Metilēnzilais un feroptoze: dzelzs, lipīdu peroksidācija un šūnu nāve

Feroptoze ir šūnu nāve membrānu bojājumu dēļ. Membrānās esošie polinepiesātinātie tauki oksidējas ķēdes reakcijā, membrāna zaudē savu funkciju, un šūna iet bojā. Šai ķīmiskajai reakcijai ir nepieciešama dzelzs. Šajā teikumā ietverta visa jēdziena būtība, un viss šajā rakstā aplūkotais pārbauda kādu tās daļu.

Šeit jautājums ir šaurāks: ko metilēnzilais dara ar šo ķēdi eksperimentos ar šūnām un ko iegūtais rezultāts patiesībā parāda. Īsā atbilde ir tāda, ka divos laboratorijas pētījumos metilēnzilais nanomolārā koncentrācijā samazināja mitohondriju lipīdu peroksidāciju un saglabāja šūnas dzīvas pēc iedarbības, kas citādi izraisa feroptozi. Garākā atbilde ir svarīgāka, jo katrs ķēdes posms tika pārbaudīts ar atšķirīgu iejaukšanos, un katrai no tām ir ierobežojumi.

Feroptoze vienā rindkopā

Membrānas fosfolipīdam, kuram ir polinepiesātinātas taukskābes aste, ir vājā vieta: ūdeņraža atomi, kurus ir viegli atņemt. Kad radikālis atņem vienu no tiem, lipīdam pievienojas skābeklis, veidojas lipīdu peroksilradikālis, un šis radikālis atņem ūdeņradi nākamajam lipīdam. Reakcija izplatās pa membrānu, ja vien kaut kas to neaptur.

Galvenais apturēšanas mehānisms ir enzīms GPX4, kas izmanto glutationu, lai reducētu lipīdu peroksīdus līdz nekaitīgiem lipīdu spirtiem. Laboratorijā izmantotie ierosinātāji iedarbojas uz konkrētiem šīs aizsardzības posmiem. Erastīns bloķē cistīna uzņemšanu caur sistēmu xc-minus, tādējādi atņemot šūnai glutationa sintēzei nepieciešamo cisteīnu. Butionīna sulfoksimīns tieši bloķē glutationa sintēzi. RSL3 inhibē pašu GPX4. Visi trīs atstāj peroksīdus neizvadītus, taču dara to dažādos posmos, tāpēc rezultātu, kas iegūts ar vienu ierosinātāju, nevar automātiski vispārināt uz pārējiem.

Feroptoze atšķiras no apoptozes pēc pazīmēm, kas to definē. Tajā nav kaspāžu kaskādes un neveidojas apoptotiskie ķermenīši. Dzelzs helatori, piemēram, deferoksamīns, un radikāļus saistošas vielas, piemēram, ferrostatīns-1, to nomāc. Tā ir praktiskā pārbaude, ko pētnieki izmanto, lai šūnu nāvi klasificētu kā feroptotisku, nevis tikai nekrotisku. Plašāks regulētas šūnu nāves ceļu pārskats palīdz izprast šo atšķirību, savukārt tas, kā šūnas regulē labilo dzelzi, izskaidro, kāpēc helātu veidošanās ir tik izšķiroša kontrolpārbaude.

Kāda ir mitohondriju loma un kāpēc par to bija strīdi

Agrīnos darbos tika ziņots, ka arī šūnās bez mitohondriju DNS notiek feroptoze, kas liecināja, ka mitohondriji nav obligāti nepieciešami. Vēlāki darbi atklāja, ka mitohondriju daudzuma samazināšana vai šūnu elpošanas bloķēšana var nomākt feroptozi, ko izraisa cisteīna trūkums, bet ne feroptozi, ko izraisa tieša GPX4 inhibēšana. Abi rezultāti var būt patiesi, ja mitohondriju ieguldījums ir atkarīgs no ierosinātāja, šūnu tipa un vietas, kur notiek izšķirošā peroksidācija.

Pētījumā, kas ir šī raksta pamatā, strīdīgais jautājums tika aplūkots, izmantojot konkrētam šūnas nodalījumam specifisku zondi. MitoCLox ir lipīdu peroksidācijas indikatora variants, kas mērķēts uz mitohondrijiem: tā fluorescence mainās, saskaroties ar lipīdu peroksilradikāļiem mitohondriju iekšienē. Ar erastīnu apstrādātos fibroblastos mitohondriju zondes oksidācija parādījās vēl dzīvās šūnās pirms to nāves, un šūnu populācijā tā nebija vienmērīga. Šai notikumu secībai ir nozīme. Peroksidācija, kas notiek pirms šūnu nāves, ir iespējams tās cēlonis. Peroksidācija, kas izmērīta tikai mirušās šūnās, atspoguļo noārdīšanās atliekas. Papildu ceļvedī par lipīdu peroksidācijas analīzēm un to, ko parāda katra zonde izskaidrots, kāpēc zondes atrašanās vieta nosaka signāla nozīmi.

Tāda pati aina parādījās otrā modelī. Fibroblasti no pacienta ar Lēbera iedzimto optisko neiropātiju, kuriem ir I kompleksa mutācija un augstāks sākotnējais oksidatīvā stresa līmenis, gāja bojā feroptozes ceļā, kad tika izsmelts glutations, savukārt kontroles fibroblasti bija izturīgi. Mitohondriju zondes oksidācija atkal notika vispirms. Sīkāka informācija pieejama fibroblastu pētījumā par mitohondriju lipīdu peroksidāciju feroptozes laikā.

Ko metilēnzilais mainīja šajos eksperimentos

Metilēnzilais ir oksidēšanās–reducēšanās procesu pārnesējs. Tā oksidētā forma pieņem elektronus no ar NADH saistītām reakcijām pie I kompleksa, bet reducētā forma nodod tos citohromam c, kas piegādā elektronus IV kompleksam. Tas rada daļēju apvedceļu ap ķēdes posmu, kur elektroni parasti noplūst uz skābekli, veidojot superoksīdu. Lasītājiem, kuri vēlas pilnīgu priekšstatu par šo pārneses procesu, jāsāk ar skaidrojumu par to, kā metilēnzilais pārvieto elektronus caur mitohondrijiem.

Ar erastīnu apstrādātos plaušu fibroblastos metilēnzilais 250 nanomolārā koncentrācijā saglabāja dzīvotspēju šūnu izdzīvošanas testā, līdzīgi kā uz mitohondrijiem mērķētie antioksidanti SkQ1 un MitoTEMPO. Kontroles nosaka apgalvojuma robežas. Aizsargājoša iedarbība bija arī ferrostatīnam-1, alfa-tokoferolam un deferoksamīnam, kas apstiprina, ka šūnu nāve bija feroptotiska. SkQ1 analogs bez antioksidanta grupas neaizsargāja, kas norāda uz oksidēšanās–reducēšanās reakcijām, nevis nespecifisku uzkrāšanos. SkQ1 koncentrācijai pārsniedzot aptuveni 200 nanomolārus, aizsargājošā iedarbība mazinājās, kas atbilst zināmajai hinonu antioksidantu prooksidatīvajai darbībai pie lielākas slodzes. Arī metilēnzilajam ir šāda divējāda, no devas atkarīga iedarbība: šajos šūnu kultūras traukos tas aizsargā zemās nanomolārās koncentrācijās, bet, palielinot koncentrāciju vai spēcīgi apgaismojot, oksidēšanās–reducēšanās ciklu gaitā tas var radīt ūdeņraža peroksīdu. Šāda devas konteksta nozīme aplūkota rakstā par reaktīvajām skābekļa formām mitohondrijos.

Pēc tam eksperimenti ar izolētiem mitohondrijiem ļāva nošķirt ROS avotus. Divvērtīgās dzelzs klātbūtnē substrāti, kas piegādā elektronus I kompleksam, kopā ar rotenonu stimulēja zondes oksidāciju. Rotenons bloķē elektronu plūsmu aiz flavīna vietas, tāpēc iepriekšējie pārnesēji paliek reducēti, un no flavīna, kas vērsts pret mitohondrija matricu, elektroni noplūst uz skābekli. Substrāti, kas piegādā elektronus III kompleksam, kopā ar antimicīnu A radīja daudz ūdeņraža peroksīda, tomēr neizraisīja lipīdu peroksidāciju. Tas pats kopējais ROS signāls, cita atrašanās vieta, cits iznākums. Gan SkQ1, gan metilēnzilais nomāca I kompleksa izraisīto peroksidāciju, nenomācot pašu ūdeņraža peroksīda veidošanos. Tas norāda, ka to iedarbība notiek pēc ROS veidošanās, lipīdu peroksidācijas posmā.

Dzelzs pārslodzes pētījums un lipofuscīna norāde

Otrā pētījumā jautājums tika aplūkots no dzelzs puses. H9c2 kardiomiocītos, kas tika pakļauti dzelzs(III) amonija citrāta iedarbībai koncentrācijā zem viena milimola litrā, radās mitohondriju ROS, mitohondriju lipīdu peroksidācija, pēc tam feroptoze, kam sekoja lipofuscīnam līdzīga pigmenta uzkrāšanās 24 stundu laikā. Lipofuscīns ir autofluorescējošs, dzelzi saturošs oksidētu lipīdu un olbaltumvielu atlikums, kas uzkrājas līdz ar vecumu, un tā straujā parādīšanās šeit saista akūtu dzelzs izraisītu peroksidāciju ar klasisku novecošanas marķieri. Gan metilēnzilais nanomolārā koncentrācijā, gan SkQ1 novērsa peroksidāciju, šūnu nāvi un pigmenta uzkrāšanos. Izolēti sirds mitohondriji apstiprināja šo ainu: rotenons kopā ar divvērtīgo dzelzi izraisīja peroksidāciju un pigmentam līdzīgu signālu, un abas vielas to bloķēja. Visa notikumu secība aprakstīta pētījumā par dzelzs pārslodzi H9c2 kardiomiocītos. Pigmenta aspekts ir saistīts ar tēmu par lipofuscīnu un šūnu novecošanas marķieriem.

Ko šūnu izdzīvošanas testi neparāda

Dzīvotspējas tests, piemēram, CellTiterBlue, parāda, cik šūnu kultūras traukā saglabā vielmaiņas aktivitāti pēc ierosinātāja un potenciāli aizsargājošas vielas iedarbības. Tā ir mehānisma pārbaude noteiktā sistēmā. Tas nav ārstēšanas rezultāts. Nevienā no šiem eksperimentiem viela netika ievadīta pacientam, netika mērīts ar slimību saistīts galarezultāts un netika noteikts terapeitiskais diapazons organismā.

Četri ierobežojumi jānosauc skaidri. Pirmkārt, šūnu tipu klāsts ir šaurs: transformēti plaušu fibroblasti, primārie ādas fibroblasti, tostarp viena mitohondriālas slimības šūnu līnija, un žurku kardiomiocītu līnija, kā arī izolēti žurku sirds mitohondriji. Jutība atšķīrās starp līnijām, un LHON līnija tika izvēlēta tās neparasti augstās ievainojamības dēļ. Otrkārt, ierosinātāji rada laboratorijai raksturīgus galējus apstākļus: pilnīgu transporta vai sintēzes blokādi un dzelzs slodzi, ar kādu audi akūti nesaskartos. Treškārt, koncentrāciju nevar pārvērst devā ar vienkāršu reizināšanu. Nanomolāra koncentrācija kultūras vidē nav cilvēkam ievadāma deva, un starp šūnu kultūras trauku un cilvēku atrodas metilēnzilā sadalījums organismā, tā reducēšanās līdz bezkrāsainajai formai asinīs un audos, gaismas iedarbība un membrānas potenciāls. Ceturtkārt, zondes sniedz informāciju par savu nodalījumu. MitoCLox oksidācija parāda, ka mitohondrijos ir izveidojušies lipīdu radikāļi; tā neparāda, vai plazmatiskās membrānas plīsums, kas, visticamāk, ir noslēdzošais notikums, tika novērsts tieši vai arī no tā izdevās izvairīties, iedarbojoties uz agrāku posmu.

Tāpēc godīgs apgalvojums ir šāds: šajos modeļos I kompleksa radītās ROS kopā ar dzelzi izraisa mitohondriju lipīdu peroksidāciju, kas notiek pirms feroptozes, un metilēnzilais zemā koncentrācijā pārtrauc šo posmu. Jebkam, kas pārsniedz šo posmu, ir vajadzīgi citi eksperimenti ar dzīvniekiem un pēc tam ar cilvēkiem.