, vai mainās slimības gaita. Kā krāsvielu to pēc eksperimenta uzklāj nedzīviem, fiksētiem audiem, lai noskaidrotu, kā audi izskatījās. Nepamanot šo atšķirību, patoloģijas pētījuma metožu sadaļu var kļūdaini uztvert kā ārstēšanas rezultātu aprakstu.

Kas ir EAE, vienkāršiem vārdiem

Eksperimentālais autoimūnais encefalomielīts, ko parasti saīsina kā EAE, ir standarta dzīvnieku modelis atsevišķu multiplās sklerozes aspektu izpētei. Pētnieks pret šo modeli uzņēmīgu peli imunizē ar mielīna olbaltumvielas fragmentu kopā ar spēcīgu adjuvantu. Tad imūnsistēma uzbrūk paša dzīvnieka centrālajai nervu sistēmai. Pelei attīstās augšupejošs vājums, ko ir viegli novērtēt skalā no 0 līdz 5 — no ļenganas astes līdz pakaļējo ekstremitāšu paralīzei.

Šī ērtā vērtēšana izskaidro gan EAE popularitāti, gan to, kāpēc tas var maldināt. Cilvēkiem MS attīstās spontāni, skar plašāku un mazāk precīzi definētu mērķu loku un izraisa redzes, jušanas, kognitīvus, smadzenīšu un motorus simptomus ar recidivējošu vai progresējošu gaitu. EAE kontrolētos apstākļos atveido atsevišķus mehānismus, piemēram, iekaisumu, demielinizāciju un aksonu bojājumu. Tas nav MS atveidojums miniatūrā. Lasītāji, kuri vēlas izprast kopējo kontekstu, pirms kāda konkrēta apgalvojuma par slimību izvērtēšanas var iepazīties ar priekšstatiem par metilēnzilā darbību šūnu līmenī.

Arī abos tālāk aplūkotajos pētījumos tika izmantoti atšķirīgi EAE antigēni, un tam ir nozīme. Ārstēšanas pētījumā slimību izraisīja ar MOG35-55 — īsu mielīna oligodendrocītu glikoproteīna peptīdu. Patoloģijas pētījumā slimību izraisīja ar MP4 — mielīna bāziskā proteīna un proteolipīdu proteīna segmentu sapludinājumu. Peļu līnijas un antigēna izvēle ietekmē bojājumu lokalizāciju un iekaisuma norisi, tāpēc šie pētījumi nav viena eksperimenta divi atkārtojumi.

Pārskats: no modeļa līdz jautājumam un ierobežojumiem

Turiet šo tabulu pie rokas. Tā ir šī raksta galvenais uzziņu materiāls. Katrā rindā norādīts, uz kādu klīnisku jautājumu modelis var atbildēt, kas faktiski tika mērīts un kur beidzas iespējas rezultātus attiecināt uz cilvēkiem.

Izvērtējot nākamo virsrakstu, ikviens var izmantot tās pašas ailes, ņemot talkā ieteikumus pirmsklīnisko pētījumu lasīšanai: noskaidrojiet sugu un antigēnu, savienojuma lomu, vērtētos iznākumus un to, vai rezultāts raksturo slimības gaitu vai audu stāvokli vienā brīdī.

Ārstēšanas rezultāts: ko mainīja līdzekļa ievadīšana

2016. gada ārstēšanas pētījumā žurnālā Journal of Neuroimmunology izmantoja apmēram 8 līdz 10 nedēļas vecas C57BL/6 līnijas peļu mātītes, katru imunizējot ar 250 mikrogramiem MOG35-55. Pēc EAE izraisīšanas dzīvniekus nejaušināti iedalīja metilēnzilā grupā vai neārstētā EAE grupā, un klīniskā novērtējuma punktu skaitu novēroja aptuveni līdz 30. dienai.

No 15. līdz 30. dienai ārstētajām pelēm klīniskā novērtējuma punktu skaits bija statistiski nozīmīgi zemāks nekā EAE kontroles grupā, P esot mazākam par 0.01. Muguras smadzeņu analīze liecināja par to pašu: ārstētajiem dzīvniekiem bija mazāka iekaisuma šūnu infiltrācija, mazāka demielinizācija un mazāks aksonu zudums.

Pētījuma īpašā iezīme bija signālpārneses rādītāju kopums. Ārstēšana palielināja AMPK aktivāciju un SIRT1 ekspresiju, kā arī nomāca NF-kB aktivāciju — vienu no centrālajiem iekaisuma regulācijas mehānismiem. Adaptīvās imunitātes līmenī tā mazināja Th17 atbildi un pastiprināja Treg atbildi. Tādējādi piedāvātā notikumu ķēde ir šāda: metilēnzilais ietekmē AMPK un SIRT1, tie mazina NF-kB signālpārnesi, kas novirza līdzsvaru no iekaisumu veicinošām Th17 uz regulējošām Treg šūnām, tālāk mazinot audu bojājumu un klīniskā novērtējuma punktu skaitu.

Šī ķēde ir interpretācija, nevis pierādīta cēloņsakarību secība. Pētījums rāda, ka līdzekļa lietošana, signālpārneses izmaiņas un slimības izpausmju mazināšanās notika vienlaikus. Tas nepierāda, ka AMPK un SIRT1 pilnībā nodrošina novēroto labvēlīgo ietekmi, un publiski indeksētajā tekstā precīza deva miligramos uz kilogramu, ievadīšanas veids, sākuma diena un ilgums nav norādīti pietiekami skaidri, lai shēmu varētu atkārtot tikai pēc kopsavilkuma. Jebkuru pārdošanas lapā saistībā ar šo pētījumu norādītu devu uzskatiet par nepārbaudītu, ja vien nav atsauces uz pilnā teksta metožu sadaļu. Plašākā metilēnzilā pētījumu pierādījumu bāzē par cilvēkiem jāpārbauda, vai šis agrīnais imūnās atbildes signāls jebkad ir ticis apstiprināts klīniskos datos.

Patoloģijas rezultāts: ko atklāja audi sešu mēnešu laikā

2015. gada MP4 pētījumā žurnālā PLoS ONE izmantoja C57BL/6 līnijas peļu mātītes, kuras imunizēja ar 200 mikrogramiem MP4 pilnajā Freinda adjuvantā; imunizācijas dienā un vēlreiz pēc 48 stundām ievadīja arī garā klepus toksīnu. Neviens dzīvnieks nesaņēma metilēnzilo kā zāļu līdzekli. Pēc fiksācijas un ieslēgšanas vienu mikrometru biezus muguras smadzeņu šķērsgriezumus iekrāsoja ar metilēnzilo gaismas mikroskopijai, savukārt sīkāku detaļu izpētei izmantoja ventrolaterālā trakta elektronu mikroskopiju.

Audu paraugus ieguva trīs posmos: akūtās fāzes maksimumā no 7 pelēm, trīs mēnešus pēc slimības sākuma no 5 pelēm un sešus mēnešus pēc slimības sākuma no 10 pelēm. Vidējais klīniskā novērtējuma punktu skaits šajos posmos bija gandrīz vienāds — aptuveni 1.7 līdz 1.8 skalā no 0 līdz 5. Audi atklāja citu ainu. Šķiedru ar izolētu mielīna bojājumu blīvums pieauga no aptuveni 569,000 šķiedrām uz kvadrātmilimetru akūtās fāzes maksimumā līdz aptuveni 1,496,000 pēc sešiem mēnešiem; atšķirība starp akūto un ilgtermiņa posmu bija statistiski nozīmīga, P esot vienādam ar 0.027. Kombinēts mielīna un aksonu bojājums līdz sešu mēnešu posmam aptuveni divkāršojās. Remielinizējošo šķiedru īpatsvars visos posmos palika zem viena procenta — detaļa, kas liek piesardzīgi vērtēt cerības uz atjaunošanos.

Aksonu bojājuma dinamika veidoja U veida līkni: tas bija izteikts akūtās fāzes maksimumā, mazāks pēc trim mēnešiem un visizteiktākais pēc sešiem mēnešiem. Tas korelēja ar mitohondriju uzbriešanu un mazāku atstatumu starp neirofilamentiem. Vērtētājiem nebija zināms klīniskā novērtējuma punktu skaits un slimības posms, kas nostiprina secinājumu, ka klīniskais novērtējums nepietiekami atspoguļoja notiekošo strukturālo bojājumu.

Šī neatbilstība ir pētījuma patiesais pienesums lasītājam, kurš interesējas par MS. Stabils invaliditātes novērtējums nenozīmēja stabilu audu stāvokli. Tā arī parāda, kāpēc ar šo publikāciju nevar pamatot nevienu apgalvojumu par MS ārstēšanu ar metilēnzilo. Tajā pārbaudīja laika ietekmi, nevis ārstēšanu.

Kāpēc neviens no pētījumiem nepierāda ieguvumu pacientiem

Uztveriet katru publikāciju kā labu atbildi uz šauru jautājumu, kas uz jautājumu par pacientiem neatbild nemaz.

Pirmkārt, atšķiras slimības izraisīšana. EAE mērķtiecīgi izraisa ar noteiktu antigēnu un adjuvantu. Cilvēkiem MS attīstās spontāni, iesaistot plašāku imūnsistēmas komponentu loku, tostarp T šūnas, B šūnas, iedzimto imunitāti un audos esošās glijas šūnas. Savienojums, kas pelē maina galvenokārt pret MOG vērstu atbildi, ne vienmēr mainīs šo plašāko atbildi cilvēkam.

Otrkārt, atšķiras fenotips. Pelei augšupejošs vājums no astes līdz pakaļējām ekstremitātēm ir ērti novērtējams rādītājs. Tas cilvēku MS daudzveidību reducē līdz vienam motorās funkcijas skaitlim. Zāles bieži maina īstermiņa EAE vērtējumu, nemainot slimības gaitu cilvēkiem, tāpēc EAE ir sākotnējās pārbaudes un mehānismu izpētes instruments, nevis klīnikas miniatūra.

Treškārt, nav atrisināti jautājumi par ekspozīciju un lietošanas laiku. Nepārtraukta līdzekļa ievadīšana agrīnā stadijā 30 dienu eksperimentā ar pelēm nav tas pats, kas ilgstoša perorāla lietošana cilvēkam ar jau attīstītu slimību, un nevienā no pētījumiem netika mērīta līdzekļa koncentrācija nervu sistēmā. Bez šīs saiknes nav pamata pāriet no koncentrācijas laboratorijas platē vai devas pelei uz lietošanas shēmu cilvēkam.

Ceturtkārt, abas publikācijas nav viena otras rezultātu atkārtojums. Atšķirīgi antigēni, atšķirīgi jautājumi, atšķirīgi vērtētie iznākumi un vienā gadījumā vispār nekāda ārstēšana. Citēt tās kopā kā divus pozitīvus MS ārstēšanas pētījumus ir kategoriju sajaukšana.

Ko tas nozīmē lasītājiem, kuri izvērtē pierādījumus

Šajās publikācijās nav noteikta metilēnzilā lietošanas protokola MS gadījumā. Ārstēšanas pētījums pamato turpmāku AMPK, SIRT1, NF-kB un Th17 un Treg līdzsvara izpēti MOG EAE modelī. Patoloģijas pētījums atgādina, ka audu bojājums var progresēt, kamēr novērtējuma punktu skaits šķiet nemainīgs, un ka metilēnzilais metožu sadaļā reizēm nozīmē krāsvielas trauku, nevis zāļu skapīti. Lasītājiem, kuri seko aktuālajiem multiplās sklerozes pētījumiem, jāpatur prātā šī atšķirība starp krāsvielu un zālēm. Pirms laboratorijas pētījumu virsraksti mudina kādu rīkoties, drošības jautājumi, tostarp ar asinīm un mijiedarbībām saistītie riski, jāapspriež ar ārstu, ņemot vērā arī vispārīgos datus par metilēnzilā drošību.

Galveno secinājumu var izteikt vienā teikumā. Vienā citētajā pētījumā metilēnzilo ievadīja pelēm ar MOG EAE un ziņoja par vieglāku slimības gaitu kopā ar imūnās atbildes maiņu pretiekaisuma virzienā, savukārt otrā citētajā pētījumā nekādu līdzekli neievadīja un metilēnzilo izmantoja tikai muguras smadzeņu iekrāsošanai, dokumentējot sešus mēnešus ilgu mielīna un aksonu bojājuma uzkrāšanos, tāpēc šie abi pētījumi nepierāda, ka metilēnzilais palīdz cilvēkiem ar MS.