Kāpēc metilēnzilā absorbcija mainās atkarībā no koncentrācijas

Paņemiet vienu pudeli ar metilēnzilā izejšķīdumu un ielejiet šķīdumu divās glāzēs. Pirmo piepildiet ar izejšķīdumu, bet otro — ar desmitkārtīgu atšķaidījumu. Otrā glāzē šķīdums ir bālāks, kā jau gaidāms. Ieskatoties rūpīgāk, pamanīsiet vēl vienu izmaiņu. Ir mainījusies nokrāsa. Viens šķīdums ir tuvāks dzidram debeszilam tonim, bet otrs — zilam ar violetu nokrāsu. Atšķaidīšana ne tikai samazināja intensitāti. Tā mainīja to, kura ķīmiskā forma nodrošina lielāko daļu absorbcijas.

Šīs pārmaiņas pamatā ir vienkārša ideja. Izšķīdis metilēnzilais nepastāv tikai vienā formā. Atsevišķs krāsvielas katjons, ko sauc par monomēru, var sakārtoties ar plakano virsmu pret otru katjonu un izveidot dimēru, savukārt dimēri var veidot lielākus agregātus. Katrai formai ir savs absorbcijas spektrs. Spektrofotometra uzrādītais rezultāts ir visu to formu devumu summa, kuras konkrētajos apstākļos atrodas kivetē. Mainoties maisījuma sastāvam, mainās arī spektrs, pat ja kopējais krāsvielas saturs samazinās tieši proporcionāli atšķaidījumam.

Monomērs un dimērs absorbē atšķirīgi

Iztēlojieties monomēru kā plakanu kārti, kuras pozitīvais lādiņš ir izkliedēts pa gredzenu sistēmu. Divas šādas kārtis var novietoties ar plakanajām virsmām viena pret otru. Pozitīvie lādiņi atgrūžas, taču plakanās aromātiskās virsmas savstarpēji pievelkas slāņošanās mijiedarbības dēļ, un apkārtējais ūdens un pretjoni ekranē atgrūšanos. Rezultātā veidojas saistīts pāris ar kopīgiem elektroniskajiem stāvokļiem. Tā atļautajām pārejām ir augstāka enerģija nekā monomēra pārejai, tāpēc dimēra josla parādās pie īsāka viļņa garuma nekā monomēra josla, savukārt lielāku agregātu devums izpaužas kā plecs vēl tālāk spektra zilajā pusē.

Ļoti zemā koncentrācijā tīrā ūdenī dominē monomēri un garāko viļņu josla. Pieaugot kopējai koncentrācijai, pāru formas īpatsvars palielinās un īsāko viļņu josla kļūst izteiktāka attiecībā pret pirmo. Tādēļ abu joslu attiecība raksturo maisījuma sastāvu, nevis tieši tā kopējo koncentrāciju. Mērījums vienā viļņa garumā nevar nošķirt šīs divas formas bez pieņēmuma par to, kura forma ir klātesoša.

Tāpēc atsauces spektriem vienmēr jāpievieno mērījumu apstākļi. Metilēnzilā spektrālo datu uzziņā joslu novietojumi ir apkopoti tabulā kopā ar šķīdinātāju, sāļu fonu, pH, temperatūru un koncentrācijas diapazonu, kurā tie iegūti. Ja norādāt maksimumu bez šiem apstākļiem, skaitlis nav pietiekami precīzi definēts. Divām laboratorijām var būt vienlīdz pareizi dati par atšķirīgiem vienas un tās pašas krāsvielas spektriem, jo tās mērījušas atšķirīgus maisījumus.

Kas maina līdzsvaru

Koncentrācija ir galvenais ietekmējošais faktors. Lai veidotos dimērs, jāsatiekas diviem monomēriem, tāpēc tā īpatsvars pieaug straujāk nekā kopējais krāsvielas daudzums. Ziņotās dimerizācijas konstantes ūdenī tuvu istabas temperatūrai ir tūkstošos uz molāru koncentrācijas vienību, tādēļ dimēra īpatsvars mikromolārā koncentrācijas diapazonā strauji palielinās. Plaša kopīga datu pielāgošana, kas aptvēra krāsvielas koncentrācijas no mikromolāra līdz milimolāram diapazonam, atklāja tetramēra devumu, kas atšķiras no nulles, jau zem 34 mikromolāras koncentrācijas. Tas brīdina nepaļauties uz stingru divu formu modeli koncentrācijās, kas sasniedz desmitus mikromolāru. Precīzi īpatsvari ir atkarīgi no vides, tāpēc šajā rakstā aprakstīti pārmaiņu virzieni, nevis sniegta universāla pārrēķina tabula.

Sāls ir otrs ietekmējošais faktors. Izšķīdušie joni ekranē atgrūšanos starp diviem katjoniem, tāpēc pievienots nātrija hlorīds un līdzīgi elektrolīti pie nemainīgas krāsvielas koncentrācijas novirza maisījumu uz dimēru un agregātu veidošanos. Šī ietekme ir redzama pētījumos par metilēnzilā agregāciju sāļu šķīdumos un ūdens vidē, kuros krāsviela koncentrācijā no aptuveni 1 mikromolāra līdz 3.4 milimolāriem tika mērīta nātrija hlorīda koncentrācijā no 0 līdz 0.15 molāriem. Šajā modeļa pielāgojumā pie lielas krāsvielas un sāls koncentrācijas tetramēra īpatsvars sasniedza aptuveni 0.93. Tāpēc ūdenī un fizioloģiskajā sāls šķīdumā reģistrēti spektri nav savstarpēji aizstājami standarti.

Temperatūra iedarbojas pretējā virzienā. Slāņošanās atbrīvo saistīto ūdeni, un tai pretojas siltumkustība, tāpēc šķīduma sildīšana parasti izraisa daļas dimēru disociāciju atpakaļ par monomēriem, savukārt dzesēšana veicina asociāciju. Pielāgotā disociācijas entalpija ir negatīva — aptuveni mīnus 30 kilodžouli uz molu diapazonā no 282 līdz 333 kelviniem —, kas apstiprina eksotermisku asociāciju. Auksts paraugs, ko mēra tūlīt pēc izņemšanas no ledusskapja, var šķist vairāk agregēts nekā tas pats paraugs pēc līdzsvarošanās līdz istabas temperatūrai.

Šķīdinātājs nosaka sākotnējos apstākļus. Ūdens ar tā spēcīgo hidrofobo efektu veicina plakano krāsvielas katjonu slāņošanos. Spirti, piemēram, etanols un metanols, labāk solvatē gredzenus un izjauc agregātus, tāpēc pie vienādas krāsvielas koncentrācijas etanolā monomēru īpatsvars ir lielāks nekā ūdenī. Aprotoniski līdzšķīdinātāji darbojas līdzīgi: ūdens un DMSO maisījumos pie 293 kelviniem pievienots DMSO nomāca dimerizāciju, norādot uz ūdens struktūras lomu slāņošanās veicināšanā. Ar virsmaktīvajām vielām jāievēro piesardzība, jo tās var iedarboties abos virzienos. Virs kritiskās micellu koncentrācijas micellas var solubilizēt monomērus atsevišķi un atjaunot monomēram raksturīgu spektru. Zem šīs robežas pretēji lādēta virsmaktīvā viela var tieši veicināt slāņošanos: pie 100 mikromolāras krāsvielas koncentrācijas SDS izraisītā polimerizācija sasniedza maksimumu aptuveni pie 4 milimolāras SDS koncentrācijas, kas ir aptuveni puse no micellu veidošanās robežas, pirms pie lielākas virsmaktīvās vielas koncentrācijas notika pārdalīšanās. Pētījums par krāsvielas–šķīdinātāja mijiedarbības un organizētu vidu ietekmi uz metilēnzilā spektriem parāda, cik spēcīgi novērotās joslas nosaka tiešā molekulārā apkārtne, nevis tikai kopējā koncentrācija.

pH ir nozīmīgs galvenokārt galējos apstākļos. Gandrīz neitrālajā diapazonā, ko izmanto lielākajā daļā laboratorijas darbu, metilēnzilais saglabā savu ierasto zilo katjonu formu, un spektru galvenokārt nosaka agregācija. Stipri skāba vai bāziska vide, oksidēšanās–reducēšanās reakcijas, kas rada bezkrāsaino leikoformu, vai saistīšanās ar olbaltumvielām un daļiņām katra pievieno papildu stāvokļus ārpus monomēra–dimēra pāra. Ja spektrs mainās pēc buferšķīduma pievienošanas, pārbaudiet, vai tā sastāvā ir sāļi un saistīšanos veicinoši komponenti, pirms visu attiecināt tikai uz pH. Ķīmijas un protonēšanas uzziņā šie jautājumi par formas identitāti ir nodalīti no šeit aplūkotā agregācijas jautājuma.

Kāpēc Bēra–Lamberta taisne izliecas

Bēra–Lamberta sakarība nosaka, ka optiskais blīvums ir vienāds ar absorbcijas koeficienta, koncentrācijas un optiskā ceļa garuma reizinājumu. Tas ir daļiņu skaitīšanas likums. Tas pieņem, ka skaitītie objekti paliek nemainīgi, mainoties to skaitam: ir viena absorbējoša forma, nemainīgs spektrs, nenotiek ķīmiskas pārmaiņas atkarībā no koncentrācijas, mērījumiem izmanto monohromatisku gaismu, nenotiek izkliede vai atkārtota emisija, un gaisma patiešām šķērso norādīto ceļu.

Agregācija pārkāpj pirmo pieņēmumu. Formāli kopējais optiskais blīvums joprojām ir visu formu devumu summa: optiskā ceļa garums, reizināts ar katras formas absorbcijas koeficientu un tās koncentrāciju. Katra forma pakļaujas likumam. Maisījums nepakļaujas, jo atsevišķo formu koncentrācijas ir nelineāras kopējās krāsvielas koncentrācijas funkcijas. Tāpēc kalibrēšanas līkne, kas attēlo optisko blīvumu monomēra joslā atkarībā no kopējās krāsvielas koncentrācijas, ļoti atšķaidītos šķīdumos sākas kā taisne un, koncentrācijai pieaugot, izliecas lejup, jo katrs pieaugums pievieno proporcionāli mazāk monomēra. Dimēra joslā mērītā līkne izliecas pretējā virzienā. Agregācijas pētījumos tieši šis mehānisms ir norādīts kā novēroto noviržu no Lamberta–Bēra likuma cēlonis. Tipiska kļūda ir pielāgot taisni izliektajam apgabalam un to ekstrapolēt. Taisne ir derīga tikai tajā diapazonā un matricā, kurā tā izveidota.

Atšķaidīšana rada līdzīgu slazdu. Koncentrēta izejšķīduma atšķaidīšana, lai iekļautos instrumenta mērījumu diapazonā, nesaglabā formu attiecību. Atšķaidītajā šķīdumā kivetē līdzsvars no jauna nobīdās monomēra virzienā, tāpēc tā spektrs pareizi raksturo atšķaidīto paraugu, bet nepareizi — izejšķīdumu. Izejšķīduma spektra atpakaļaprēķins, proporcionāli palielinot optiskā blīvuma vērtības, ļauj atgūt kopējā satura novērtējumu tikai tad, ja kalibrēšanā šī nobīde jau ir ņemta vērā. Tas nekad neatjauno sākotnējo joslu formu. Ikviens, kas salīdzina koncentrāta spektru ar atšķaidīta šķīduma atsauces spektru, salīdzina divus atšķirīgus maisījumus.

Optiskā ceļa garums ir daļa no rezultāta

Optiskais blīvums mainās proporcionāli attālumam, ko gaisma veic paraugā. 10 mm kivete uzrāda desmitreiz lielāku optisko blīvumu nekā 1 mm kivete ar to pašu šķīdumu. Šī proporcionalitāte ir precīza tikai vienam un tam pašam šķīdumam, un agregācijas dēļ šī atruna ir būtiska.

Praksē optiskā ceļa garums ir līdzeklis, ar kuru palikt derīgajā diapazonā. Garš ceļš nodrošina jutību atšķaidītiem šķīdumiem, kuros pārsvarā ir monomēri. Īss ceļš ļauj koncentrētu paraugu izmērīt instrumenta diapazonā bez ievērojamas atšķaidīšanas, kas mainītu līdzsvaru. Agregācijas pētījumā, no kura iegūti iepriekš minētie skaitļi, tika izmantota tieši šāda pieeja: 1 centimetra kivetes krāsvielas koncentrācijai no 1.1 līdz 34 mikromolāriem un 0.01 centimetra kivetes koncentrācijai no 94 mikromolāriem līdz 3.4 milimolāriem. Mikrotilpuma mērījumu platformām un mikroplašu lasītājiem ir sava ģeometrija ar īsiem un reizēm mainīgiem optiskajiem ceļiem, kā arī virsmām, uz kurām katjonu krāsviela var adsorbēties. Norādiet optiskā ceļa garumu kopā ar mērījuma vērtību, tāpat kā spektrālo datu uzziņā norāda šķīdinātāju un sāli. Optiskais blīvums bez optiskā ceļa garuma nav rezultāts. Tās ir baumas.

No šī mehānisma izriet prasības mērījumu veikšanai. Pirms mērīšanas ļaujiet paraugiem sasniegt vienādu temperatūru. Izmantojiet viena veida kivetes vienādā orientācijā, atbilstošus tukšos paraugus ar tādu pašu sāļu un buferšķīduma fonu, kā arī tīrus stikla traukus, jo metilēnzilais adsorbējas uz stikla un plastmasas, un iekrāsota kivete saglabā iepriekšējā koncentrētā parauga pēdas. Ja agregācijas kinētikai ir nozīme, mērījumus veiciet drīz pēc sagatavošanas un katru kalibrēšanas līkni veidojiet tajā pašā matricā un ar tādu pašu optiskā ceļa garumu kā nezināmajiem paraugiem. Vizuālās pārbaudēs atcerieties, ka acs ir vājš spektrometrs. Jautājums, vai šķīduma krāsa var apliecināt tīrību, ir atsevišķs, un atbilde uz to ir noliedzoša; agregācijas izraisītās nokrāsas pārmaiņas ir viens no iemesliem.

Shēma, ko turēt līdzās instrumentam

Tālāk redzamajā attēlā raksta saturs ir apkopots vienā laboratorijas darbam noderīgā uzziņas shēmā. Trijos šķīdumos ir viena un tā pati krāsviela, taču atšķiras tās kopējā koncentrācija un sāļu fons. To shematiskie spektri parāda, kā, pieaugot slāņošanās pakāpei, garāko viļņu monomēra joslas īpatsvars samazinās par labu īsāko viļņu dimēra joslai. Apstākļi ir norādīti attēlā, jo bez tiem līknes nevar izmantot atkārtoti. Izmērītos joslu novietojumus noteiktos apstākļos meklējiet spektrālo datu uzziņā. Par to, kā izšķīdusī krāsviela nonāk šūnās, lasiet rakstā par iekļūšanu šūnās reducēšanās un sadalīšanās starp fāzēm ceļā. Par to, kā gaismas deva un ģeometrija papildus ietekmē fotoķīmisko mērījumu rezultātus, lasiet rakstā par gaismas iedarbību un mērījumu ģeometriju.

Galvenajam principam ir divas daļas. Spektrs raksturo maisījumu, kas norādītajos apstākļos atrodas kivetē. Tikai kalibrēšana, kas veikta tajos pašos apstākļos, ļauj pārvērst optisko blīvumu kopējā koncentrācijā.