Vai metilēnzilais var apiet mitohondriju III kompleksu? Kāpēc pētījumu rezultāti atšķiras

Divas laboratorijas pētīja, vai metilēnzilais var apiet bloķētu mitohondriju III kompleksu. Viena atbildēja noliedzoši. Otra — apstiprinoši. Abām bija dati.

Pirmajā pētījumā ar peļu smadzeņu mitohondrijām konstatēja, ka krāsviela to nespēj. Otrajā, kurā izmantoja trīs grauzēju sugu smadzeņu mitohondrijas, konstatēja, ka tā to daļēji spēj. Līdzās tiem bieži citē trešo pētījumu ar peļu aknām, taču tajā pārbaudīja ko citu. Ja to aplūko atbilstošajā kontekstā, puse neskaidrību izzūd.

Nav pamata pasludināt universālu mehānismu. Ir trīs eksperimenti ar atšķirīgiem blokatoriem, devām un mērījumiem. Vispirms izlasiet par apstākļiem. Secinājumi izriet no tiem.

Ko šeit nozīmē apiešana

Elektroni ķēdē nonāk caur I kompleksu (no NADH) vai II kompleksu (no sukcināta), caur III kompleksu pāriet uz citohromu c un pēc tam caur IV kompleksu — uz skābekli. Šūna izmanto šajā ceļā izveidoto gradientu ATP sintēzei.

Apgalvojums par apiešanu nozīmē, ka metilēnzilais pieņem elektronus pirms bloķētās vietas un nodod tos tālāk aiz tās. Oksidētā krāsviela pieņem elektronus no NADH vai ķēdes sākuma komponentiem, pārvēršoties par leikometilēnzilo, un reducētā forma tos nodod citohromam c vai atpakaļ ķēdē. Ja elektroni tiek nodoti aiz bloķētās vietas, elpošana un membrānas potenciāls daļēji atjaunojas. Ja tie tiek nodoti pašā bloķētajā vietā vai pirms tās, nekas neatjaunojas.

Lielu daļu šīs pretrunas nosaka viena III kompleksa īpatnība. Kompleksā darbojas Q cikls ar divām inhibitoru saistīšanās vietām. Antimicīns saistās Qi vietā. Miksotiazols saistās Qo vietā. Pētījumā, kurā izmanto tikai vienu no tiem, ir pārbaudīta tikai puse kompleksa.

Pirmais pētījums: peļu smadzeņu mitohondrijās apiešanas nav

Gureev un kolēģi izmantoja C57BL/6 peļu smadzeņu garozas mitohondrijas, kas izolētas ar digitonīnu; mērījumos olbaltumvielu koncentrācija bija 0.1 mg uz ml. Substrātus izmantoja trīs režīmos: piruvāts kopā ar malātu, katrs 5 mM koncentrācijā, sukcināts 10 mM koncentrācijā kopā ar glutamātu 2 mM koncentrācijā un L-prolīns 10 mM koncentrācijā. Blokatori bija rotenons 1 mikromolārā koncentrācijā (I kompleksam) un antimicīns 1 mikrograma uz ml koncentrācijā (III kompleksam). Krāsvielas devas bija 0.5, 1 un 2 mikromolāras, un galvenā koncentrācija bija 1 mikromolāra. Metodes un mērījumu līknes ir atrodamas publikācijā žurnālā FEBS Letters.

I kompleksa apiešana darbojās. Rotenons samazināja ADP stimulētu elpošanu no aptuveni 121 līdz aptuveni 2 nmol minūtē uz mg, un krāsviela 1 mikromolārā koncentrācijā to atjaunoja līdz aptuveni 21. Membrānas potenciāls atjaunojās, izmantojot piruvātu kopā ar malātu un L-prolīnu.

III kompleksa apiešana nedarbojās. Antimicīns samazināja elpošanu līdz aptuveni 16, bet krāsviela to palielināja tikai līdz aptuveni 20. Membrānas potenciāls neatjaunojās ne ar vienu substrātu, pat pie krāsvielas devām līdz 5 mikromolāriem. Peroksīda dati norādīja uz to pašu: krāsviela viena pati palielināja peroksīda izdalīšanos no sākotnējā līmeņa ap 76 pmol minūtē uz mg līdz aptuveni 1170, 1460 un 1945 pie trim devām, taču antimicīns samazināja šo krāsvielas izraisīto signālu attiecīgi par aptuveni 25, 88 un 96 procentiem. Ja reducētā krāsviela reaģētu tieši ar skābekli, III kompleksa bloķēšanai nevajadzētu nomākt signālu. Autori secināja, ka reducētā krāsviela tiek oksidēta III kompleksa Qo vietā, pirms antimicīna bloķētās vietas. Īsais cikls vārdos: no donoriem uz krāsvielu, no krāsvielas uz Qo, tālāk pa parasto ceļu. Rotenona bloķētā vieta tiek apieta. Antimicīna bloķētā vieta — ne.

Otrais pētījums: daļēja apiešana trīs sugās, abās inhibitoru saistīšanās vietās

Svab un kolēģi paplašināja eksperimenta plānu. Viņi izmantoja peļu, žurku un jūrascūciņu smadzeņu mitohondrijas, kas izolētas ar Percoll; mērījumos bija tā pati 0.1 mg uz ml koncentrācija, un substrāti bija piruvāts kopā ar malātu vai glutamāts kopā ar malātu, katrs 5 mM koncentrācijā. Viņi izmantoja divus III kompleksa blokatorus: antimicīnu A 0.3 mikromolārā koncentrācijā un miksotiazolu 1 mikromolārā koncentrācijā. Vairumā analīžu krāsvielas koncentrācija bija 2 mikromolāra, bet darbā ar citohromu c — 0.5. Visas trīs sugas, kas pētītas ar saskaņotiem protokoliem, ir aprakstītas brīvpieejas publikācijā.

Abas bloķētās vietas tika daļēji apietas visās trīs sugās. Peļu mitohondrijās antimicīns nomāca elpošanu, un krāsviela to palielināja par aptuveni 60 procentiem — no aptuveni 37 līdz 59 nmol minūtē uz mg. Miksotiazols to nomāca par 88 procentiem līdz aptuveni 4.5, un krāsviela to palielināja pieckārtīgi līdz aptuveni 23. Abu inhibitoru klātbūtnē membrānas potenciāls daļēji atjaunojās; to mērīja ar divām krāsvielām (safranīnu O un ratiometrisko TMRM), lai izslēgtu optiskos artefaktus.

Šajā publikācijā elektronu nodošanu pārbaudīja arī tieši, ko pirmajā pētījumā nedarīja. Mitohondrijas ar uzturētu enerģētisko stāvokli nereducēja ārēji pievienotu acetilētu citohromu c 25 mikromolārā koncentrācijā ne inhibitoru klātbūtnē, ne bez tiem, taču krāsvielas pievienošana izraisīja reducēšanu abos gadījumos. Buferšķīdumā bez šūnām NADH kopā ar krāsvielu reducēja citohromu c ar ātrumu, kas bija proporcionāls NADH koncentrācijai. Garākais lēciens vārdos: reducējošie ekvivalenti uz krāsvielu, krāsviela tieši uz citohromu c, IV komplekss uz skābekli. Šis ceļš pilnībā izlaiž III kompleksu, tāpēc var apiet abu blokatoru darbību.

Šo skaidrojumu atbalsta divi papildu mērījumi. Pievienojot krāsvielu ar miksotiazolu apstrādātām mitohondrijām, NAD(P)H fluorescence samazinājās, norādot, ka reducējošie ekvivalenti aizplūda pa jauno ceļu. Turklāt krāsvielas absorbcija pie 660 nm atspoguļoja katru secīgo pievienošanu, savukārt pēc centrifugēšanas iegūtie supernatanti parādīja, ka oksidētā krāsviela mitohondrijās ar uzturētu enerģētisko stāvokli uzkrājās vairāk nekā simtkārtīgā koncentrācijā un pēc potenciāla sabrukuma tās atstāja. Atbilst arī protonu bilance: izlaižot protonu sūknēšanas posmus, uz elektronu pāri paliek aptuveni 2 protoni, nevis 10, tāpēc ātrāks skābekļa patēriņš ar tikai daļēju repolarizāciju ir tieši tas, kā izpaužas īsta apiešana, nevis pierādījums pret to.

Tas pats preparāts radīja reakcijas, kuras paviršs lasījums var likt pārprast. Inhibitora un krāsvielas klātbūtnē ADP samazināja elpošanu, nevis to palielināja, un transporta bloķēšana to stimulēja, nevis palēnināja, lai gan membrānas potenciāls joprojām mainījās parastajos virzienos. Skābekļa patēriņš viens pats šajā sistēmā maldina.

Trešais pētījums: aknu pētījums, kurā pārbaudīja I un II kompleksu, nevis III

Lee un Boelsterli izmantoja peļu aknu mitohondrijas un kultivētus hepatocītus, ko bija bojājis efavirenzs (I komplekss, IC50 ap 30 mikromolāriem) un hidrazīns, izoniazīda metabolīts (II komplekss, IC50 ap 30 mikromolāriem). Krāsviela aptuveni 30 mikromolārā koncentrācijā atjaunoja NADH oksidēšanu, membrānas potenciālu un ATP, vienlaikus samazinot oksidētāju līmeni un nekrotisku šūnu nāvi. Publikācijā žurnālā Redox Biology tas modelēts kā krāsvielas veikta elektronu pārnese, apejot bojātos I un II kompleksus.

Šis rezultāts ir apstiprināts konteksts par agrākiem ķēdes posmiem, un tas neko nepasaka par III kompleksu, jo tajā nekas netika bloķēts. Tas nevar ne apstiprināt, ne atspēkot nevienu no smadzeņu pētījumiem.

Apstākļu matrica

Četri iemesli, kāpēc abi III kompleksa pētījumi var būt pareizi savos apstākļos

1. Bloķēšana nebija vienāda. Antimicīns viens pats 1 mikrograma uz ml koncentrācijā pret antimicīnu 0.3 mikromolārā koncentrācijā un atsevišķu Qo vietas blokatoru. Krāsvielas ceļš, kas piegādā elektronus Qo vietai, neizdodas tieši tur, kur izdodas ceļš tieši uz citohromu c. Viena vieta nevar pārstāvēt abas.

2. Atšķīrās krāsvielas deva un laiks. Galvenās koncentrācijas bija 1 un 2 mikromolāras vielai, kas iesaistās redoksciklos un kuras uzņemšana un tiešā citohroma c reducēšana ir atkarīga no koncentrācijas un laika. Nelielas devu atšķirības kopā ar atšķirīgu mērījumu laiku var atklāt dažādus viena tīkla posmus.

3. Atšķīrās preparāti. Izolēšana ar digitonīnu un izolēšana Percoll gradientā atlasa mitohondriju populācijas, kas pārklājas, bet nav identiskas. Olbaltumvielu koncentrācija sakrita — 0.1 mg uz ml, tāpēc šo mainīgo var izslēgt, taču apakšpopulāciju un struktūras neskartību nevar. Turklāt sugu atšķirības tika izslēgtas kā skaidrojums: otrā grupa savu novēroto reakciju atkārtoja arī pelēs.

4. Substrātu nodrošinātais stāvoklis nosaka, ko krāsviela spēj darīt. Trīs substrātu režīmi pret ar NADH saistītiem substrātu pāriem. NADH pieejamība un membrānas potenciāls kopā nosaka, cik ātri krāsviela tiek reducēta un kur tā sadalās, un ceļš, kuram vajadzīga reducēta krāsviela līdzās oksidētam citohromam c, ir atkarīgs no šīs izvēles.

Kā izvērtēt nākamo apgalvojumu par apiešanu

Jautājiet, kurš komplekss tika bloķēts, ar kuru inhibitoru, kurā vietā un kādā devā. Jautājiet par krāsvielas koncentrāciju un mērījuma veikšanas laiku. Jautājiet par audiem, sugu, izolēšanas metodi, olbaltumvielu koncentrāciju un substrātu. Un jautājiet, vai potenciāls, elpošana, redoksstāvoklis un tiešās elektronu nodošanas analīze dod saskanīgus rezultātus, jo skābekļa patēriņš viens pats šeit vairāk nekā vienu reizi norādīja nepareizā virzienā.

Šaurais kopsavilkums paliek spēkā. Par I kompleksa apiešanu ar krāsvielu ir vienprātība. Attiecībā uz III kompleksu peļu mitohondrijās ar antimicīnu 1 mikrograma uz ml koncentrācijā un krāsvielu 1 mikromolārā koncentrācijā funkcionāla apiešana nav novērojama, savukārt trīs sugās ar antimicīnu 0.3 mikromolārā koncentrācijā vai miksotiazolu 1 mikromolārā koncentrācijā un krāsvielu 2 mikromolārā koncentrācijā novēro daļēju apiešanu ar tiešu elektronu pārnesi no krāsvielas uz citohromu c. Abi šie apgalvojumi ir savietojami. Jebkurš plašāks secinājums ir ekstrapolācija.

Saistītā lasāmviela palīdz saglabāt strīdīgo apgalvojumu neapstrīdētās ķīmijas ietvaros: kā metilēnzilais pārvieto elektronus — par pārneses ķēdi, I kompleksa apiešanas eksperimenti — par apstiprināto gadījumu ķēdes sākumā, membrānas potenciāla mērījumi un to artefakti — par to, kāpēc bija vajadzīgas divas krāsvielas, un darbs laboratorijā ar redoksciklos iesaistītām vielām — par devu un laika izvēles slazdiem.