D'Effekter vu Methylenblo op Mitochondrie moossen: Sauerstoff, ATP a Membranpotenzial

Stellt Iech vir, e Laboratoire setzt Methylenblo zu Mitochondrie mat gestéierter Atmung dobäi a gesäit, datt de Sauerstoffverbrauch klëmmt. Et läit no, ze schreiwen, datt de Faarfstoff d'Funktioun vun de Mitochondrie restauréiert huet. Dee Saz ka falsch sinn. Sauerstofffloss, ATP-Synthes a Membranpotenzial sinn dräi verschidde Konzepter. Si hunn déi selwecht Organell gemeinsam, esou wéi Datensécherung, Synchroniséierung an Deelen dee selwechte Cloud-Dossier gemeinsam hunn: Si hänken zesummen, mee ënnerleie verschiddene Reegelen. Wann een eent mam anere verwiesselt, klappt d'Interpretatioun net, och wann all Miessung technesch korrekt ass.

Methylenblo mécht esou eng Verwiesslung warscheinlech, well et um System deelhëlt, deen et moosst. Et duerchleeft Redox-Zyklen, hëlt Elektrone vir an der Ketten op a gëtt se méi wäit hannen erëm of. Et ass e lipophilt Kation, dat sech an energetiséierte Mitochondrien uräichert, an eng staark blo Verbindung, déi Liicht an de selwechte Spektralberäicher wéi gängeg Sonden absorbéiert an emittéiert. Een eenzelt Miesssignal kann dat net alles ofdecken. Déi zouverlässeg Approche, déi sech duerch d'Mitochondriestudien aus Budapest zitt, ass, de Sauerstofffloss zesumme mat der ATP-Synthesvitess, dem Membranpotenzial an der Fräisetzung vu Waasserstoffperoxid ze moossen, mat faarfstoffspezifesche Kontrollen op all Etapp.

Respirometrie moosst de Sauerstofffloss, net d'Energieproduktioun

Héichopléisend Respirometrie, sief et mam Oroboros Oxygraph oder mam Seahorse-Analysator fir extrazellulär Flëss, liwwert eng eenzeg Informatioun: wéi séier Sauerstoff reduzéiert gëtt. Si seet net, wéi vill Protone pro Elektron gepompelt goufen, wéi vill vum Gradient erhale gouf oder ob d'ATP-Synthase en ausgenotzt huet.

D'Begrëffer si wichteg. Bei isoléierte Mitochondrie féiert Substrat ouni ADP zu Leckatmung, Substrat mat saturéierendem ADP weist d'Kapazitéit vun der oxidativer Phosphoryléierung, an d'Titratioun mat engem Entkoppler weist déi maximal Elektronentransferkapazitéit. Bei intakten Zelle sinn d'Seahorse-Entspriechungen d'Basalatmung, déi oligomycinempfindlech ATP-gekoppelt Atmung, d'Protoneleck, déi duerch FCCP definéiert maximal Atmung an den netmitochondriale Sauerstoffverbrauch, dee géint Rotenon an Antimycin resistent ass. D'Seahorse-Resultater als State 3 a State 4 ze bezeechnen, suggeréiert eng Präzisioun, déi dës Preparatioun net erlaabt, wéi de Kader vum Agilent Mito Stress Test kloer mécht.

Methylenblo brécht déi intuitiv Verbindung tëscht méi Sauerstoff a méi Energie. Bei isoléierte Mitochondrien aus dem Gehir vu Meerschwäinchen huet de Faarfstoff bei 100 nM bis 1 uM de Sauerstoffverbrauch am Rouzoustand mat Glutamat plus Malat, Succinat an Alpha-Glycerophosphat als Substrater erhéicht, mat enger Hausse vun ongeféier 64 Prozent bei Alpha-Glycerophosphat. Gläichzäiteg ass déi duerch ADP stimuléiert Atmung bei gesonde Mitochondrien am Wesentlechen onverännert bliwwen, esou d'Studie iwwer isoléiert Gehirmitochondrien. Well d'Leckatmung eropgaangen ass, wärend den duerch ADP stimuléierte Floss konstant bliwwen ass, fält de berechente respiratoresche Kontrollquotient. Dee Réckgang bedeit net, datt de Faarfstoff d'Mitochondrie beschiedegt huet. E bedeit, datt de Faarfstoff en zousätzleche sauerstoffverbrauchende Redox-Zyklus zu der normaler Atmung bäigefüügt huet. E Sauerstoffverbrauchsassay mat Methylenblo, deen nëmmen d'Hausse mellt, huet eng reell chemesch Reaktioun gemooss, awer näischt iwwer d'Erhale vun Energie ausgesot.

D'Experimenter fir d'Funktioun erëm hierzestellen, weisen dee selwechten Ënnerscheed a méi groussem Moossstaf. Bei blockéiertem Komplex I ass de Sauerstofffloss op ongeféier dat Dräifacht geklommen, d'ATP-Synthes awer nëmmen op ongeféier dat 1.5-Facht. Méi Sauerstoff huet d'Elektrod erreecht. Manner dovun huet zur ATP-Produktioun bäigedroen. All Ausso iwwer eng verbessert oxidativ Phosphoryléierung brauch och d'ATP-Säit vun der Bilanz, am beschten als Verhältnis vun ATP pro Sauerstoff, mat enger explizitter Angab vun der Konventioun fir den Nenner.

ATP-Assaye moossen d'Synthesvitess, déi de Gehalt net ersetze kann

En ATP-Assay beäntwert eng aner Fro: wéi vill ATP pro Zäiteenheet entsteet. Eng kinetesch Miessung, entweder iwwer d'Lumineszenz vun der Feierméckeluciferase iwwer e puer Minutten oder iwwer e gekoppelte Hexokinase- plus Glukos-6-Phosphat-Dehydrogenase-Assay bei 340 nm, liwwert eng Vitess. Eng eenzeg Endpunktmiessung vum gesamten ATP liwwert e Gehalt, deen d'Synthes minus de Verbrauch reflektéiert an eleng wéineg iwwer d'oxidativ Phosphoryléierung ausseet.

D'Grupp vu Budapest huet déi gekoppelt enzymatesch Method mat ënnerdréckter Adenylatkinase benotzt a festgestallt, datt Methylenblo bei 1 bis 2 uM d'ATP-Produktioun a mat Rotenon oder Antimycin behandelte Mitochondrien zwar nëmme liicht, awer signifikant erhéicht huet. Dat ass eng tatsächlech, awer deelweis Restauratioun vun der Funktioun. D'Studie iwwer d'Toxizitéit vun TEGDMA ass an engem anere Modell zu engem änleche Resultat komm: 5 mM vum Zännmonomer TEGDMA huet déi u Komplex I gekoppelt Atmung vun ongeféier 286 op 28 Flosseenheete reduzéiert, an 2 uM Faarfstoff huet se erëm op ongeféier 86 bruecht.

Bei enger faarweger Redox-Verbindung sinn zwou Kontrollen onverzichtbar. Éischtens: Benotzt Oligomycin, fir festzestellen, wéi vill vun der gemoossener ATP-Synthes vun der ATP-Synthase ofhänkt. Zweetens: Maacht en zellfräie Widderfannungstest mat enger bekannter Quantitéit bäigefüügtem ATP, dem komplette Reagens an de genee benotzte Faarfstoffkonzentratiounen, op d'mannst 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM an 2 uM. De Faarfstoff kann dat emittéiert Liicht absorbéieren, de Reporterenzym hemmen oder d'Redox-Chemie vum Reagens veränneren. Allgemeng Richtlinne fir Luciferase-Assayen recommandéieren biochemesch Géigentester genee fir dës Zort Interferenz. Gitt net dovun aus, datt 1 uM fräi vun Artefakter ass, just well d'Fluoreszenzläsche bei méi héije Konzentratioune meeschtens méi staark ass.

Membranpotenzialsonde moossen d'Verdeelung vum Faarfstoff, net de Floss

Safranin O, TMRM an TMRE, Rhodamin 123 an JC-1 sinn all membrangängeg Kationen. Si räichere sech no dem elektrochemesche Gläichgewiicht an der negativ geluedener Matrix un. Déi gesamt Fluoreszenz weist d'Potenzial also indirekt iwwer d'Plaz un, wou d'Sond sech befënnt. Keng vun hinne moosst ATP oder den Elektronefloss.

All Sond huet eng Preparatioun, fir déi se besonnesch gëeegent ass. Safranin O eegent sech fir isoléiert Mitochondrien a permeabiliséiert Zellen, typescherweis bei ongeféier 2 uM mat enger Ureegung bei ongeféier 495 nm an enger Emissioun bei ongeféier 585 nm. Dobäi gëtt an engem Läschregime geschafft, an deem d'Opnam d'Gesamtfluoreszenz verännert. TMRM an TMRE eegne sech fir intakt Zelle mat enger niddreger Belaaschtung am nanomolare Beräich an engem Modus ouni Fluoreszenzläschen. Dobäi setzt d'Depolarisatioun de Faarfstoff fräi, an d'Fluoreszenz vun de Mitochondrie geet erof; bei héijer Belaaschtung kann d'Richtung vum Signal duerch Selbstläschen ëmgedréint ginn. JC-1 liwwert e praktescht Gréng-Rout-Verhältnis, hänkt awer vun der Belaaschtung an der Mass vun de Mitochondrien of. Dofir ass et fir quantitativ Aarbechte manner gëeegent wéi suergfälteg kontrolléiert TMRM. Dës Ofweegunge ginn an engem wäit verbreete Revueartikel iwwer Sonde fir d'Membranpotenzial vu Mitochondrien zesummegefaasst.

Methylenblo verursaacht optesch Interferenze genee bei den Aarbechtskonzentratiounen. Seng Absorptiounsbänner bei ongeféier 600 bis 665 nm iwwerlappe sech mat der rouder Emissioun vun de Sonden. Bannenzeg Filtereffekter, Fluoreszenzläschen an d'Absorptioun vum Ureegungsliicht sinn dofir all plausibel. De Faarfstoff ass och en zweet lipophilt Kation, deem seng eege Verdeelung sech mam gemoossene Potenzial verännert. D'Ofsécherung besteet aus Redundanz a Blannprouwen: d'Sond eleng, de Faarfstoff eleng, d'Sond mat all Faarfstoffkonzentratioun, eng komplett Depolarisatioun mat FCCP als Nullreferenz an am beschten eng zweet, optesch ënnerschiddlech Sond. D'Studie iwwer d'Ëmgoe vu Komplex III huet dat virgemaach: Si huet d'Restauratioun vum Membranpotenzial no der Hemmung mat Antimycin a Myxothiazol souwuel mat Safranin O wéi och mat TMRM nogemooss an déi selwecht qualitativ Erhuelung fonnt. Een optesche Reporter ass en Hiweis. Zwee onofhängeg Reportere sinn e Beleg.

Dräi Preparatiounen, dräi verschidde Froen

Isoléiert Mitochondrien, permeabiliséiert Zellen an intakt Zelle sinn net austauschbar Empfindlechkeetsastellunge vun engem eenzegen Assay. Et si verschidde Konzepter mat verschiddene Funktiounsprinzipien.

Isoléiert Mitochondrien erhalen d'Elektronentransportketten, déi bannenzeg Membran an d'Maschinerie vun der Matrix, wärend d'Plasmamembran, de Cytosol an d'Netzwierkarchitektur ewechgeholl ginn. Genee dat ass den Zweck: Substrater, ADP, Inhibitoren a Faarfstoffkonzentratioune si genee definéiert, sou datt een e Reaktiounswee zouuerdne kann. De Präis dofir ass de Verloscht vun der natierlecher Substratversuergung, der Signaléierung an dem Energiebedarf.

Permeabiliséiert Zellen halen d'Mitochondrien a groussen Deeler vun hirer zellulärer Architektur, loossen awer exogen Substrater an ADP duerch déi opgemaachte Plasmamembran eran. Si sinn dat richtegt Instrument, fir en Defekt an engem substratofhängege Reaktiounswee am zelluläre Kontext zouzeuerdnen. Eng ze staark Permeabiliséierung beschiedegt déi baussenzeg Membran, an d'zytosolesch Regulatioun gëtt erausgewäsch.

Intakt Zellen erhalen alles: d'Barrière vun der Plasmamembran, zytosolesch Reduktiounsmëttel, den endogene Substrattransport, d'Netzwierk vun de Mitochondrien an den ATP-Bedarf. Si sinn der Physiologie am noosten an dem Mechanismus am wäitsten ewech, well d'Opnam, d'Reduktioun an d'Sequestratioun vum Faarfstoff all déi effektiv Expositioun vun de Mitochondrie bestëmmen.

D'TEGDMA-Studie huet bewosst all dräi Niveaue benotzt: isoléiert Gehirmitochondrien, fir d'Restauratioun vun der Oxidatioun an dem Potenzial duerch de Faarfstoff ze ënnersichen; permeabiliséiert Stammzellen aus der Zännpulpa, haaptsächlech fir d'Stéierung bei der u Komplex I gekoppelter Substratoxidatioun ze lokaliséieren; an intakt Stammzellen, fir de physiologeschen Nettoeffekt vun 2 uM Faarfstoff op den ënnerdréckte Sauerstoffverbrauch ze moossen. Fir Lieser, déi Miesswäerter vu Mitochondrien tëscht Preparatioune vergläichen, liwwert de begleedenden Erklärartikel doriwwer, wéi Methylenblo Elektronen duerch d'Otemketten beweegt, den Hannergrond zu de Reaktiounsweeër. De Guide fir d'Liese vu Methylenblo-Atmungsstudien behandelt d'Logik vun de Konzentratiounen an den Inhibitoren.

Kontrollen, déi e redoxaktive Faarfstoff verlaangt

E Stoff, dee Redox-Zyklen duerchleeft, brauch eng méi laang Kontrolllëscht wéi en normalen Inhibitor, well chemesch Reaktioune vum Faarfstoff eleng biologesch Effekter kënne miméieren.

Fir d'Respirometrie benotzt eng Kummer nëmme mat Puffer, fir d'Drift ze kontrolléieren, eng Kummer mat Puffer a Faarfstoff ouni biologescht Material, Faarfstoff zesumme mat all extrazellulärem Reduktiounsmëttel, dat am Assay virkënnt, an zum Schluss Rotenon plus Antimycin, fir den netmitochondriale Sauerstoffverbrauch bei intakten Zellen ze definéieren. Beuecht, datt de reduzéierte Faarfstoff erëm oxidéiert gëtt, andeems en Elektronen op Sauerstoff iwwerdréit a Waasserstoffperoxid formt. Eng Blannprouf mat Faarfstoff eleng ouni Elektronendonateur ënnerschätzt dofir den zellfräie Sauerstoffverbrauch, deen entsteet, soubal NADH oder NADPH verfügbar ass.

Fir Waasserstoffperoxid ass kalibréiert Amplex UltraRed mat Meerrettichperoxidase den netselektiven DCFDA-Faarfstoffer virzezéien. Kontrolléiert d'Resultat mat Katalase an test d'Ofhängegkeet vun der Beliichtung, well de Faarfstoff e Fotosensibilisator ass. D'Gehirmitochondriestudie huet festgestallt, datt d'Peroxidbelaaschtung scho bei nëmmen 100 nM Faarfstoff op méi wéi dat Véierfacht geklommen ass, wärend d'Eliminatioun méi lues gouf. Dobäi ass Peroxid direkt duerch de reduzéierte Faarfstoff entstanen, ouni Superoxid als Zwëscheprodukt. Detailer iwwer d'Auswiel vun der Sond an d'Liichtkontrolle fannt Dir am begleedenden Artikel iwwer d'Moosse vu reaktive Sauerstoffspezies bei Faarfstoffexperimenter. Déi méi allgemeng Fro, wéini Peroxid als Signal a wéini als Belaaschtung wierkt, gëtt am Zesummenhang mam zelluläre Redox-Gläichgewiicht an Aussoen iwwer Antioxidantien behandelt.

Fir Aussoen iwwer Reaktiounsweeër test béid Ugrëffspunkte vun de Komplex-III-Inhibitoren: Antimycin A um Qi-Site a Myxothiazol um Qo-Site, zousätzlech zu engem Komplex-IV-Endpunkt mat Cyanid. Eng fréier Studie um Mausgehir huet eng Restauratioun vun der duerch Rotenon blockéierter, awer net vun der duerch Antimycin blockéierter Atmung duerch de Faarfstoff gemellt. Déi spéider Studie mat dräi Aarten huet dogéint eng deelweis Restauratioun mat béiden Inhibitoren an Hiweiser op eng direkt Reduktioun vu Cytochrom c fonnt. Betruecht d'Ëmgoe vun der Ketten als kompatibel mat den neien Donnéeën, net als definitiv gekläert, well d'Faarfstoffkonzentratioun, den Ugrëffspunkt vum Inhibitor, de Substratzoustand an d'Verdeelung vum Faarfstoff all den observéierte Wee veränneren.

Matrix fir d'Auswiel vum Assay

Benotzt dës Tabell, fir d'Miessung no der Fro auszewielen, net ëmgedréint.

Fir eng minimal iwwerzeegend Ausso mussen déi selwecht Faarfstoffkonzentratiounen, 100 nM, 300 nM, 1 uM an 2 uM, fir all dës Miessunge benotzt ginn: Sauerstofffloss ënner Leck-, ADP-, Oligomycin- an Entkopplerbedéngungen, ATP-Synthesvitess, Membranpotenzial am beschte mat zwou Sonden a kalibréiert Peroxidfräisetzung mat Katalase an zellfräie Kontrollen. Rapportéiert déi zesummenhängend Serie: Sauerstofffloss plus ATP-Vitess plus ATP pro Sauerstoff plus Potenzial plus Peroxid. All eenzel vun dësen Zuelen ass eleng eng Miessung, déi nach no enger Bedeitung sicht.