Methylenblo a Stickstoffmonoxid: NOS, cGMP a vaskulär Signaliwwerdroung

D'Fro kléngt einfach: Hemmt Methylenblo Stickstoffmonoxid? Am Laboratoire deelt sech d'Äntwert a véier separat Froen op, an all eenzel verlaangt en aneren experimentellen Test. Datt dës Froen duerchernee bruecht ginn, ass den Haaptgrond, firwat Texter iwwer Methylenblo a Stickstoffmonoxid iwwerzeegt, awer vag kléngen.

Stellt Iech d'Stickstoffmonoxid-Signal als eng Kette mat véier Glidder vir. E Gen gëtt transkribéiert, fir Stickstoffmonoxid-Synthase ze produzéieren. D'Enzym wandelt Arginin a Stickstoffmonoxid ëm. De Gas diffuséiert zu sengem Zil, éier e mat eppes anescht reagéiert. Déi löslech Guanylatcyclase erkennt en a produzéiert zyklëscht GMP. Fir Methylenblo goufen Effekter op all Glidd publizéiert, mee d'Beweiser stamen aus verschiddene Präparatiounen, bei verschiddene Konzentratiounen a mat verschiddenen Isoformen. E Resultat bei engem Glidd beweist keng Wierkung bei engem aneren.

Déi kanonesch Kette, einfach erkläert

An der Mauer vun engem Bluttgefäss leeft déi üblech Sequenz esou of. E Reiz wierkt op eng Endothelzell. Déi endothelial Stickstoffmonoxid-Synthase, eNOS oder NOS3 genannt, produzéiert e klenge Puls vu Stickstoffmonoxid. De Gas diffuséiert an déi Nopeschzell vun der glater Muskulatur, bindt un dat reduzéiert Eisen-Häm vun der löslecher Guanylatcyclase a beschleunegt d'Ëmwandlung vu GTP an zyklëscht GMP. Zyklëscht GMP aktivéiert d'Proteinkinase G, d'Kalziumregulatioun verännert sech, an de Muskel entspaant sech.

Et gëtt eng zweet Kette, déi ee separat betruechte soll. Wärend enger Infektioun oder bei Kontakt mat Zytokine transkribéieren d'Zellen en anert Enzym: déi induzéierbar Stickstoffmonoxid-Synthase oder iNOS, och NOS2 genannt. Si produzéiert méi grouss a méi laang unhalend Stickstoffmonoxid-Flëss wéi eNOS. Eng drëtt Isoform, déi neuronal NOS oder nNOS, gehéiert nees an en anere Kontext. Wann eng Publikatioun vu Stickstoffmonoxid-Synthase schwätzt, ouni d'Isoform unzeginn, sollt Dir kucken, wéi eng gemooss gouf. Den Iwwerbléck doriwwer, wéi Methylenblo Elektrone beweegt, mécht dee selwechte Punkt fir Redox-Ziler am Allgemengen: D'Relais mécht eleng näischt, an de Partner op all Enn bestëmmt d'Resultat.

Gemoossent zyklëscht GMP ass och en integréierte Moosswäert, keen direkten Enzymtest. Säin Niveau reflektéiert d'Synthes duerch d'Cyclase minus den Ofbau duerch Phosphodiesterasen, besonnesch PDE5 an der glater Gefässmuskulatur. E Réckgang vum zyklësche GMP bedeit dofir, datt manner Signal beim Detektor ukomm ass. Eleng seet en net, wéi ee Glidd ausgefall ass.

Glidd 1: Et gëtt manner iNOS-Enzym produzéiert

A Mausmakrophagen, déi mat bakteriellem Lipopolysaccharid, Interferon gamma oder béidem stimuléiert goufen, huet Methylenblo déi erwaart Erhéijung vum iNOS-Protein verhënnert an d'iNOS-Messenger-RNA staark ënnerdréckt, wéi d'Experimenter zur Transkriptioun a Makrophagen weisen. Opschlossräich ass dobäi, wat sech net verännert huet. Den Ofbau vum Inhibitor I kappa B alpha, d'Phosphoryléierung vun NF kappa B a STAT1 an de Passage vun dëse Facteuren an den Zellkär si gréisstendeels intakt bliwwen. Wat ofgeholl huet, war hir Bindung un d'DNA. Dat gouf duerch Chromatin-Immunpräzipitatioun bestätegt, déi eng reduzéiert Besetzung vum iNOS-Promotor gewisen huet.

Dat ass en Effekt op d'Genregulatioun, dee virun der Quantitéit vum Enzym usetzt, keng akut Blockad vun engem bestoenden Enzym. E gehéiert zur entzündlecher Signaliwwerdroung, bei där Transkriptiounsfacteure musse mat engem Promotor bannen, éier Protein entsteet. E seet näischt Direktes iwwer konstitutiv eNOS an engem rouende Gefäss aus a soll och esou beschriwwe ginn.

Glidd 2: Dat bestoend NOS-Enzym schafft méi lues

Eng Etüd mat Raten huet en aneren Niveau ënnersicht. Waakreg männlech Raten hunn intravenös Lipopolysaccharid kritt an dräi Stonne méi spéit entweder eng Salzléisung oder Methylenblo mat 3 mg per kg intravenös. D'Aktivitéit vun der Stickstoffmonoxid-Synthase am mediale basalen Hypothalamus gouf iwwer d'Ëmwandlung vu markéiertem Arginin a Citrullin gemooss, an der Etüd zur hypothalamescher NOS-Aktivitéit. Stress zesumme mat Salzléisung eleng huet schonn eng gewësse kalziumonofhängeg Aktivitéit induzéiert, a Lipopolysaccharid huet se op ongeféier dat Zéngfacht vum Kontrollniveau erhéicht. Methylenblo huet béid induzéiert Komponenten eliminéiert. Déi kalziumofhängeg konstitutiv Aktivitéit huet sech an deem Tissu bei där Dosis an zu deem Zäitpunkt net verännert.

Liest dëst Resultat genee esou, wéi et formuléiert ass: Ënner dëse Bedéngunge gouf déi gemoossen Aktivitéit vum iNOS-Typ ënnerdréckt. Dat ass keng Miessung vun der Genexpressioun a kee Beweis fir eng dauerhaft Selektivitéit fir iNOS géintiwwer eNOS oder nNOS. Aarbechte mat gereinegten Enzyme ënnersträichen dës Virsiicht. Bei direkten Tester vu gereinegter Stickstoffmonoxid-Synthase huet Methylenblo d'Citrullinbildung bei 30 micromolar komplett blockéiert. D'Konzentratioun fir eng Hallefhemmung louch bei ongeféier 5.3 micromolar ouni Superoxid-Dismutase an 9.2 micromolar mat hir, wéi am Verglach vu gereinegter NOS a Guanylatcyclase bericht gouf. Eng separat Etüd mat gereinegter nNOS huet op d'Oxidatioun vum enzymgebonnenen Häm higewisen. Déi praktesch Erkenntnis ass, datt direkt NOS-Hemmung an isoléierte Systemer wierklech existéiert. D'Resultat aus dem Hypothalamus däerf awer net zu enger allgemenger Ausso ausgedeent ginn, datt Methylenblo iwwerall all konstitutiv NOS verschount.

Glidd 3: Stickstoffmonoxid geet verluer, éier et ukënnt

De kloerste Beweis, datt eppes anescht wéi eng Enzymblockad e Réckgang vum zyklësche GMP erkläre kann, kënnt vu kultivéierten Zelle vun der glater Muskulatur aus de Longenarterie vu Kanéngercher. Den experimentellen Opbau huet déi endogen NOS komplett ëmgaangen, andeems direkt Stickstoffmonoxid-Donateuren derbäigesat goufen. Duerno gouf an der Etüd zu Superoxid an der glater Gefässmuskulatur ënnersicht, ob Methylenblo d'Reaktioun vum zyklësche GMP nach ëmmer ënnerdréckt.

Dräi Donateure goufe vun 1 bis 100 micromolar getest: S-Nitroso-L-Cystein, Natriumnitroprussid an e stabilen deaminéierten Analog mam Numm MPANO. Si hunn alleguer dat zyklëscht GMP op ongeféier dat 1.5-Facht bis 12-Facht erhéicht. Methylenblo bei 10 micromolar huet déi éischt zwee ëm 51 bis 100 Prozent gehemmt an d'MPANO-Reaktioun onverännert gelooss. Wann Methylenblo einfach de katalyteschen Zentrum vun der Cyclase blockéiere géif, wier dës Donateureselektivitéit schwéier ze erklären, well all dräi op dat selwecht nogelagert Enzym wierken.

Dräi Kontrollversich hunn de Mechanismus duerno op Superoxid zeréckgefouert. Éischtens huet d'Produktioun vun extrazellulärem Superoxid mat Xanthin plus Xanthinoxidase dat selwecht Muster reproduzéiert: CYSNO an Nitroprussid goufe blockéiert, MPANO gouf verschount. Zweetens huet Methylenblo eng dosis- an zäitofhängeg Superoxidproduktioun an den Zelle vun der glater Muskulatur ausgeléist, gemooss iwwer d'Reduktioun vu Cytochrom c. Drëttens huet Superoxid-Dismutase d'Hemmung komplett verhënnert, wärend Katalase dat net gemaach huet. Dat weist an där Präparatioun op Superoxid amplaz vu Waasserstoffperoxid als déi direkt verantwortlech Spezies hin.

D'Kokultur-Versioun vum Experiment ass derwäert ze beschreiwen, well se den Effekt raimlech lokaliséiert. Endothelzellen op Deckglieser goufe kuerz zesumme mat Zelle vun der glater Muskulatur kultivéiert. Doduerch huet e basal fräigesaten endothe­liale Facteur dat zyklëscht GMP an der glater Muskulatur op dat Dräi- bis Aachtfacht erhéicht. Eng Virbehandlung vun engem vun deenen zwee Kompartimenter mat Methylenblo huet dat Signal reduzéiert, a Superoxid-Dismutase huet den Effekt vun der endothelialer Virbehandlung deelweis opgehuewen. An anere Wierder: Methylenblo muss iwwerhaapt net bannent der Detektorzell vun der glater Muskulatur wierken. Et kann d'Signal reduzéieren, andeems et de Botenstoff ënnerwee eliminéiert. De Guide fir d'Liese vu Methylenblo-Fuerschung behandelt dat als allgemeng Reegel: Nennt d'Kompartiment, an deem den Agrëff stattfonnt huet, éier Dir e molekulaart Zil nennt.

Dat als NOS-Hemmung ze bezeechnen, wier falsch. Fir datt d'Donateure wierken, war kee Synthase-Schrëtt néideg, an trotzdeem huet d'Signal ofgeholl.

Glidd 4: Den Detektor selwer reagéiert manner

Direkt Effekter op déi löslech Guanylatcyclase existéieren, mee d'Konzentratioune si wichteg. Am uewe genannten Enzymverglach war fir déi duerch Stickstoffmonoxid stimuléiert Cyclase ongeféier 60 micromolar Methylenblo fir eng Hallefhemmung néideg, géintiwwer ongeféier 5 bis 9 micromolar fir d'Hallefhemmung vun NOS. Och 1 millimolar huet nëmmen eng deelweis maximal Blockad bewierkt. Dat ass en Ënnerscheed vun ongeféier dem Sechs- bis Eeleffachen. En Zellexperiment bei niddrege micromolar-Konzentratiounen, dat zyklëscht GMP reduzéiert, däerf dofir net eleng op Basis vum GMP-Moosswäert als selektiv Cyclase-Hemmung bezeechent ginn.

Eng spéider Redox-Etüd huet op en zweeten Aspekt higewisen, dee Virsiicht verlaangt: Methylenblo huet déi duerch Stickstoffmonoxid aktivéiert Cyclase duerch e Mechanismus deaktivéiert, dee sech vun enger einfacher Oxidatioun vum Häm-Eisen duerch Loft ënnerscheet. Den Detektor kann also beeinträchtegt ginn, mee d'Chimie ass net definitiv gekläert. Wéinst dem Konzentratiounsënnerscheed sollten d'Superoxid- an NOS-Effekter bei niddrege micromolar-Expositioune fir d'éischt ausgeschloss ginn. Hei gehéiert och d'Kontroll vun der Phosphodiesterase-Aktivitéit hin. Wann den Ofbau net gemooss oder blockéiert gouf, ass eng reduzéiert Akkumulatioun vu zyklëschem GMP souwuel mat manner Synthes wéi mat méi séierem Ofbau oder mat béidem vereinbar.

Firwat dat net op eng eenzeg Ausso iwwer de Bluttdrock reduzéiert ka ginn

All Glidd gouf an engem anere System nogewisen. Transkriptioun a Makrophagen ass net dat selwecht wéi Enzymaktivitéit am Hypothalamus. Hypothalamesch Aktivitéit no Lipopolysaccharid ass net dat selwecht wéi endothelialen Toun am Rouzoustand. E basal fräigesaten endotheliale Facteur an enger Kokultur ass net dat selwecht wéi eng duerch Agoniste stimuléiert Vasodilatatioun. Kultivéiert Longenarterienzelle bei 10 micromolar Methylenblo si kee mënschleche Bluttkreeslaf. Wann een dat alles zu enger Ausso wéi „Methylenblo erhéicht de Bluttdrock, andeems et Stickstoffmonoxid blockéiert“ zesummefaasst, verwërft een genee déi Ënnerscheeder, fir deenen hir Erhale d'Kontrollversich entwéckelt goufen.

Dräi Kontrollpunkte halen d'Duerstellung éierlech. Éischtens: Nennt d'Isoform — eNOS fir de vaskulären Toun am Rouzoustand, iNOS fir den induzéierten entzündleche Flux, nNOS fir neuronal Kontexter an e puer Kontexter mat gereinegten Enzymen. Zweetens: Nennt d'Quell vum Stickstoffmonoxid-Signal — endogen Synthes, basal endothelial Fräisetzung oder e spezifeschen Donateur wéi CYSNO, Nitroprussid oder MPANO. Dat ass wichteg, well de stabilen Donateur géintiwwer Methylenblo resistent war, déi labil Donateuren awer net. Drëttens: Nennt d'Konzentratioun a wéi den Effekt opgehuewe gouf — wann Superoxid-Dismutase den Effekt ophieft, weist dat op Superoxid hin; wann Katalase net wierkt, schwätzt dat an där Präparatioun géint Waasserstoffperoxid; d'Nowierkung duerch Xanthinoxidase weist, datt dee Mechanismus eleng duergeet; an Tester mat gereinegten Enzymen trennen direkt Effekter op d'Katalys vu Verloschter ënnerwee.

Déi kuerz Zesummefaassung ass dës: Methylenblo gëtt besser als eng Substanz betruecht, déi d'Signaliwwerdroung vu Stickstoffmonoxid zu zyklëschem GMP op verschiddene Plaze stéiert, wéi als selektive Cyclase-Blocker. Jee no Präparatioun a Konzentratioun kann et d'Bindung vun iNOS-Transkriptiounsfacteure reduzéieren, NOS-Enzyme direkt hemmen, d'Stickstoffmonoxid-Verfügbarkeet duerch Superoxidproduktioun reduzéieren an déi duerch Stickstoffmonoxid aktivéiert Cyclase beeinträchtegen. D'Roll vun der zyklëscher GMP-Signaliwwerdroung a vaskulären Etüden an de Verglach vu Stickstoffmonoxid-Donateuren, déi an Zelltester benotzt ginn behandelen all Kéier eng vun dëse Verzweigungen méi am Detail. D'Methoden, fir Redox-Effekter vun Enzymeffekter ze trennen, erklären, firwat Superoxid-Dismutase plus Katalase plus eng Kontroll mat engem stabilen Donateur esou dacks an dëser Literatur virkommen.

En niddrege Wäert vu zyklëschem GMP no Methylenblo weist op eng ënnerbrach Kette hin. Nëmmen d'Kontrollversich soen, wéi ee Glidd ënnerbrach gouf.