Metilēnzilā alternatīvas mikroskopijai: izvēle pēc uzdevuma

Vienkāršā baktēriju uztriepē kristālviolets var aizstāt metilēnzilo, ja mērķis ir saskatīt šūnu formu. Dzīvām šūnām labāka alternatīva var būt fāžu kontrasts bez jebkādas krāsošanas. Izvēle ir atkarīga no tā, kāds novērojums jums jāveic.

Pieņemsim, ka divi cilvēki pēta vienu un to pašu baktēriju kultūru. Viens vēlas atšķirt nūjiņveida šūnas no apaļām šūnām. Otrs vēlas noskaidrot, vai apstrāde ir nogalinājusi baktērijas. Krāsviela, kas pirmajam cilvēkam nodrošina skaidru attēlu, otrajam var nesniegt izmantojamu atbildi.

Pirms aizstājēja izvēles pabeidziet šo teikumu: “Man jānovēro ___ objektā ___, un šūnām ir / nav jāpaliek dzīvām.” Šis teikums nosaka uzdevumu, kas krāsvielai jāveic.

Sāciet ar paraugu un jautājumu

Vispirms izlemiet, vai šūnām jāpaliek dzīvām, pēc tam nosakiet pazīmi, kas jānovēro:

• Šūnām jāpaliek dzīvām: kustības vai formas novērošanai apsveriet nekrāsotu fāžu kontrastu vai DIC; kodola DNS novērošanai apsveriet Hoechst 33342 ar fluorescenci; membrānas integritātes novērtēšanai izvēlieties validētu testu, piemēram, SYTO 9 ar propīdija jodīdu.
• Šūnām nav jāpaliek dzīvām: baktēriju morfoloģijas novērošanai apsveriet vienkāršu krāsošanu ar kristālvioletu vai negatīvo krāsošanu ar nigrozīnu; Grama reakcijas noteikšanai izmantojiet pilnu Grama krāsošanas metodi; kodola DNS novērošanai fiksētās šūnās apsveriet DAPI fluorescenci. Izmantojiet šo tabulu, lai salīdzinātu katras pieejas ierobežojumus. Tās ir metožu izvēles, nevis norādījumi viena jau esoša protokola reaģentu pudeļu savstarpējai aizstāšanai.

Vienkāršai uztriepei metodi aizstājiet piesardzīgi

Kristālviolets ir praktisks kandidāts, ja uzdevums ir iegūt vienkrāsainu baktēriju morfoloģijas attēlu. FDA Bakterioloģiskās analītikas rokasgrāmatā ir norādītas divas kristālvioleta formulas, kas piemērotas vienkāršai krāsošanai. Izmantojiet dokumentētu formulējumu un tam paredzēto sagatavošanas metodi; tikai krāsvielas nosaukums nenosaka darba reaģenta sastāvu.

Kristālviolets tiek izmantots arī Grama krāsošanā, taču tas nenozīmē, ka vienkārša krāsošana ar kristālvioletu ir Grama krāsošana. ASM Grama krāsošanas protokolā diferenciālais rezultāts ir atkarīgs no kristālvioleta, joda, atkrāsošanas un kontrastkrāsošanas secīgas darbības. Izlaižot šos posmus, mainās tas, ko iespējams secināt no attēla. Šo atšķirību skatiet rakstā vienkārša krāsošana salīdzinājumā ar Grama krāsošanu.

Nigrozīns piedāvā citu veidu, kā izcelt kontūras: tas iekrāso fonu tumšu, kamēr baktēriju šūnas paliek salīdzinoši gaišas. Merck nigrozīna instrukcijā ir būtiska detaļa, ko vispārīgs aizstājēju saraksts var nepieminēt. Norādītais darba formulējums satur formaldehīdu. Tāpēc no vārdiem “negatīvā krāsošana” vien nevar secināt saderību ar dzīvām šūnām, lai gan pašas šūnas izskatās neiekrāsotas. Pārbaudiet pilnu formulējumu un parauga sagatavošanu.

Dzīviem paraugiem apsveriet optikas maiņu

Ja vēlaties novērot, kā šūnas kustas vai dalās, citas krāsvielas pievienošana var sarežģīt novērojumu. Kā Nikon skaidro savā ceļvedī par kontrastu caurspīdīgos paraugos, fāžu kontrasts un diferenciālais interferenču kontrasts jeb DIC padara paraugus redzamus, izmantojot to optisko īpašību atšķirības. Tie var atklāt dzīvas, neiekrāsotas šūnas, ja mikroskopam ir nepieciešamie komponenti.

Šāda izvēle saglabā preparātu neiekrāsotu, taču maina pieejamās informācijas veidu. Varat izsekot robežai vai kustībai, nezinot, kura molekula radījusi kontrastu. Ja jautājums ir par molekulas lokalizāciju, izvēlieties atbilstošu marķēšanas metodi.

Attiecībā uz kodola DNS Invitrogen DAPI un Hoechst krāsvielu salīdzinājumā nošķir DAPI ierasto lietojumu fiksētās šūnās no šūnu membrānu labāk šķērsojošā Hoechst 33342, kam dod priekšroku dzīvu šūnu marķēšanai. Abiem nepieciešams fluorescences aprīkojums. Neviens no tiem nav tiešs krāsainas gaišā lauka krāsvielas aizstājējs.

Uzskatiet krāsvielas iedarbību un apgaismojumu par eksperimenta apstākļiem. Ja mērījums ir šūnu uzvedība, salīdziniet iekrāsotus un neiekrāsotus preparātus.

Sarkana šūna automātiski nenozīmē mirušu šūnu

SYTO 9 un propīdija jodīdu bieži izmanto kopā, lai novērtētu baktēriju membrānas integritāti. BacLight rokasgrāmatā neskartas membrānas ir saistītas ar zaļu krāsojumu, bet bojātas membrānas — ar sarkanu krāsojumu. Šī interpretācija konkrētajam paraugam ir jāvalidē.

2019. gada Rosenberg un kolēģu pētījums ilustrē šo problēmu. 24-hour E. coli bioplēvēs uz stikla fosfātu buferšķīdumā aptuveni 96% šūnu in situ izskatījās pozitīvas pret propīdija jodīdu. Tomēr autori lēsa, ka pēc parauga ievākšanas 82% bija kultivējamas. Konfokālie attēli parādīja šūnas ar zaļu iekšieni zem sarkani iekrāsota materiāla, norādot uz ārpusšūnu nukleīnskābēm kā maldinošā signāla avotu.

Šie procenti raksturo atšķirīgus mērījumus pētījuma preparātos, nevis universālu korekcijas koeficientu. Praktiskais secinājums ir pārbaudīt, kas radījis signālu. Bioplēvē nukleīnskābju krāsviela var noteikt materiālu ārpus šūnām, kā arī bojātu šūnu iekšienē. Lai izdarītu secinājumu par dzīvotspēju, pētnieki iesaka izmantot papildu mērījumus, piemēram, kultivēšanu vai metabolisko aktivitāti, vienlaikus atzīstot, ka katrai metodei ir ierobežojumi.

Pārbaudiet, ko alternatīva patiesībā satur

Alternatīva krāsošanas metode joprojām var saturēt metilēnzilo. Giemsa ir viens piemērs: Merck savu produktu raksturo kā azūra–eozīna–metilēnzilā šķīdumu, kas paredzēts arī asins un kaulu smadzeņu uztriepēm. Tā var būt cita metode citam paraugam, taču tā neatbilst prasībai izslēgt metilēnzilo.

Ja savienojuma izslēgšana ir daļa no eksperimenta, pirms attēlu salīdzināšanas pārbaudiet reaģenta identitāti un formulējumu. Ceļvedī par metilzilo, metilēnzilo un līdzīgi nosauktām krāsvielām ir izskaidrotas nosaukumu atšķirības.

Pārbaudiet aizstāšanu, pirms izmantojat rezultātu

Jaunai metodei veiciet nelielu salīdzinājumu, izmantojot reprezentatīvus paraugus un atbilstošu kontroli. Ja iespējams, saglabājiet salīdzināmus mikroskopa iestatījumus. Reģistrējiet reaģenta formulējumu, parauga sagatavošanu, iedarbību un attēlveidošanas apstākļus, lai labāk izskatīgu attēlu varētu izpētīt, nevis vienkārši izvēlēties pēc vizuālā iespaida.

Rezultātu vērtējiet atbilstoši sākotnējam jautājumam. Morfoloģijai novērtējiet, vai šūnu robežas un izvietojums joprojām ir interpretējami. Kodola marķēšanai novērtējiet signāla atrašanās vietu un fonu. Dzīvotspējai pieprasiet pierādījumus, kas pārsniedz vizuāli pievilcīgu krāsu nošķīrumu. Plašākajā ceļvedī par metilēnzilā krāsošanu un laboratorijas lietojumiem ir izskaidrots, kā savstarpēji saistās novērojums un preparāta sagatavošana.

Izvēlieties alternatīvu, kas saglabā jums nepieciešamo mērījumu. Krāsa ir tikai viena no iegūtā attēla īpašībām.