Reaktiv Sauerstoffspezies a Methylenblo-Experimenter moossen

Zwee Laboratoirë féieren en Experiment duerch, dat si allebéid als Methylenblo-Antioxidant-Experiment bezeechnen. Dat eent bericht, datt de Faarfstoff reaktiv Sauerstoffspezies ënnerdréckt. Dat anert bericht, datt en se produzéiert. Allebéid weisen propper Dosis-Wierkungs-Kéieren. Allebéid sinn éierlech. Den Ënnerscheed läit weder u Bedruch nach un Inkompetenz. Déi zwou Gruppen hu verschidde Saachen ënner ënnerschiddlechem Liicht gemooss, mat Sonden, déi verschidde Froe beäntweren, an hunn duerno béid Äntwerte mam selwechte Wuert beschriwwen: ROS.

Methylenblo ass eng Moleküll, déi schwéier präzis ze moossen ass, well se un där Chimie deelhëlt, déi se soll observéieren. Am Däischteren transportéiert se Elektronen tëscht Donateuren an Akzeptoren a kënnt an hir Ausgangsform zeréck, prett fir en neien Zyklus. Ënner Liicht gëtt se zu engem Photosensibilisator an erreecht en ugerreegten Triplettzoustand, aus deem se Energie op Sauerstoff iwwerdroe kann, fir Singulett-Sauerstoff ze bilden, oder Elektronen iwwerdroe kann, fir Radikaler a Waasserstoffperoxid ze bilden. All Sond, déi an dëse System agebruecht gëtt, ka vum Faarfstoff selwer oxidéiert, reduzéiert, ausgebleecht oder optesch maskéiert ginn. Déi éischt Fro bei all ROS-Miesssignal ass dofir ni, wéi héich de Wäert ass. Si ass, wat den Assay tatsächlech detektéiert a wat de Faarfstoff mam Assay mécht.

Amplex Red: e kalibréierte Waasserstoffperoxid-Assay

D'Kombinatioun vu Methylenblo an Amplex Red ass an dëser Literatur déi am beschte begrënnbar Kombinatioun, wann se richteg opgebaut ass. D'Chimie ass spezifesch: Peroxidase aus Mierrettich benotzt Waasserstoffperoxid, fir den Amplex-Substrat zu engem fluoreszente Produkt, Resorufin, ze oxidéieren, mat enger ongeféier eent-zu-eent-Stöchiometrie. Peroxid aus der Prouf gëtt zu Fluoreszenz am Detekter. Näischt anescht aus der klassescher ROS-Famill dreift dës Reaktioun direkt un.

Den entscheedende Virdeel ass d'Kalibratioun. Wien suergfälteg schafft, moosst bekannt Peroxidstandarden am selwechte Puffer, mat de selwechte Peroxidase- a Substratkonzentratiounen, der selwechter Inkubatiounszäit an de selwechten opteschen Astellungen, a liest duerno d'Prouwen un dëser Kéier of. An der Etüd mat isoléierte Gehiermitochondrien, op där dës Method baséiert, hunn d'Auteuren genee dat gemaach: Si hunn um Enn vun all Laf bekannt Quantitéite vu Peroxid bäigefüügt, an d'Wäerter ginn als Raten a Pikomol pro Minutt pro Milligramm Protein uginn, amplaz als arbiträr Fluoreszenzeenheeten. Dat mécht aus engem Liichten eng Miessung.

Dräi Detailer aus där Etüd verdéngen et, iwwerholl ze ginn. Éischtens hunn d'Auteuren d'Signal mat Katalase iwwerpréift, déi Peroxid ofbaut. Déi duerch Methylenblo ausgeléist Hausse vun der Fluoreszenz huet opgehalen, wéi Katalase bäigefüügt gouf. Dat huet bestätegt, datt d'Signal vu Peroxid koum an net vun engem opteschen Artefakt. Zweetens hu si d'Beliichtung direkt getest, andeems si den Ureegungsstral mat engem Verschloss ënnerbrach hunn, sou datt d'Prouwen een Aachtel vun der normaler Liichtdosis kruten. D'Signal ass nëmmen ëm néng Prozent gefall. Méi wéi nonzeg Prozent vum Peroxid, dat si gemellt hunn, war onofhängeg vum Miessliicht. Drëttens hu si d'Peroxideliminatioun separat mat enger Elektrod gemooss a festgestallt, datt de Faarfstoff souwuel d'Produktioun erhéicht wéi och d'Eliminatioun verlangsamt huet. Eng Sond, déi nëmmen d'Nettofluoreszenz ugëtt, hätt dës zwee Effekter matenee vermëscht.

Den Assay huet trotzdeem Feelerquellen, a Methylenblo bréngt der e puer dovun zum Virschäin. De Faarfstoff absorbéiert breet an deem selwechte roude Beräich, an deem Resorufin emittéiert. Bei héije Faarfstoffkonzentratioune kann d'Prouf dofir hiert eegent Signal duerch bannenzeg Filtereffekter maskéieren. Standarde sollten dowéinst déi selwecht Faarfstoffkonzentratioun enthalen wéi d'Prouwen. Amplex Red kann och eleng photooxidéieren, a säi Produkt Resorufin kann a Photoredoxzyklen erakommen, déi Superoxid a Peroxid produzéieren. Dat ass besonnesch wichteg, wann am Experiment och e Photosensibilisator beliicht gëtt. Déi praktesch Léisung ass, d'Methylenblo-Prouwen als éischt ze bestraalen an duerno Aliquoten am Däischteren mat Amplex-Reagenzien ze analyséieren, amplaz Faarfstoff a Sond zesummen ze beliichten. Schlussendlech ënnerdréckt Superoxiddismutase en Amplex-Signal net einfach: D'Ëmwandlung vu Superoxid a Peroxid kann et erhéijen. Eng SOD-Kontroll, déi d'Fluoreszenz erhéicht, huet net versot. Si huet Superoxid als virgeschalt Spezies identifizéiert.

DCFDA: en onspezifeschen Oxidatiounsindikator

D'Kombinatioun vu Methylenblo an DCFDA ass d'Quell vun de meeschte Mëssverständnesser. DCFH-DA ass e Virgänger, mat deem Zelle beluede ginn. Esterasen an der Zell spalten seng Acetatgruppen of, sou datt net-fluoreszent DCFH iwwreg bleift; d'Oxidatioun vun DCFH ergëtt fluoreszent DCF. D'Lëscht vun de Substanzen, déi et oxidéieren, ass laang: Hydroxylradikaler, Peroxidase- an Häm-Zwëscheprodukter, Stickstoffdioxid, hypochloreg Saier a Radikaler, déi aus Peroxynitrit entstinn. Waasserstoffperoxid eleng oxidéiert et net direkt mat enger brauchbarer Vitess; peroxidofhängeg Fluoreszenz erfuerdert allgemeng Eisen, Hämproteinen oder Peroxidasechimie am Reaktiounssystem.

D'Kritik, déi all Methodesektioun zitéiere sollt, kënnt aus der Analys vun DCFH als Sond duerch Kalyanaraman a seng Kolleegen, wéi se an der Gehiermitochondrien-Etüd zesummegefaasst ass, déi DCFDA aus dësem Grond verworf huet. Si hu gewisen, datt de Faarfstoff lues reagéiert, mat enger net charakteriséierter Stöchiometrie, ouni valabel Kalibratioun an och mat Verbindungen, déi keng ROS sinn. D'Sond verstäerkt och dat, wat se moosst: Eng Een-Elektron-Oxidatioun vun DCFH produzéiert en DCF-Radikal, dat mat Sauerstoff reagéiert a Superoxid bilt, dat zu zousätzlechem Peroxid dismutéiert. D'Miessung produzéiert also deelweis déi Chimie, déi se ugëtt.

Näischt dovu mécht DCFDA onnëtz. Et mécht et zu engem Screening, net zu enger Identifikatioun. Eng Hausse vun der DCF-Fluoreszenz bedeit, datt déi oxidantofhängeg Oxidatioun vun der Sond zougeholl huet. Et bedeit net, datt de Peroxid zougeholl huet, a sécher net, datt d'Gesamtquantitéit u ROS zougeholl huet — eng Gréisst, déi keng eenzel Sond moosst. Fréier Aarbechte mat Methylenblo, déi sech iwwer engem Mikromol pro Liter op DCF-Oxidatioun verlooss hunn, hu prooxidativ Effekter gemellt, wärend aner Systemer aus där selwechter Zäit Schutz géint peroxidinduzéierten Zelldoud gemellt hunn. Béid Observatioune kënne fir dee selwechte Faarfstoff a verschiddene Redoxkontexter richteg sinn, an d'DCF-Resultat eleng kann net soen, wéi en Oxidant d'Signal vermëttelt huet. Déi fréier Aarbecht iwwer Gehiermitochondrien ass dofir wichteg, well se dëse Screening duerch eng kalibréiert Peroxidmiessung ersat an d'Belaaschtung direkt festgestallt huet: Schonn honnert Nanomol pro Liter Faarfstoff hunn d'Peroxidfräisetzung bei all geteste Substrat an Atmungszoustand ëm e Méifacht erhéicht.

DCFDA huet nach eng weider, methylenblo-spezifesch Fal. De Faarfstoff ass intensiv gefierft a redoxaktiv, sou datt en d'Fluoreszenz ausbleechen, d'Emissioun läschen oder d'Sond onofhängeg vun zelluläre ROS cheemesch oxidéiere kann. Eng zellfräi Kontroll mat Faarfstoff a Sond, awer ouni Zellen, ass keng optional Dekoratioun. Et ass dat Experiment, dat weist, ob de Faarfstoff mat der Sond interagéiert.

Spin-Trapping a Sauerstoffopnam: Identitéit a Flux

Wärend fluoreszent Sonden uginn, datt eppes Oxidéierbares opgetrueden ass, gëtt Elektronespinresonanz mat Spinfänger e méi direkten Hiweis drop, wat et war. Déi klassesch Etüd iwwer d'Photochimie vu Methylenblo huet ESR benotzt, fir den Ascorbatradikal aus Faarfstoff, Ascorbat a Liicht ze detektéieren. Duerno huet se d'Peroxidbildung an Experimenter zur Sauerstoffopnam an d'eisenkatalyséiert Bildung vun Hydroxylradikaler a Spin-Trapping-Versich gewisen. All Technik huet déi Fro beäntwert, déi déi aner net beäntwere konnten: ESR huet d'Identitéit vun de Radikale geliwwert, d'Sauerstoffopnam de Reaktiounsflux onofhängeg vun all fluoreszenter Sond, an d'Kombinatioun huet gewisen, datt souwuel Singulett-Sauerstoff- wéi och Radikalweeër am selwechte beliichte System aktiv waren.

Dat Resultat vun 1984 liest sech nach ëmmer wéi e Warnhiweis. Mat Beliichtung an engem Reduktiounsmëttel huet de Faarfstoff Peroxid produzéiert; a Präsenz vun Eisen huet de System den Hydroxylradikal produzéiert, déi reaktivst Spezies aus dëser Grupp. D'Auteuren hunn dat mat Ascorbat am A a Verbindung bruecht an en onbeduechten ophthalmologeschen Asaz a Fro gestallt. Haut sollt een d'Bedéngunge genee beuechten: Liicht plus Reduktiounsmëttel plus Eisen. Wann ee vun dësen dräi Facteure feelt, gëtt de Reaktiounswee méi schwaach oder verschwënnt.

Sauerstoffelektrode verdéngen hir Plaz op eng aner Manéier. Eng Elektrod vum Clark-Typ moosst den Nettoverbrauch vu Sauerstoff. Dat weist, datt déi vum Faarfstoff ugedriwwe Redoxchimie molekulare Sauerstoff verbraucht, a liwwert eng Kinetik, déi kee Fluoreszenzartefakt vir täusche kann. Si identifizéiert d'Produkt net. Peroxid, Superoxid, Waasser an den Zerfall vu Singulett-Sauerstoff verbrauchen alleguer Sauerstoff. Flux ouni Identitéit ass genee esou onvollstänneg wéi Identitéit ouni Flux. Dofir kombinéieren déi iwwerzeegend Publikatiounen d'Elektrod mat engem kalibréierte Peroxid-Assay oder engem Fänger.

Firwat Resultater iwwer antioxidativ Effekter sech widderspriechen

Wann een déi dräi Miesssignaler niewentenee leet, léisen déi anscheinend Widderspréch an der Methylenblo-Literatur sech a Methodënnerscheeder plus dräi biologesch Fakten op.

Éischtens ass de Faarfstoff souwuel en Elektronentransporter wéi och eng Peroxidquell. Andeems en Elektrone vun de Plaze vun der Zellatmung ewechleet, wou Sauerstoff soss zu Superoxid géif ginn, kann en eng ROS-Spezies reduzéieren, wärend seng reduzéiert Form Sauerstoff direkt zu Peroxid reduzéiert an domat eng aner erhéicht. E Laboratoire, dee sech mat mitochondrialer Redoxchimie an der Roll vu Methylenblo als Ëmgeeungswee befaasst, sollt dofir sondenofhängeg Äntwerten erwaarden: E superoxidempfindlecht Miesssignal fält, wärend e Peroxid-Miesssignal an der selwechter Kuvett klëmmt.

Zweetens ass Peroxid a niddregen Dosen e Signal, net nëmmen e Schued. Déi Etüd mat Gehiermitochondrien vu Mais, déi op déi fréier Aarbecht gefollegt ass, huet Peroxidbildung scho bei fofzeg Nanomol pro Liter Faarfstoff ouni Läsionen an der mitochondrialer DNA bei therapeutesche Konzentratioune festgestallt, mat Schutz géint rotenoninduzéiert Läsionen no enger Virbehandlung. Eréischt bei honnert Mikromol pro Liter, wäit iwwer dem therapeutesche Beräich, huet de Faarfstoff ausgewielt DNA-Fragmenter beschiedegt, a rout Liicht plus zwanzeg Mikromol pro Liter Faarfstoff huet Singulett-Sauerstoff produzéiert, deen all getest Fragmenter beschiedegt huet. De virgeschloene Mechanismus ass hormetesch: Eng liicht Peroxidproduktioun léist Nrf2-verbonne antioxidativ Verdeedegungsmechanismen a mitochondrial Biogenese aus, sou datt e kuerzfristegt prooxidatiivt Miessresultat engem méi laangfristegen antioxidative Resultat virausgeet. En Assay, deen no enger Stonn ofgelies gëtt, an en Assay, deen no engem Dag ofgelies gëtt, kënne sech widderspriechen, well d'Biologie sech dotëscht verännert huet.

Drëttens entscheet d'Liicht, wéi eng Moleküll iwwerhaapt präsent ass. Beliichtung demethyléiert de Faarfstoff a Richtung Azure B a verwandte Produkter, an d'Mikroskopluucht iwwer enger Schuel geet duer, fir en ze photosensibiliséieren. Experimenter am Däischteren a beliichten Experimenter si verschidden Experimenter, an d'Sektioun iwwer Kontrolle fir d'Beliichtung an den Ëmgang mam Faarfstoff an all Protokoll sollt se och esou behandelen.

E Minimum u Kontrollen, a wéi een all Ausso liest

De Verglach hei drënner ass dat ursprénglecht Referenzmaterial fir dësen Artikel. Ier Dir e Methylenblo-ROS-Resultat akzeptéiert, kontrolléiert, wéi eng Zeil d'Auteuren ausgefëllt hunn a wéi eng si iwwersprongen hunn.

Doraus ergëtt sech eng praktesch Liesreegel. Amplex mat Peroxidase, kalibréiert a mat enger Katalasekontroll iwwerpréift, liwwert Beweiser iwwer Peroxid. DCFDA liwwert Beweiser iwwer onspezifesch Sondenoxidatioun an näischt méi. Spin-Trapping mat Radikalfängerkontrolle liwwert Beweiser iwwer d'Identitéit vu Radikaler. Sauerstoffopnam liwwert Beweiser iwwer de Flux. E Saz, dee méi behaapt, wéi säin Assay ënnerstëtze kann, ass e Saz iwwer d'Sond an net iwwer de Faarfstoff, egal wéi zouversiichtlech en formuléiert ass. Verbonne Diskussiounen iwwer Dosisofhängegkeet an den hormetesche Beräich, de mitochondrialen Elektronefloss, Assay-Interferenzen a gefierfte Prouwen a Beliichtungsartefakter an der Mikroskopie verdéiwen all dës Punkten, an all Punkt bleift valabel, soubal seng Plazhalterreferenz ersat gëtt.